Terjemahan Jurnal Full

download Terjemahan Jurnal Full

of 22

  • date post

    05-Nov-2015
  • Category

    Documents

  • view

    224
  • download

    0

Embed Size (px)

description

dari jurnal Deferensiasi Mikroorganisme Berdasarkan Tipe Gram dengan Ekstrak Bakteri Asam Lemak

Transcript of Terjemahan Jurnal Full

Diferensiasi Mikroorganisme Tipe Gram Berdasarkan Pirolisis Spektrometri Massa pada Ekstrak Bakteri Fatty Acid Methyl Ester (FAME)

AbstrakSpektrometri massa Pirolisis titik Curie (Py) telah digunakan untuk membedakan 19 mikroorganisme tipe Gram berdasarkan distribusi asam lemak metil ester mereka. Spektrum massa mikroorganisme Gram-negatif ditandai oleh adanya asam palmitoleat (C16:1) dan asam oleat (C18:1), dan juga kelimpahan tinggi dari asam palmitat (C16:0) dibanding asam pentadecanoat (C15:0). Untuk mikroorganisme Gram positif, adanya cabang C15:0 (isoC15:0 dan / atau anteisoC15:0) lebih intens dibandingkan dengan asam palmitat yang diamati pada spektrum massa. Analisis komponen utama pada data spektral massa tersebut memisahkan mikroorganisme yang diteliti dalam penelitian ini menjadi tiga kelompok/kluster diskrit yang berhubungan dengan reaksi Gram dan kepatogenikan mereka. Analisis tandem spektrometri massa lebih lanjut menunjukkan bahwa sifat dasar isomer asam lemak C15:0 (bercabang atau normal) yang terdapat dalam spektrum massa masing-masing mikroorganisme penting untuk mencapai klasifikasi menjadi tiga kelompok.

I. PENDAHULUANAplikasi instrumentasi berbasis teknik dalam mikrobiologi untuk melakukan prosedur konvensional untuk identifikasi dan diferensiasi mikroorganisme telah meningkat selama satu dekade terakhir Kromatografi gas (GC) (12, 24), spektrometri massa pemboman atom cepat (MS) (17), pirolisis titik Curie (Py) -MS (8), Py-GC MS (31), spektroskopi inframerah Fourier transform (27), spektroskopi UV resonansi Raman (7), aliran sitometri (10), dan laser berbasis pembuatan profil enzim (3, 20), semuanya telah digunakan untuk membedakan mikroorganisme. Teknik ini mengaplikasikan metode analisis yang ditetapkan untuk mengukur properti biokimia yang berbeda dan / atau distribusi bahan kimia dari taksonomi yang signifikan. Py-MS telah digunakan secara luas untuk identifikasi dan diferensiasi cepat pada bakteri secara keseluruhan. Selain itu, Py-MS telah mengidentifikasi kandungan kimia yang berguna pada bakteri atau para biomarker untuk diferensiasi dan identifikasi mikroorganisme dengan adanya latar belakang suatu lingkungan (34) .Korelasi antara komposisi bakteri lipid dan klasifikasi taksonomi telah banyak digunakan untuk identifikasi bakteri. Klasifikasi bakteri berdasarkan profil asam lemak telah dibandingkan dengan baik dengan klasifikasi berdasarkan homologi asam nukleat (5). Perbaikan dalam metodologi analisis lipid telah memperluas korelasi ini untuk banyak bakteri. GC dari ekstrak lipid umumnya digunakan untuk menentukan asam lemak seluler dalam mikroorganisme (24, 25). Metode komersial ini (22) didasarkan pada hidrolisis dan ekstraksi bakteri lipid, metilasi kelompok karboksilat untuk menghasilkan asam lemak metil ester (FAME), dan analisis GC berikutnya (25). Waktu keseluruhan persiapan sampel adalah sekitar 60 sampai 70 menit. Analisis kromatografi ekstrak FAME membutuhkan waktu sekitar 20 menit per sampel, jadi waktu total pengujian ini sekitar 1,5 jam per sampel. Selain itu, campuran FAME standar yang dibutuhkan sebelum dan pada interval-interval selama analisis bersama dengan sampel, meningkatkan total waktu analisis. Keberhasilan prosedur dalam mengidentifikasi komponen asam lemak individu bergantung pada pemilihan yang tepat dari campuran FAME standar ini.Dalam Py-MS, sampel dipanaskan dengan cepat dan menguap dalam kondisi vakum, kemudian molekul fase gas terionisasi dan analisis massa dilakukan. Sebuah histogram dari intensitas sinyal versus rasio massa terhadap muatan (m/z) mewakili spektrum massa senyawa atau campuran senyawa. Ketika Py-MS dilakukan pada mikroorganisme, spektrum massa yang dihasilkan adalah profil atau karakteristik bahan kimia dari sampel. Persiapan sampel dan pengumpulan data (tidak termasuk persiapan ekstrak FAME) termasuk cepat, yaitu memerlukan sekitar 5 menit per sampel. Instrumen dikalibrasi satu kali setiap mengawali hari dengan senyawa standar Mengganti analisis kromatografi pada ekstrak FAME dengan Py-MS menyediakan alat tes yang lebih cepat untuk identifikasi dan diferensiasi bakteri, dengan persiapan ekstrak FAME sebagai langkah pembatas. Teknik pewarnaan yang sederhana dapat menghasilkan informasi tipe Gram; Namun, secara otomatis, teknik berbasis instrumentasi untuk melakukan analisis bakteri in situ di lingkungan yang tidak bersahabat harus dikembangkan.. Menuju tujuan ini, penggunaan Py sebagai pengolahan sampel dan persiapan langkah yang cepat telah terbukti sangat sukses (6, 18, 31). Sebelum mengganti ekstraksi dan pemisahan langkah yang memakan waktu dengan Py-MS, kelayakan Py-MS dalam memberikan informasi yang berguna untuk diferensiasi dan identifikasi mikroorganisme dengan cara yang sebanding dengan pendekatan GC-FAME harus dibuktikan. Py-MS (instrumen quadrupole tunggal) membedakan senyawa berdasarkan massa untuk mengisi rasio mereka, dan karenanya, diferensiasi isomer tidak selalu memungkinkan dengan campuran yang mengandung iso-anteiso, cis-trans jenuh dan isomer posisi jenuh. Oleh karena itu, isi informasi dalam spektrum massa ekstrak FAME akan selalu lebih rendah dari itu pada ekstrak FAME kromatogram gas (ketika hanya wilayah ion molekul para FAME dianggap). Semakin rendah kandungan informasi dari spektrum massa, namun tidak berarti bahwa jumlah minimal informasi yang diperlukan untuk diferensiasi dan identifikasi mikroorganisme yang sukses pada tingkat spesies tidak hadir.Dalam studi ini, Py-MS titik Curie dari ekstrak FAME bakteri dan pengenalan pola telah digunakan untuk membedakan antara mikroorganisme gram positif dan gram negatif. Diferensiasi ini didasarkan pada distribusi asam lemak. Dengan bantuan pengenalan pola (analisis komponen utama [PCA]), perbedaan tersebut, yang dikaitkan dengan keberadaan ion fragmen asam palmitoleat, asam oleat, 3-hidroksi-asam miristat, dan asam lemak pentadekanoat bercabang dan intensitas sinyal yang lebih besar dari asam palmitat dibandingkan dengan asam pentadekanoat dalam mikroorganisme gram negatif, dipelajari. Keberadaan ion ini dikonfirmasi baik oleh Py-tandem MS (Py-MS / MS) maupun dengan cara dibandingkan dengan spektrum massa senyawa standar.

II. BAHAN DAN METODE

A. InstrumentasiPengukuran dilakukan dengan spektrometer massa Extrel triple-quadrupole (ELQ-400) dilengkapi dengan inlet titik Curie Py. Penjelasan yang lebih rinci tentang instrumen telah diterbitkan di sumber lain (8). Py bekerja pada suhu 510oC selama 10 s. Semua spektrum diperoleh dengan menggunakan ionisasi elektron 70-eV dan pemindaian massa yang berkisar antara 180 sampai 350 unit massa atom. Kisaran massa ini dipilih untuk mencocokkan kisaran FAMEs yang dideteksi oleh analisis GC-FAME. Py-MS/MS (8) bekerja dengan argon pada tekanan 0,01 millitorr (1 torr =1 mm Hg) dalam tubrukan sel (quadrupole 2).

B. Bahan KimiaSemua standar rantai lurus jenuh, tak jenuh, dan hidroksi asam lemak (Aldrich) dan asam lemak bercabang iso dan anteiso (Ultra Ilmiah) digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Semua asam lemak standar dilarutkan dalam segelas methanol sulingan (10 mg/ml). Lipid A yang termonofosforilasi dari Escherichia coli F583 Rd-mutan (Fluka Chemika) juga dilarutkan dalam segelas methanol sulingan sebelum analisis. 10 mikroliter alikuot dari setiap larutan dimuat ke kawat Py dan udara dikeringkan pada suhu kamar untuk membentuk lapisan yang seragam. Metilasi in situ pada asam lemak standar (18) dilakukan dengan menambahkan 10 mikroliter 0,1 M trimetilfenilamonium hidroksida dalam metanol (Fluka Chemika) pada kondisi kering dan asam lemak berlapis kawat yang memungkinkan untuk udara kering.C. Sampel BiologisMikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini dipilih secara acak dan tercantum dalam Tabel 1. Semua mikroorganisme ditumbuhkan pada medium agar kedelai tryptic pada suhu 37oC selama 18 jam. Sel diisolasi dengan cara dicuci dengan air suling, kemudian asam lemak terekstraksi dan termetilasi seperti yang dijelaskan oleh Miller (23). Sampel FAME dilarutkan kembali dalam 1: 1 eter-heksana seperti yang diperlukan untuk penguapan pelarut. 10 mikroliter alikuot larutan ini diaplikasikan pada titik Curie kawat dengan udara yang dikeringkan pada suhu kamar. Massa total FAMEs yang diendapkan pada kawat diperkirakan berada pada kisaran mikrogram rendah.

D. Pengenalan PolaPCA dilakukan menggunakan paket software RESOLVE yang dikembangkan di Colorado School of Mines (14, 15). Setiap spektrum massa dikumpulkan sebagai satu set intensitas baku/kasar. Data dinormalisasi menjadi intensitas total dan rata-rata terpusat. Skor dan pemuatan plot, keduanya dihasilkan. Muatan atau koefisien vektor eigen menunjukkan besarnya kontribusi variabel (dalam hal ini puncak spektrum massa) dengan komposisi dalam memproyeksikan nilai (29).

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Spektrum massa FAME pada gram negatif dan gram positif bakteri. Spektrum ekstrak FAME dari tiga mikroorganisme gram negatif berikut ditunjukkan pada Gambar. 1: Pseudomonas fluorescens, Proteus mirabilis, dan Enterobacter aerogenes. Spektrum massa ini mengandung pola molekul ion FAME rantai lurus yang divariasi oleh salah satu karbon, dari C14:0 metil ester (C14:0 ME) sampai C21:0 ME, dengan sinyal ME palmitat (C16:0 ME; M+. m/z 270) menjadi yang paling intens. Seiring dengan ion molekul, ion fragmen yang disebabkan oleh fragmentasi dari elektron terionisasi hadir Proses ini meliputi pembelahan homolitik pada ikatan metoksi dari C16:0 ME, sehingga menimbulkan ion fragmen M-31 pada m/z 239, dan seri karbometoksi pada m/z 185, 199, 213, 227, dll, dengan rumus umum CH3OCO(CH2)n+ (26). Dalam spektrum massa yang ditunjukkan pada Gambar. 1, puncak tambahan yang timbul dari FAME tak jenuh diamati. Sebagai contoh, pada spektrum massa P. fluorescens, beberapa puncak lainnya sesuai dengan ion molekul FAME monounsaturated (panjang rantai genap dan ganjil) dan ion fragmennya diidentifikasi dengan cara membadingkannya dengan spekt