BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos inmunológicos y “blots”

ELISA(Inmunoanálisis ligado a enzimas)

Técnica basada en la capacidad de un anticuerpo determinado dereconocer y unirse a un antígeno que ha sido adsorbido a un pocillode una placa de microtitulación.

ETAPAS EN EL ENSAYO DE ELISA

- Se agrega el antígeno a estudiar a los pocillos de la placa el que se adsorbe a las paredes.- Se bloquean todos los sitios de la pared del pocillo que no están unidos a antígeno con una proteína (albúmina de bovino). - Se agrega el anticuerpo específico para que se una al antígeno. Habitualmente es de tipo IgG.- Se agrega el segundo anticuerpo. Este anticuerpo es anti IgG y estáunido a una enzima (fosfatasa alcalina; peroxidasa).- Se agrega una solución con un sustrato específico para la enzima, generándose un producto coloreado cuya intensidad es medida con unespectrofotómetro. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo.

Usos: identificación y cuantificación de antígenos proteicos. Ventaja: posibilidad de analizar simultáneamente muchas muestras.

ELISA

WESTERN BLOTMuy usado en la detección de una proteína en una mezcla impura.

Proporciona la siguiente información:Cualitativa: ¿está presente la proteína?Cuantitativa: ¿qué cantidad de la proteína hay en la muestra?Estructural: ¿qué tamaño tiene la proteína?

Protocolo:- Se separa una mezcla de proteínas por electroforesis desnaturante.- Se transfieren las proteínas a una membrana (nitrocelulosa)- Se bloquean las áreas de la membrana no ocupadas con una proteínainespecífica (albúmina de bovino).- Se aplica a la membrana un anticuerpo primario específico contra laproteína en estudio.- Se incuba la membrana con un anticuerpo secundario de gran afinidadal anticuerpo primario, unido a una enzima (similar a ELISA).- Usando un sustrato que genera un producto coloreado se detecta la presencia de la proteína en estudio.

Transferencia manual de proteína o ácido nucleico de un gel a una membrana.

Electrotransferencia de proteína de un gel a una membrana

Un homogeneizado de músculoliso fue sometido a unaelectroforesis desnaturante.En A, se tiñó una pista del gelcon Azul de Coomassie.En B, se transfirió otra pistaa una membrana de nitrocelulosapara identificar alfa-actina.Esto se hizo con un anticuerpoanti IgG marcado con I125 y fuedetectado por autorradiografía.

DOT BLOT

Forma simplificada del “western blot”.

Ventajas: no se realiza una electroforesis previa sino que se carga en la membrana soporte la muestra a analizar, y se la somete a la reaccióncolorimétrica.

Permite una estimación cualitativa y cuantitativa del antígeno.

SOUTHERN BLOT

Todo fragmento de DNA es único en virtud de su secuencia nucleotídica.¿Cómo detectar un fragmento de DNA en una población de fragmentos?E. M. Southern inventó una técnica basada en la especificidad de secuencia.

La técnica implica la transferencia de fragmentos de DNA separadoselectroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa, seguida por sudesnaturación. La membrana es incubada con una sonda de DNA marcada de simple hebra que se une específicamente a la secuenciacomplementaria del DNA blanco. Finalmente se revela la ubicación deltrozo buscado con un método apropiado.

ETAPAS EN EL DESARROLLO DE UN SOUTHERN BLOT

Southern blot de DNA genómico de Penicillium purpurogenumdigerido con distintas enzimas de restricción e hibridado con unasonda homóloga. Enzimas utilizadas: lane 1, BamH I; lane 2, EcoR I; lane 3, Hind III; lane 4, Bgl II; lane 5, Bgl II/BamH I; lane 6, Bgl II/EcoR I; lane 7, Bgl II/ Hind III; lane 8, Bgl II/ Hinc II; lane 9, Bgl II/Pst I; lane 10, Bgl II/Xho I.

23 9,4 6,5

4,3 2,3

0,96

NORTHERN BLOT

Proceso similar al Southern blot destinado a la identificación de RNA. Se realiza una electroforesis de RNA (en agarosa), se transfiere a una membrana y se detecta el RNA blanco utilizando una sonda marcada de DNA (o RNA).

Uso importante en estudios de la regulación de la expresión génica: Identificación y cuantificación de un mRNA transcrito de un gen particular y el efecto de cambios que pueden influir en la expresión.