DIAGNÓSTICO: HERRAMIENTAS CONVENCIONALES APLICADAS SEGÚN LA ETAPA (MÉTODOS PARASITOLÓGICOS E INMUNOLÓGICOS). REACTIVOS DISPONIBLES EN EL MEDIOBioq. Verónica Ampuero

JTP Parasitología y Micología

Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia.

Universidad Nacional de San Luis

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

La Enfermedad de Chagas es una de las endemias más importantes en la región, siendo uno de los problemas de Salud Pública de mayor distribución en América Latina.

La importancia de la enfermedad radica en los daños que ocasiona a nivel del sistema nervioso, cardiovascular y digestivo.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

La transmisión del T. cruzi al ser humano, puede producirse por distintas vías:

a) vectorial por tratomíneos (vinchuca), b) congénita, (vía vertical de madre a hijo) c) por transfusiones o transplante, d) digestiva, considerada ahora como una ETA, e) vía accidental

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

La enfermedad de Chagas presenta tres etapas clínicas: a) aguda, b) indeterminada c) y crónica

Debemos tener en cuenta el período ventana

que se produce cuando T.cruzi ingresa al organismo,

cumple un ciclo de desarrollo en el hospedador que

abarca entre 7 a 15 días, donde comienza a ser detectable.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

Por esto es fundamental conocer tres aspectos:Cuándo realizar un análisis Qué análisis realizar Cuales son los objetivos de la realización

del análisis

Para evitar la realización de estudios parasitológicos

y/o serológicos en un momento inadecuado, con

la consecuencia de posibles falsos resultados

negativos.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

ETAPA INICIAL se presentan parasitemias, las que van disminuyendo a medida que transcurre el tiempo, hasta hacerse mínimas o aleatorias.

ETAPA AGUDA

el diagnóstico de laboratorio debe centrarse en la búsqueda del parásito

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

ETAPAS INDETERMINADA y CRÓNICA

el diagnóstico se realiza mediante la demostración de anticuerpos específicos anti

Trypanosoma cruzi.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

En nuestro país, el diagnóstico serológico debe efectuarse por dos

reacciones en paralelo, y en caso de discordancia, se debe recurrir a una tercera prueba a

fin de definir el resultado.

Para lograr un diagnóstico confiable, el laboratorio debe realizar una elección adecuada de los reactivos, antes de

implementar su utilización en la rutina diagnóstica diaria.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- TOMA DE MUESTRA

MOMENTO DEL CONTAGIO

deben realizarse al menos DOS pruebas serológicas para Chagas, a los fines de

conocer si el paciente tiene ya una infección previa.

Si la misma es negativa la segunda muestra debe ser obtenida respetando el periodo de ventana desde el inicio de la

posible infección.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA

En esta etapa deben realizarse fundamentalmente los

MÉTODOS PARASITOLOGICOS, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analíticos, dependiendo de la

disponibilidad de recursos humanos capacitados y equipamiento en cada

laboratorio. La DETECCIÓN DEL PARASITO, como en toda enfermedad infecciosa, es el único parámetro

de CERTEZA DIAGNÓSTICA.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS

Las metodologías actualmente recomendadas son:

GOTA FRESCAGOTA GRUESA

TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN DE STROUT

HEMOCULTIVOXENODIAGNOSTICO

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-GOTA FRESCA

Aumentar irrigación

Sensibilidad 50%

100x / 400x

gota de citrato al 2%)

Tripanosoma cruzi

45 minutos

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-GOTA GRUESA

Sensibilidad 50%

Colocar 1 a 3 gotas Desfibrinar

1-2min

Dejar secar

Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos.Lavar y secar

objetivo de 100x aceite

Tripanosoma cruzi

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-STROUT

Sensibilidad 95%

5-10 mL

Tº amb

Coag.

600 rpm 2 min.

2500 rpm 10 min.

Suero

Sedimento

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-MICROHEMATOCRITO

Sensibilidad 90 a 95%

45 segundos a 5000 rpm

6 a 9 microhematocrito heparinizado

Cerrar extremo con plastilina Cortar

BIOSEGURIDAD

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES RECOMENDABLE

Puede brindar falsos resultados negativos:

1. si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados

2. Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero.

3. Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una

4. adecuada adherencia y dificulta la observación.

Por razones de Bioseguridad del operador: Esto es crucial, ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-HEMOCULTIVO

Hemocultivo: consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.

Sin ttulo 3.wmv

El método del hemocultivo es de elección por su menor agresividad

para los pacientes, fundamentalmente en la población neonatal, mayor

precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura.Existen técnicas estandarizadas con sangre

heparinizada, recogida en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro

Corazón) y bifásico (pico de flauta de agar sangre) que se realizan en un centro de referencia de la pcia.

De Córdoba.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-XENODIAGNÓSTICO

Se realiza con la aplicación de 4 cajas con 20 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elástica.

Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos, luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días. El material se obtiene por compresión de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x , recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-XENODIAGNÓSTICO Xenodiagnostico: consiste en amplificar el nº de

parásitos utilizando al vector.

ventajas desventajas

Strout, Microstrout

Resultado precoz Certeza diagnóstica Sencillez operativa Bajo costo

Sensibilidad cercana al 70% en el período agudo y 50% en el período crónico

Hemocultivo Elevada sensibilidad Certeza diagnóstica Facilidad en la obtención de la muestraBajo costo

Requiere experiencia del operador Contaminaciones

Xenodiagnóstico Gold standard Método cruento Reacciones alérgicas Infraestructura compleja

Enfermedad de Chagas Diagnóstico parasitológico

En resumen, los métodos parasitológicos clásicos: EXAMEN EN FRESCO, STROUT O MICROSTROUT y

HEMOCULTIVO empleados secuencialmente, permiten detectar el parásito, y consecuentemente efectuar

el diagnóstico de certeza, prácticamente en el 95% de los casos

durante el período agudo.

ETAPA CRONICA- METODOS SEROLÓGICOS

El concepto básico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parásito y, por lo tanto, sus resultados nunca

proporcionan certeza diagnóstica y deben medirse en términos de

probabilidad.

Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen

a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente

El MÉTODO A EMPLEAR, EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS

RESULTADOS.

Métodos serológicos : Los métodos actualmente validados son:

ELISA Hemaglutinación indirecta (HAI) Inmunofluorescencia (IF)

Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son:

Sensibilidad (S), Especificidad (E)

y Valor predictivo (VP)

S: capacidad de un método de dar resultado positivo en presencia de infección

E: capacidad de un método de dar resultado negativo en ausencia de infección

VP: probabilidad que un individuo con resultado positivo esté realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado negativo sea realmente no infectado (VP-).

Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor).

Como ningún método tiene 100% de E, las pautas para diagnóstico de la infección

chagásica (Manual para la atención del paciente infectado con Tripanosoma cruzi Ministerio de Salud de la Nación. 2005) determinan que, para que

un individuo sea considerado chagásico, deben dar positivos al menos dos métodos

serológicos diferentes:

ELISA + HAI ELISA + IF HAI + IF

Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura vertical

(lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad.

Permite procesar elevado número de muestras y, además, es la que mejores resultados

permite obtener en muestras de sangre entera (sangre

con glicerina, papel de filtro) o con otros fluidos

biológicos como el trasudado mucoso oral.

La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel

de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de

elevado número de muestras.

La técnica de IF sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere experiencia del operador y depende de

la subjetividad del mismo.

Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de

pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras.

EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS

DOS PRUEBAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD

DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA

DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL.

KITS COMERCIALES

KITS COMERCIALES

Gracias por la atención, nos vemos en el

practico!