Diagnstico por Mtodos Inmunolgicos

Diagnstico por Mtodos InmunolgicosTcnicas inmunolgicasTcnicas serolgicasPrincipios de Diagnstico InmunolgicoLas enfermedades infecciosas pueden ser diagnosticadas definitivamente solo por tres formas:

1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente conocido capaz de provocar la enfermedad, por observacin directa en el material clnico obtenido del paciente o por cultivo de laboratorio (in vivo o in vitro)

2) Deteccin de un producto especfico del agente infeccioso (que no pueda formarse sin la presencia del agente) en el material clnico obtenido del paciente

3) Deteccin en el suero del paciente de una respuesta inmunolgica especfica dirigida contra el Agente infecciosos

2Caractersticas generales de la respuesta inmuneCategoras de la respuesta inmuneRespuesta inmune mediada por clulaso Inmunidad CelularRespuesta inmune mediada por anticuerpos o Inmunidad humoralPara determinar si se ha producido un anticuerpo contra un agente en particular, se investiga en el suero (o plasma) del paciente la presencia de anticuerposEl diagnstico de las enfermedades por la medicin de los niveles de anticuerpo en suero se denomina serologa

Caractersticas generales de la respuesta inmuneCaractersticas de los AnticuerposMecanismo determinado genticamenteDirigidos contra un antgeno o determinante antignico (eptope)Los microorganismos pueden contener numerosos determinantes antignicos Habr por lo tanto numerosos anticuerpos para cada antgenoMuchos determinante antignicos requieren ser expuestos

Caractersticas generales de la respuesta inmuneCaractersticas de los AnticuerposLos anticuerpos se unen a la superficie de los patgenos para:Facilitar su ingestin por las clulas fagocticas (Anticuerpos opsonizantes u opsoninas)

Caractersticas generales de la respuesta inmuneContribuir a su destruccin por la accin ltica del complemento (Anticuerpos fijadores de complemento)

Caractersticas generales de la respuesta inmuneCaractersticas de los AnticuerposAunque el ser humano produce varias clases de anticuerpos los mtodos serolgicos han sido desarrollados para medir principalmente dos clases:Inmunoglobulina M (IgM)Inmunoglobulina G (IgG)Solo en un caso se han desarrollado mtodos para detectar la Inmunoglobulina A (IgA): Toxoplasmosis

Caractersticas generales de la respuesta inmuneCaractersticas de los AnticuerposIgGSe producen mas tardamente pero persisten mas tiempo.Dos imgenes especulares, formadas por dos protenas, con los sitios de fijacin para el antgeno en el extremo.Unin mas espedfica al antgeno (avidez)

Caractersticas generales de la respuesta inmuneCaractersticas de los AnticuerposIgMEs el primer anticuerpo producido en respuesta a un antgeno (infeccin reciente)Cinco protenas idnticas unidas por la cadena JUnin al antgeno menos avida.No fija complemento

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Caractersticas generales de la respuesta inmuneRespuesta humoral relativa frente a un estmulo antignico

Caractersticas generales de la respuesta inmuneInterpretacin de las pruebas serolgicasEl dogma central de la serologa es el concepto de aumento de ttuloTtulo de un anticuerpo es la recproca de la mayor dilucin de suero del paciente en la cual an se puede detectar el anticuerpoPacientes con gran cantidad de anticuerpostendrn ttulos altosDos muestras de suero: perodo agudo y convalecencia. Se procesan pareados.Un aumento de ttulo de dos diluciones al medio (1:8 a 1:32) se considera diagnstico de infeccin reciente (aumento de cuatro veces el ttulo)En la actualidad se cuentan con metodologas que permiten manejar valores mas continuos, en ocasiones hasta en forma cuantitativa

Principios de los Mtodos SerolgicosLa reaccin entre un antgeno y un anticuerpo dirigido especficamente contra l da lugar a un complejo antgeno anticuerpoUtilizada ampliamente en los laboratorios para la deteccin y cuantificacin de gran cantidad de sustancias en diversos medios biolgicos. Reaccin Antgeno-Anticuerpo

Reacciones de AglutinacinCuando el antgeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo, el complejo antgeno-anticuerpo resultante se observa como una aglutinacin

El proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin por formacin de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los antgenos

Los anticuerpos IgM son mas eficaces para aglutinar (Anticuerpos completos). Los anticuerpos IgG a veces producen entrecruzamientos (Anticuerpos incompletos)

Se expresan como aumento de ttulo

Dan fenmeno de prozona (aglutinacin aparente por exceso de antgeno o anticuerpo sin aglutinacin

Reacciones de AglutinacinFactores que influyen en las reacciones de aglutinacinCarga de las partculasTipo de anticuerpoConcentracin de electrolitosViscosidadNmero de determinantes antignicos

Se emplean tanto para la deteccin de antgenos como de anticuerpos.

Se pueden hacer de dos maneras: directas o indirectasReacciones de Aglutinacin DirectaPara deteccin de antgenos

Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos

Distintos tipos de tcnicas segn la naturaleza fsica de soporte

Aglutinacin al ltex: partculas de ltex fcilmente visiblesDeteccin en LCR de antgenos de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae

Hemaglutinacin pasiva: hemates como soporte

Coaglutinacin: bacterias muertas como soporte; Staphylococcus aureus expresa la Protena A capaz de fijar el Fc de los anticuerpos.16Reacciones de Aglutinacin DirectaPara deteccin de anticuerposSe pueden hacer en tubo, portaobjetos, placa o pocillo de microplaca.

Se enfrentan las partculas microbianas (generalmente muertas) en suspensincon el suero del paciente.

Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la microplaca.

Deteccin de anticuerpos frente a Brucella (Reaccin de Huddleson) o Salmonella (Reaccin de Widal.

Reacciones de Aglutinacin IndirectaPara deteccin de anticuerpos

Se adsorben los antgenos en un elemento partculado (partculas de ltex, gelatina o bentonita, o clulas como hemates humanos, ovinos o de pavo.

Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al suero del paciente.

Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de microplaca.

Deteccin de Treponema pallidum, Echinococcus granulosus.Pruebas de AntiglobulinaSe puede utilizar el microorganismo entero o adsorbido a un soporte particulado.

Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al suero del paciente.

Se incuba la muestra con una anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (anti-gamma)

Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de microplaca.

til para detectar anticuerpos incompletos, en especial en Brucelosis.

Reacciones de InhibicinBasadas en la incapacidad de algunos microorganismos para realizar determinadas actividades biolgicas en presencia de anticuerpos especficos. Las mas utilizadas son dos:

- Inhibicin de la Hemaglutinacin

Algunos virus (Rubeola, Influeza, Parainfluenza, Parotiditis, Adenovirus) se unen a receptores de la superficie de los hemates provocando su aglutinacin.

Esta aglutinacin puede ser inhibida por la presencia de anticuerpos especficos en el suero del paciente.

- Neutralizacin

Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citoptico habitual en clulas de cultivo celular cuando hay presentes anticuerpos especficos.Pruebas de Fijacin de ComplementoSe incuba suero del paciente con el antgeno. En presencia de anticuerpos en el suero se forman complejos antgeno-anticuerpo.

Se aade una cantidad de complemento (todos los elementos).

Si inicialmente se haban formado inmunocomplejos se produce la activacin del complemento , consumiendo todos los componentes del sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el sistema permanece.

Se agrega un sistema revelador constituido por hemates unidos a anticuerpos antihemates (hemolisina).

Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra) se fija a los complejos hemate-hemolisina y los eritrocitos de lisan.

Se utiliza en laboratorios de referencia para diagnsticos de virus respiratorios.Reacciones de PrecipitacinFormacin de estructuras insolubles por unin ente el antgeno soluble y el anticuerpo especfico incapaces de permanecer en solucin.

El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante tcnicas de nefelometra o inmunoturbidimetra, que pueden a su vez ser adaptadas a autoanalizadores de qumica clnica o instrumentos especializados (nefelmetros o inmunoturbidmetros).

Se pueden usar para determinar protenas reactantes de fase aguda como PCR o demostrar infecciones previas por Streptococcus pyogenes por AELO (neutralizacin ltica de estreptolisina O)

Tambin pueden ser observados por tincin en placas de agarosa.

Inmunodifusin dobleTcnica de Outcherlony

Se enfrentan concentraciones conocidas de antgeno soluble con un antisuero problema en un medio gelificado.

Tras un perodo en el que se permite difundir a ambos elementos puede observarse en el caso de que existan anticuerpos, bandas de precipitacin que pueden ser identificadas a simple vista o mediante tincin proteica

Se emplea en la prctica en la deteccin de anticuerpos frente a diversos hongos productores de neumonitis por hipersensibilidad.

Inmunodifusin RadialTcnica de Mancini

Se disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos diluciones del antgeno.

Si se corre simultneamente una curva patrn puede cuantificarse por regresin la cantidad de antgeno.

Es mas til para para la deteccin de antgenos que de anticuerpos

ContrainmunoelectroforesisPuede ser utilizada tanto para detectar antgenos como anticuerpos

Combina la electroforesis (migracin de antgenos y anticuerpos en un gel de agarosa por accin de un campo elctrico) con la precipitacin (formacin de lneas de precipitado en un gel de agarosa cuando se produce la reaccin antgeno-anticuerpo).

El antgeno de carga negativa en medio alcalino migra hacia el anodo, es decir hacia los pocillos del anticuerpo. Los anticuerposen estas mismas condiciones migran al polo negativo o ctodo.

Se emplea en la identificacin del Arco 5 de Echinococcus granulosus.

Pruebas con Anticuerpos FluorescentesSe utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes (fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja de acridina.

Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando con un microscopio de fluorescencia.

Dos variantes:

Tcnica directa (para deteccin de antgenos): se fija la muestra en un portaobjetos con acetona, se agrega el anticuerpo marcado con el florocromo (inmunofluerescencia directa IFD). Deteccin de Pneumocystis carinii en esputo inducido

Tcnica indirecta (para deteccin de anticuerpos): se agrega primero el suero del paciente sobre antgeno improntado en portaobjetos; en la segunda fase se incuba con anticuerpo anti humano marcada con fluorocromo (inmunofluorescencia Indirecta IFI).

Inmunohistoqumica enzimticaSe usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos marcados con enzimas.

Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de color.

Usado para detectar antgeno, en ocasiones post mortem, por ejemplo pacientes infectados con Rabia

InmunoensayosPara detectar antgenos Metodologa ELISA

Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo, portaobjetos, esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc.

Se aade la muestra problema con antgeno

Se lava para eliminar otras protenas unidas en la muestra

Se agrega un segundo anticuerpo contra el antgeno, unido a un marcador enzimtico (una enzima como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rbano picante) .

Se agrega el sustrato de la enzima, que dar un color si haba antgeno unido

Diagnstico de Chlamydia trachomatis en muestras de cuello uterino

InmunoensayosPara detectar anticuerpos Metodologa ELISA

Utilizan antgenos unidos a un elemento slido (esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al que se le aade suero del paciente.

Si el suero tiene anticuerpos especficos se unen a os antgenos.

La reaccin se revela mediante un segundo anticuerpo conjugado con:

Enzima Enzimoinmunoensayo (EIA)Istopo radioactivo (I125)Radioinmunoensayo (RIA)Sustancia fluorescenteFluoroinmunoanlisis (FIA)

Se lee la seal con un espectrofotmetro (EIA), contador de centelleo (RIA) o un fluormetro (FIA)

InmunotransferenciasInmunobloting o Western Blot

Separacin de antgeno proteico por electroforesis en gel de poliacrilamida

Transferencia del antgeno separado a una membrana de nitrocelulosa

Se incuba la membrana con el suero del paciente y se detectan los anticuerpos mediante una anti-inmunoglobulina humana conjugada con una enzima.

Se forman bandas coloreadas donde se ha producido la reaccin antgeno anticuerpo.

Se puede usar tanto para detectar antigenos como anticuerpos.

Se emplea para confirmar resultados positivos de pruebas de tamizaje por EIA de anticuerpos frente al virus del SIDA