Métodos diagnóstico en inmunología 2010
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Serología - Inmunidad Celular
INMUNODIAGNOSTICO
Sustrato
Producto
AP
AP
Prof. Rosanna Citti de PetriconeCátedra de Microbiología e
InmunologíaFCV-UCV
Pruebas Inmunológicas queanalizan la reacción Ag-Ac
• La respuesta inmunitaria de los animales se puede emplear de dos maneras en un laboratorio de diagnóstico– Para identificar un antígeno
– Para detectar anticuerpos en el suero
Aplicaciónes Diagnósticas de las Pruebas Inmunológicas
• SEROLOGIASEROLOGIA– Medición de las interacciones Ag-Ac con fines
diagnósticos
• Principales reactivos empleados en las Pruebas Serológicas– Suero sanguíneo (fuente de Ac´s o Ig)
– Suero fresco de cobayo (fuente de C´)
– Antiglobulinas (anti-anticuerpos)
– Anticuerpos monoclonales
Reactivos Empleados en las Pruebas Serológicas
• Suero
Alicuotar el suero,
identificar y guardar
a -20ºC
Incubar sangre
37ºC x 2 h
Transporte Separarcoagulo
de paredes
4ºC toda la noche
2.000 r.p.m.Durante 15´(OPCIONAL)
• Plasma
Recolección sin anticoagulante
Alicuotar el plasma,identificar y guardar
a -20ºC
Transporte
2.000 r.p.m.Durante 15´
(OBLIGATORIO)
Recolección con anticoagulante
SepararSobrenadantedel sedimento
Reactivos Empleados en las Pruebas Serológicas
• Suero
Recolección sinanticoagulante
• Antiglobulinas
Alicuotar el suero,
identificar y guardar
a -20ºC
Separarcoagulo
de paredes
2.000 r.p.m.Durante 15´
Incubar sangre
37ºC x 2 h
Transporte 4ºC toda la noche
Recolección sinanticoagulante
IgG Bovina Inmunización Antiglobulinas
IgG + Antiglobulinas
• Anticuerpos monoclonalesCélulas esplénicas
(Plasmocitos)Células de mieloma
Células de mielomade ratón en cultivo
Ratón inmunizado con el antígeno
Ensayo de producción de anticuerpos
Identificación de clonas positivas
Reclonación de los híbridos positivos
Fusión con Polietilenglicol
Selección de los híbridosen el medio HAT
Hipoxantina, Aminopterina, Timidina
Clonación
Propagación de clonas seleccionadas
Anticuerposmonoclonales
Congelamiento de células para almacenarlas-196 ºC
Clasificación de las Pruebas Serológicas
• Pruebas de Unión Primaria• Pruebas de Unión Secundaria• Pruebas Terciarias o en sistemas
vivos
Clasificación de las Pruebas Serológicas
Unión Primaria: Miden captación del Ag por el Ac
Unión Secundaria: Miden los resultados unión Ag-Ac in vitro
Unión Terciaria: Miden el efecto protector de los Ac en un aminal.
Pruebas de Unión Primaria
• Los Principales grupos de pruebas de unión primaria son:
1. Radioinmunoanálisis2. Pruebas de Inmunofluorescencia3. Pruebas Inmunoenzimáticas
Pruebas de Unión Primaria1) Radioinmunoanálisis (RIA)
– Técnica desarrollada en 1960 (Berson & Yallow)
– Capacidad de las proteínas de acoplarse a radioisótopos: 125I, 3H, 32P, 14C
– Ampliamente utilizado para medir niveles de un antígeno determinado. Ej. Fármacos, hormonas en sangre y orina Aplicación clínica: Test radioalergoabsorbente (RAST) para medir concentraciones de IgE en pacientes alérgicos
Radioinmunoanálisis Radioinmunoanálisis para detectar Ac (No comp.)
– RAST – Prueba radioalergoabsorbente (Ig E) Sumerge en suero problema (x) discos de celulosa impregnados de Ag y después de lavados, se vuelven a sumergir en
antiglobulina radiomarcada, se mide la radioactividad del disco y es posible medir la r.a de Ac presentes en el suero
Antígeno Lavado Lavado LavadoSuero XAntiglobulinaradiomarcada
RadioinmunoanálisisRadioinmunoanálisis para detectar (Ag) (competitivo)
El Ag no marcado desplazará al Ag radiomarcado de los complejos inmunitarios. Muy sensible. Detecta cantidadesdiminutas de fármacos (Morfina en orina) hasta 108 y 1010 M
Suero problema
Ag marcado Ac
Ag marcado
Ag No marcado
Ac
Proteína precipitada
Sobrenadante no radioactivo
Proteína precipitada Proteína precipitada
Sobrenadante radioactivo
125I 14C3H
Pruebas de Unión Primaria
2) Pruebas de Inmunofluorescencia
– Reacción Ag-Ac se hace visible por incorporación de colorante fluorescente
Isotiocionato de Fluoresceina-FITCRodamina
– Se acoplan fácilmente a moléculas proteícas– Observación Microscopio de Fluorescencia
FLUOROCROMOSFLUOROCROMOSFLUOROCROMOSFLUOROCROMOS
Inmunofluorescencia
Pruebas de Inmunofluorescencia directa– Prueba directa de Ac Fluorescentes
Detecta la presencia de antígenos cuando el nº es pequeñoSe emplean frotis de líquidos corporales y cultivos de
tejidos que contienen el Ag. (Virus rábico, virus de leucemia felina), Clostridium, L. monocytogenes etc.)
Antígeno ? Anticuerpos fluorescentes
Lavado
Inmunofluorescencia
Pruebas de Inmunofluorescencia indirecta– Prueba indirecta de Ac Fluorescentes
Detección de anticuerpos en suero o de antígenos en tejidos o cultivos celulares
Antígenoconocido
Suero problema
Lavado
Antiglobulinas Fluorescentes o marcadasLavado Ac + Ag
Inmunofluorescencia
• Citometría de Flujo
Marcar una suspensión celular con un Ac monoclonal fluorescente
dirigido contra un Ag específico de superficie celular (CD)
Técnica de Ac Fluorescentesutilizada para detectar Ag.
(Proteínas) en superficie celular (Fenotipos)
Ej. Poblaciones de Linfocitos
Principios
CITOMETRÍA DE FLUJO
Principios del funcionamiento del Citómetro de Flujo
CITOMETRÍA DE FLUJO
• Patrón que se observa en un citómetro de flujoEmpleando Ac con diferentes marcadores fluorescentes puede analizarse de manera simultánea la expresión de diversos Ag. de superficie (CD)
Pruebas de Unión Primaria
3) Pruebas InmunoenzimáticasDetecta y cuantifica Ag (Ag en solución) como AcUtiliza enzimas que se acoplan a Ac específicos u otras proteínas– Reacción enzima-sustrato (covalente)
Reacción colorimétrica (sustrato incoloro sustrato color)
– Intensidad de color Directamente proporcional a la cantidad de
complejos Ag-Ac formados– Aplicaciones clínicas:
Diagnóstico enfermedades bacterianas, virales y prasitarias
PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS
• Marcadores enzimáticos empleados – Se han empleado 20 enzimas diferentes
– Las más populares: Fosfatasa alcalina
Peroxidasa de rábano picante
Beta galactosidasa
– No costosas y fáciles
– Producción de productos luminiscentes o fluorescentes:
Ej. Luciferasa
Pruebas de Unión Primaria
Pruebas Inmunoenzimáticasa)Ensayos Inmunoabsorbentes ligados a enzima
(ELISA) 1) Prueba indirecta de Elisa
2) Elisa en sandwich
3) Elisa con Ag marcado
b)Técnicas de Inmunoperoxidasa
c) Inmunoelectrotransferencia (Western blotting)
d) Inmunoanálisis de AVIDINA-BIOTINA
1) ELISA INDIRECTO
Pruebas Inmunoenzimáticas
(ELISA Indirecto) Detecta Ac.
– Intensidad del color
Simple vista ó
espectrofotometría
1) ELISA INDIRECTO
ELISA indirecto (Detecta Ac)
Antígeno Antígeno+
Suero problema
Antígeno+
Suero problema+
Antiglobulina +enzima
Antígeno+
Suero problema+
Antiglobulina-enzima
+sustrato
2) ELISA SANDWICH
Pruebas Inmunoenzimáticas– (ELISA sandwich)
Se detecta ó
cuantifican Ag
Ej. detectar en
sangre el virus
de la Leucemia
felina
Ac de captura
Ac. específico
3) ELISA ANTIGENO MARCADO
Pruebas Inmunoenzimáticas– (ELISA Ag marcado)
– Detecta Ac
– La más comercial
– Funciona en sangre
entera
b)TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA
Pruebas Inmunoenzimáticas– Se observa con M. optico
– Emplea enzimas conjugadas
a Ig o antiglobulina para
detección de Ag en tejidos
Marcadores:
Peroxidasa de rábano picante
Fosfatasa Alcalina
β-galactosidasa B
Ej. Pénfigo folíaceus (perro)
c)WESTERN BLOTTING3) Pruebas Inmunoenzimáticas (Transferencia Proteínas)
– Inmunoelectrotransferencia (Western blotting)
Detecta Ag mezclado con otros Ags. (Posición diferentes Proteinas, dependerá del tamaño molecular)
1º Etapa: Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS)
d) INMUNOANÁLISIS AVIDINA-BIOTINA
• 3) Pruebas Inmunoenzimáticas – Biotina: mol. peqeña
se une a proteína Avidina
Avidina: proteína pequeña
presente en la clara huevo
que se une con fuerza a la
Biotina, y se conjuga
con la peroxidasa de
rabano
Desventajas de la Pruebas enzimáticas
• Radioisotopos tienen vida media corta
• Son peligrosos (radioactivos)
• Necesitan dispositivos medición caros
• Las Enzimas son estábles y baratas
• Pierden actividad enzimática al conjugarlos con antiglobulinas
• Inhiben la actividad de los Ac.
Por quedarse dormido en clase… se fue de cabeza
ACCIDENTE TRAGICO
Pruebas de Unión Secundaria• Miden los resultados de la unión Ag-Ac in vitro• La reacción antígeno-anticuerpo por lo general va seguida de una
segunda reacción• Pruebas de dos etapas:
1º Etapa Interacción Ag-Ac (uniones covalentes)2º Etapa Determinada por el estado físico del Ag
a) Ag. Soluble PRECIPITACIÓN
b) Ag. Párticulas (bacterias, eritrocitos) AGLUTINACIÓN
3º Etapa Ac activa la vía clásica del Complemento Ag. Se encuentra sobre superficie celular LISIS CELULAR
Pruebas de Unión Secundaria
• La reacción Ag-Ac por lo general va seguida de una segunda reacción determinada por el estado físico del antígeno
Pruebas de Unión Secundaria1) Precipitación
– Inmunodifusión– Inmunoelectroforesis y técnicas afines
2) Aglutinación– Pruebas de antiglobulina– Aglutinación pasiva
3) Hemaglutinación viral (HA) y su inhibición de la HA (HI)
4) Pruebas de Fijación del Complemento– Pruebas de citotoxicidad
PRECIPITACIÓN
• Curva de Precipitación cuantitativa
Ag soluble + Antisuero
Mezcla (flocula)
• Mecanismo de PrecipitaciónAg soluble + cantidad constante Ac
INMUNODIFUSION
Inmunodifusión ó difusión en gel
Inmunodifusión Radial
Inmunodifusión Doble
Ag A Ag A
Ac Anti A
Pruebas de Unión Secundaria
• Precipitación: Inmunodifusión– Inmunodifusión doble
IMPORTANTE EN VETERINARIA:•Detectar Ac en suero contra el virus de la Anemia Infecciosa Equina (Tests de Coggin)
•Detectar animales infectados con el virus de la Leucemia bovina
INMUNOELECTROFORESIS
• Precipitación: Inmunoelectroforesis(Identifica proteinas de liquidos
corporales)
Pruebas de Unión Secundaria
• AGLUTINACIÓN• Ac (bivalentes) establecen enlaces cruzados con Ags particulados (bacterias o eritrocitos) extraños, haciendo que se aglutinen• Más sensible que la Precipitación Ig G Ig M Ig AAglutinación + +++ +Precipitación +++ + +/-Neutralización + + +
Ag particulado
Amontonamiento de Ag (Aglutinación)
INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN
HEMAGLUTINACIÓN (HA) PASIVA•Detecta Ac frente a Ag de eritrocitos y frente a Ag que no se encuentran en la superficie de los eritrocitos (eritrocitos sensibilizados)
• Caracteriza virus desconocidos
INHIBICIÓN DE LA HA• Mide conc. de Ac en suero contra un virus• Identifica un virus específico• Virus muy hemoaglutinantes: (Ortomyxovirus, Paramyxovirus, Alfavirus, Flavivirus, Bunyavirus
Pruebas Terciarias- Pruebas en sistemas vivos
• Pruebas de NEUTRALIZACIÓN Capacidad del Ac de anular la actividad biológica del Ag
cuando se mezcla con él in vitro. Altamente sensibles y específicas
Identificar toxinas bacterianas (Toxina α del C. perfringes) Identificar partículas virales desconocidas o títulos de Ac
antivirales específicos
• Pruebas de PROTECCIÓN– Análisis de neutralización que se realiza totalmente in vivo
Mide las eficacia terapéutica de un antisuero específico Administrar diluciones crecientes de Ac, retando posteriormente
con dosis estándar de M.O patógeno o toxina.– Dosis de inoculación: LD50, ID50
– Efecto protector de un antisuero: PD50