MÉTODOS DE ANÁLISIS INMUNOLÓGICOS.

Bienvenidos.

Los antígenos (Ag) reaccionan tanto in vivo como in vitro con los anticuerpos

(Ac)

específicos

El sitio activo para el antígeno denominado epítrope reacciona con el sitio activo

del anticuerpo llamado paratopos (Ag-Ac).

El número de epitópos presentes en los antígenos determina la valencia del ag.

en el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tiene sólo dos

paratopos (bivalentes) y la IgM e IgAs tienen 10 y 4 paratópos respectivamente,

debido a la multivalencia del Ag con las respectivas valencias del Ac, cuando se

da la reacción Ag – Ac se forman agregados moleculares.

Generalidades

Clasificación de interacciones Ag-Ac.

El tipo de enlaces o fuerzas que participan en la unión de los epítopos y paratopos son débiles,

no covalentes y entre ellas están: puentes de hidrógeno, electrostáticas débiles, de Van der

Waals e hidrofobicas, por lo tanto son reversibles y fácilmente se disocian el complejo ya

formado y de acuerdo a la naturaleza de los diferentes fenómenos que se pueden presentar como

consecuencia de la reacción permite clasificar a las interacciones Ag-Ac en :

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.

REACCIONES DE AGLUTINACIÓN.

REACCIONES DE FLOCULACIÓN.

REACCIONES DE NEUTRALIZACIÓN.

REACCIONES DE OPSONIZACIÓN.

REACCIONES DE CITÓLIISIS.

REACCIONES DE FIJACION DE COMPLEMENTO.

REACCIONES CON REACTIVOS MARCADOS.

Creite (1869) y Landois (1875), Krauss en 1887

estableciendo el fenómeno de Precipitación

(anticuerpos y antígenos solubles

Stillmark experimenta aglutinaciones entre eritrocitos y extractos de Ricinos communis

Dos años después Charrin y Roger al mezclar bacterias con suero previamente sensibilizados observa

grumos o aglutinados (anticuerpo soluble y antígeno fijo en membrana),

Landstainer descubre el sistema ABO empleando técnicas de hemaglutinación

antigenicidad de los eritrocitos

por Bordet (1898)

1908 Ottenberg realiza al primer prueba Transfusional

1930`s Marrack propone una explicación de la reacción

antígeno-anticuerpos, considerando que

el anticuerpo se une en forma de unión bivalente

y el antígeno en multivalentela formación de un retículo

o enrejado

el de aglutinación de eritrocitos con anticuerpos por

Ehrlich y Morgenroth (1900),

HISTORIA SOBRE LOS MÉTODOS DE ANALISIS INMUNOLOGICOS.

REACCION DE PRECIPITACIÓN

Se utiliza un antígeno en solución, como lisados bacterianos, toxinas, etc.., al

estar en presencia de sus Ac específicos forman complejos Ag-Ac posteriormente se

insolubilizan , dando como resultado una reacción de PRECIPITACIÓN.

MECANISMO:

Primera fase o de sensibilización: identificación y fijación del anticuerpo , esta

primera etapa casi no se ve influenciada por factores tales como, temperatura, pH,

fuerza iónica y la concentración de los reactantes.

Segunda fase o de estabilización de la reacción: formación de una estructura

molecular en forma progresiva da un enrejado. Esta 2ª etapa es mas tardada y es

dependiente de lo siguientes factores.

FACTORES QUE INFLUYEN

Temperatura

Relación Ag / Ac

Exposición del antígeno

pH (6.5 – 7.5)

Tiempo

Fuerza iónica del medio

Puede ocurrir solo la fase 1ª y no la 2ª, debido a variaciones cuantitativas, la

fase 2ª solo se presenta cuando la concentración de Ag y Ac son equivalentes.

TEMPERATURA: Acelera la reacción debido aun incremento de la difusión y el

movimiento de las moléculas. Esto es válido hasta los 56 °C, la mayoría de las

reacciones Ag-Ac se trabajan a temperatura ambiente, algunas técnicas se

usan a 37 °C , otras a 45 °C y otras a temperaturas frías (4-6 °C).

COMO AFECTAN ESTOS FACTORES LA REACCIÓN

pH: de este factor depende el estado iónico de grupos importantes que

participan en la interacción, como son los radicales amino (-NH₃) y carboxilo

(-COO), aun así el pH óptimo esta entre 6.8 a 8.6.

FUERZA IÓNICA (μ): Corresponde a la concentración de iones presentes en

el medio de reacción (electrolitos) los cuales son necesarios para disminuir

las cargas de repulsión que impiden que se formen los agregados, el intervalo

óptimo es 0.01- 0.1 para el enlace del Ag y Ac, a altas μ los grupos iónicos son

neutralizados y por tanto se reduce la afinidad.

CONCENGTRACIÓN DE Ag Y Ac. La concentración de Ag y Ac deben ser

equivalentes para que la precipitación pueda llevarse a cabo. Si hay exceso

de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA, si hay

exceso de Ag o de Ac solo se forman complejos primarios, no hay

precipitación.

CURVA DE PRECIPITACIÓN CUANTITATIVA.

Ag

Ac

PREZONA POSTZONA

TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN.

Las reacciones de precipitación pueden ser cualitativas, semicuantitativas y

cuantitativas y se pueden realizar en medio liquido y semisólido.

Hay varias técnicas para realizar este tipo de reacciones:

La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar.

La formación de capas estratificadas (técnica del anillo de interface o Ascoli)

La difusión simple unidimensional en gel de agar (técnica de Oudin)

La doble difusión unidimensional en agar

La difusión radial simple de agar (RID)

La doble difusión radial en gel de agar (DDR)

Las técnicas de difusión se combinan con procedimientos electroforéticos como:

La inmunoelectroforesis (IEF)

La electroinmunodifusión

La electroforesis bidimensional

AGLUTINACIÓN.

Técnicas como la aglutinación y la hemólisis son los métodos cualitativos más empleados en el

Laboratorio del Banco de Sangre:

Para determinar:

Grupo sanguíneo ABO y Rh,

Rastreo de anticuerpos

Coombs directo

Pruebas cruzadas

Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno específico y este se encuentra

en

estado particulado o forme (p.ej. Bacterias, eritrocitos, levaduras, células) reaccionan

formando

grumos o aglutinados y los principios que regulan esta reacción son los mismos de la

reacción de

Precipitación.

REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN.

La primera fase es conocida como sensibilización: proceso mediante el cual el

anticuerpo se une al antígeno de la superficie de la partícula. En esta fase puede haber

activación del complemento, donde se observa lisis.

La segunda fase es el resultado de la unión de las partículas mediante puentes de

anticuerpo, formando grumos o aglutinados que puedes ser vistos a simple vista o en

microscopio.Factores que afectan la reacción de aglutinación:

Temperatura

Relación Ag / Ac

Exposición del antígeno

pH (6.5 – 7.5)

Tiempo

Fuerza iónica del medio

Reacciones de aglutinación factores que influyen: Tipo de inmunoglobulina

Reacciones de Aglutinación Factores que influyen: Integridad de la membrana de eritrocito

Reacciones de Aglutinación Factores que influyen: Densidad del antígeno

Potencial zeta

Las reacciones de aglutinación pueden ser:

La IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente, superando la distancia entre

partículas, en un medio salino.

Mientras que la IgG requiere de medios proteicos como albúmina o la utilización de enzimas proteolíticas como

la bromelina para disminuir el potencial zeta y llegar a la segunda fase de reacción.

Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilización de una antigamaglobulina humana denominada

suero de coombs, este se une a la IgG unida al Ag formando puentes y formar aglutinados.

Estas reacciones se llevan a cabo con gran facilidad y su alta sensibilidad, pero no puede cuantificarse y solo

pueden darse resultados en función de realizar diluciones.

AGLUTINACIÓN DIRECTA O ACTIVA, donde los antígenos que intervienen son componentes naturales de la

partícula.

AGLUTINACIÓN INDIRECTA O PASIVA, en donde los antígenos solubles se absorben en forma artificial a

partículas que funcionan como soporte ( de tipo natural o artificial ).

las reacciones de aglutinación se pueden realizar en, placa, tubo y placa de microtitulación.

REACCIONES DE CITÓLISIS.

Los anticuerpos producidos en la respuesta humoral, activan el sistema complemento.

El complemento es un conjunto de glicoproteínas que inactivas se conocen como

(zimógenos) y requieren de ser activados.

La activación del complemento se lleva a cabo en forma de cascada y derivado de su

activación se generan actividades como: quimiotaxis, opsonización, degranulación

de basófilos y células cebadas y la lisis celular.

La activación del complemento se lleva a cabo por dos vías (la clásica y la alterna), y

la vía de la lectina

Cuando se activa el complemento por cualquier vía se lleva a cabo sobre una

superficie celular y en la última etapa forma el complejo de ataque a la membrana

(MAC), que causa la lisis de la célula.

Para que este sistema no cause daño a las propias células, existen otros factores de

regulación.

Reacción de citólisis.

En las reacciones de citólisis , en donde se emplea el complemento como

reactivo (titulación de hemolisinas, y reacción de fijación de

complemento) se utiliza el suero de algún animal como fuente de

complemento (cobayo), o cuando se cuantifica el complemento en el

suero de un paciente, debe tomarse en cuenta que alguno de los

componentes son termolábiles, y pierden rápidamente su actividad, por

lo que se debe utilizar el suero recientemente obtenido y conservado en

refrigeración o en su caso de usar productos comerciales liofilizados.

Hemólisis.

Las hemolisinas (amboceptores hemolíticos)son anticuerpos producidos

frente a los antígenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos.

los amboceptores en presencia del antígeno que estimuló su formación y del

complemento, desencadenan una reacción que causa la lisis de eritrocitos.

Para medir la actividad del amboceptor se realizan diluciones y a veces se

mide sólo el 50% de la hemólisis.

Técnicas con Anticuerpos o Antígenos marcados

Las reacciones Ag-Ac, pueden ser utilizadas para revelar la presencia de uno u otro de estos reactantes. La especificidad de esta reacción le da a estas reacciones in vitro una elevada confiabilidad.

Aumenta la sensibilidad de estas pruebas al utilizar marcas en cualquiera de los dos (Ag o en el Ac), permitiendo demostrar la presencia de cantidades sumamente pequeñas de los reactantes.

Las principales sustancias utilizadas como marcas son: isótopos, enzimas y fluorocromos.

Los isótopos se empazarón a usar en 1966 por la Dr. Yallow, cuando realizó su primer radioinmunoanálisis (RIA), que se trataba de unensayo competitivo en donde se permitía la competencia entre moléculas de Ag no marcadas y marcadas con radiosótopos por los sitios de unión con anticuerpos específicos. La marca en este caso se denomina trazador y tiene el objeto de permitir la identificación y la cuantificación del analito en la fracción libre y unida a la reacción.

ANTIGENOS ERITROCITARIOS

SABO/ ANTIGENOS SITIOS ANTIGENICOS x 103

A1 ADULTO A1 NEONATO A2 ADULTO

A2 NEONATO A1B ADULTO A2B ADULTO

B ADULTO B NEONATO

800 – 1170 250 – 370

240 140

460 – 850 140 750

200 – 320

La cantidad de sitios antigénicos, muestran diferencias substanciales para cada sistema eritrocitario así como su expresión en función de la edad