LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL PARA LA PRÁCTICA CLÍNICA

Manual de Formación Continuada 2015-2016 La disfunción endotelial para la práctica clínica
1. INTRODUCCIÓN
El endotelio juega un papel crucial en la patogénesis de la trombogénesis y la aterogénesis, y su
activación continua, su disfunción o el daño endotelial, constituyen el desencadenante de muchos
trastornos cardiovasculares, tanto a niveles macro- como microscópicos.
1.1. El endotelio
El endotelio es una monocapa formada por células epiteliales planas que conforman la túnica
íntima de los vasos sanguíneos, tapizando su luz y controlando la comunicación entre la pared
vascular y los componentes de la sangre. No sólo se limita a la capa íntima, ya que los vasos que
nutren a la adventicia (vasa vasorum) también están recubiertos por células endoteliales (1). El
endotelio protege la pared arterial frente al desarrollo de lesiones y contribuye a la homeostasis
vascular a través de un control continuo de los estímulos que recibe y la adaptación de su estado
funcional. Las células endoteliales son capaces de detectar los cambios tanto físicos (estrés
mecánico hemodinámico) como químicos (liberación de moléculas en su entorno) y
transformarlos en respuestas funcionales adaptativas. Esta capacidad de adaptación le permite
mantener la homeostasis vascular a través de las siguientes funciones: regulación del tono
vascular mediante la producción equilibrada de factores vasodilatadores y vasoconstrictores;
funciones antitrombóticas mediante la inhibición de la adhesión plaquetaria y la coagulación, la
regulación del sistema fibrinolítico y la producción de citocinas y moléculas de adhesión que
regulan la función inflamatoria vascular (1).
LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL PARA LA PRÁCTICA CLÍNICA
Bobillo Lobato, Joaquín; Vélez González, María; Romero Reyes, María José
Hospital Universitario Nuestra Señora de Valme. Sevilla.
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Es necesario sin embargo, considerar la variación fenotípica existente entre las células
endoteliales en las distintas partes del sistema vascular, puesto que las células endoteliales
expresan en diferentes lugares del organismo diversos antígenos de superficie y receptores, y por
tanto generan respuestas heterogéneas a un mismo estímulo. Por otro lado, las respuestas de las
células endoteliales cultivadas in vitro pueden no reflejar las mismas respuestas que in vivo, y esto
debe ser tenido en cuenta en la interpretación de los estudios.
Por consiguiente, el endotelio puede ser considerado como un "órgano", y su función o
disfunción puede ser estudiada y cuantificada.
1.2. Disfunción endotelial: concepto y aplicabilidad
La disfunción endotelial puede definirse como un desequilibrio en la biodisponibilidad de
sustancias activas de origen endotelial que predispone a la inflamación, la vasoconstricción y el
incremento de la permeabilidad vascular, pudiendo facilitar el desarrollo de arteriosclerosis,
agregación plaquetaria y trombosis (2).
La definición de nuevos abordajes para la prevención y el tratamiento de la arteriosclerosis y
sus síndromes asociados es una necesidad y prioridad debido al impacto en la morbimortalidad y
la salud pública de estas enfermedades. La evaluación de la disfunción endotelial es una
herramienta de utilidad para valorar estas patologías. Además de identificar pacientes con un
elevado riesgo de presentar eventos cardiovasculares, la evaluación de la función endotelial
permite la cuantificación de los efectos beneficiosos de cambios en el estilo de vida y en el
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tratamiento médico. Muchas intervenciones farmacológicas y dietéticas que reducen el riesgo
cardiovascular han demostrado mejorar la función endotelial.
2. IMPLICACIONES CLÍNICAS DE LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL
El endotelio es un tejido ubicuo, por lo que la disfunción endotelial es una enfermedad sistémica
en la que están implicados varios procesos patológicos. Diversas enfermedades y síndromes se asocian
a un aumento de los eventos cardiovasculares y la disfunción endotelial es en muchas ocasiones la
principal causa de ello.
Los factores de riesgo cardiovascular convencionales, como la hipertensión, la dislipemia, la
diabetes mellitus, la edad y la obesidad, predisponen a la disfunción endotelial. Dichos factores
de riesgo se relacionan con una producción excesiva de anión superóxido (O2 –) que a su vez
inactiva al óxido nítrico (NO). El NO es una de las moléculas sintetizadas por el endotelio que
regula un mayor número de procesos homeostáticos locales, siendo vasodilatador, antiagregante
plaquetario, inhibidor de la proliferación de las células musculares lisas, antioxidante e inhibidor
de la expresión de moléculas de adhesión y de la adhesión de monocitos. De esta manera, la
alteración de la producción de NO endotelial perturba la homeostasis vascular y potencia el
desarrollo de lesiones ateroscleróticas. La falta de biodisponibilidad de NO precede al desarrollo
de la aterosclerosis y es un predictor independiente de eventos cardiovasculares adversos (2).
2.2. Diabetes mellitus
En esta patología la disfunción endotelial parece encontrarse en el nexo entre las
alteraciones del metabolismo glucídico y la enfermedad vascular.
Existe amplia evidencia clínica y experimental que indica que la diabetes tipo 1 y tipo 2
originan alteraciones del endotelio. Modelos animales han demostrado que la disfunción del
endotelio se manifiesta después de un período de estado de diabetes o hiperglucemia (3).
La razón de la susceptibilidad del endotelio a los efectos de la diabetes/prediabetes se
relaciona con el hecho de que el endotelio se expone directamente a la hiperglucemia de la
circulación, pero es incapaz de autorregular el transporte de glucosa, acumulando de este modo
el exceso de glucosa intracelularmente y originando efectos biológicos adversos.
El endotelio se encuentra en un lugar vulnerable tanto a la interacción con el sistema inmune,
mediadores inflamatorios y otras sustancias vasoactivas circulantes, así como a las fuerzas
mecánicas del propio flujo sanguíneo. Dependiendo de la magnitud de estos efectos, las
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consecuencias pueden incluir entre otros: generación de ROS, cambios de osmolaridad, aumento
de la expresión de moléculas de adhesión, formación aumentada de citocinas proinflamatorias y
quimiocinas, aumento de la permeabilidad de la membrana… todo ello desencadena el deterioro
de la capacidad de respuesta funcional endotelial (3).
2.3. Síndrome de apnea obstructiva del sueño (SAOS)
Los pacientes con SAOS sufren un proceso de hipoxemia-reoxigenación que generalmente se
presenta con un patrón cíclico durante toda la noche y ocasiona que el endotelio vascular, durante
la hipoxemia, libere sustancias promotoras de inflamación como la proteína C reactiva, factor de
necrosis tumoral e interleucinas 6 y 8, activándose además factores de la coagulación que
favorecen un estado protrombótico y un aumento de la agregación plaquetaria. En los períodos
de reoxigenación se produce un estrés oxidativo que disminuye la biodisponibilidad de NO. Todo
ello predispone a la disfunción endotelial y genera que los pacientes con SAOS presenten un riesgo
cardiovascular elevado (4).
2.4. Enfermedades reumáticas
Varios estudios apoyan la idea de que la disfunción endotelial conduce a una aterosclerosis
acelerada en la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico y las espondiloartropatías (5).
La inflamación crónica presente en las enfermedades autoinmunes reumáticas juega un
papel clave en la patogénesis de la disfunción endotelial en estas patologías. Las citoquinas,
moléculas de adhesión, autoanticuerpos, el estrés oxidativo y la dislipidemia contribuyen al daño
vascular, producen a una incapacidad de modulación del tono vascular normal y conducen a
manifestaciones funcionales que incluyen: alteración de la vasodilatación dependiente del
endotelio, aumento de la permeabilidad a las lipoproteínas y componentes del plasma, y
finalmente, desarrollo de aterosclerosis (5).
3. EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN ENDOTELIAL
Desde hace unos años, los indicios y evidencias de que el endotelio se encontraba formando parte
de procesos patológicos complejos (como los ya mencionados) han impulsado los estudios destinados
a evaluar su función, no sólo respecto a sus propiedades vasodilatadoras, sino también en relación a
su integridad vascular y su capacidad de regeneración.
El campo de estudio centrado en la disfunción endotelial es relativamente reciente y no existe un
consenso unánime relativo a la forma de abordar su evaluación, de forma que no contamos con un
modelo sistematizado de evaluación que podamos seguir.
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En su defecto, sí disponemos de con numerosas técnicas que han ido desarrollándose en los últimos
años y que nos permiten realizar una valoración objetiva de los distintos procesos que se
desencadenan como consecuencia de la alteración endotelial, pudiendo extraer de ellos información
de utilidad clínica.
Para su descripción, agruparemos estas técnicas en dos tipos de estudios: estudios funcionales y
estudios bioquímicos.
3.1. Estudios funcionales
Se centran en evaluar la respuesta vasomotora dependiente del endotelio en relación a la
respuesta independiente de éste. Los métodos utilizados son tanto invasivos como no invasivos.
Estudios intracoronarios.
El gold standard para el estudio de la función endotelial en arterias coronarias
epicárdicas ha sido la infusión intracoronaria de sustancias vasodilatadoras,
principalmente la acetilcolina (ACh). En los vasos sanos la ACh induce vasodilatación
mediada por la liberación de NO. Sin embargo, en presencia de aterosclerosis, donde
la biodisponibilidad del NO se ve reducida, la ACh tiene un efecto muscarínico en el
músculo liso vascular produciendo una vasoconstricción paradójica. La nitroglicerina
se ha usado rutinariamente para evaluar la vasodilatación independiente del endotelio
debido a la relajación directa de las células musculares lisas vasculares. El principal
inconveniente de estos métodos es su naturaleza invasiva, lo que limita su utilidad (2).
Vasodilatación mediada por flujo (VMF) en la arteria humeral
La disfunción endotelial no solo afecta a las arterias coronarias, sino que se trata de un
proceso sistémico que afecta a diversos territorios vasculares. Por ello, se han
desarrollado diversos métodos no invasivos, que permiten estimar de manera
indirecta la función vascular coronaria a través de la determinación de la función
endotelial en vasos periféricos. Dichos métodos se basan generalmente en el estudio
de la vasomotilidad dependiente del endotelio mediante la inducción fisiológica o
farmacológica de la liberación de NO por parte del mismo. El más validado hasta el
momento es la VMF en la arteria humeral. Se basa en la provocación de isquemia a
nivel proximal del antebrazo, mediante el inflado de un manguito neumático a una
presión suprasistólica durante 5 minutos. El hiperflujo generado en el antebrazo tras
esta isquemia transitoria, genera una fuerza de cizallamiento tangencial que provoca
la liberación endotelial de NO. El NO se difunde a las células de músculo liso causando
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su relajación con la consiguiente vasodilatación. El método más comúnmente utilizado
para medir la VMF es la valoración comparativa mediante ecografía de alta resolución,
del diámetro de la arteria humeral en situación basal con el aumento máximo del
diámetro tras la hiperemia reactiva (1,2).
Pletismografía digital
Basado en la hiperemia reactiva post-isquémica la cual produce una VMF que permite
calcular un índice entre el flujo de un brazo en el que se induce la hiperemia reactiva y
el brazo de control. Este índice es una medida de la función endotelial (2).
Velocidad de onda del pulso
Suele medirse entre la arteria carótida y la femoral mediante la detección sincrónica
de la llegada de la onda a ambas localizaciones y determinando la distancia entre ellas
(2).
Flujometría Doppler Digital Láser
Estudia la función endotelial microvascular basándose en el efecto Doppler (2).
3.2. Estudios bioquímicos
Las alteraciones en la función endotelial también pueden detectarse utilizando
biomarcadores que reflejen la “salud endotelial”, siendo éste un abordaje relativamente sencillo.
Actualmente hay descritos numerosos productos endoteliales que se liberan al plasma y para
los que se han desarrollado eficientes metodologías de cuantificación.
Ésta es la forma en la que el laboratorio clínico puede valorar la función endotelial.
Los biomarcadores más utilizados en la práctica clínica se enumeran en la Tabla 1 y se
desarrollan a continuación los más destacados (6).
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Tabla 1. Biomarcadores utilizados para la evaluación de la función endotelial
SUSTANCIAS VASOACTIVAS LIBERADAS POR EL ENDOTELIO
Óxido nítrico Prostaciclina
Endotelina-1 Angiotensina II
Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
Bradiquinina Factor activador de plaquetas
MARCADORES CIRCULANTES DE ORIGEN ENDOTELIAL
Moléculas de adhesión: ICAM-1 y
VCAM-1
Factor tisular Activador del plasminógeno tisular
Trombomodulina soluble Inhibidor del activador del
plasminógeno
Células endoteliales circulantes
Células endoteliales progenitoras
Micropartículas circulantes
El sistema del óxido nítrico: el óxido nítrico, las prostaciclinas y el factor de
hiperpolarización derivado del endotelio
El NO es el mediador predominante de la función vascular normal, y se asocia con disfunción
endotelial, estrés oxidativo e inflamación cuando su biodisponibilidad se encuentra reducida.
El NO es un gas soluble sintetizado de forma continua a partir del aminoácido L-arginina
en las células endoteliales por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS, EC 1.14.13.39) (7). La
liberación de NO produce una vasodilatación muscular por un mecanismo dependiente de
guanosín monofosfato cíclico (cGMP) intracelular generado por la enzima guanilato ciclasa.
La NOS puede ser activada por cambios en el calcio intracelular en respuesta a fuerzas de
cizallamiento o por mediadores paracrinos tales como la acetilcolina, bradiquinina, insulina o la
sustancia P (6). La síntesis de esta enzima es un proceso que requiere al cofactor
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tetrahidrobiopterina para su actividad catalítica (figura 1) (8). En la etapa de iniciación de la
oxidación de la L-arginina, la tetrahidrobiopterina dona un electrón al complejo ferroso-dioxígeno
en el dominio oxigenasa, que conduce a la separación del dioxígeno y la formación de una especie
oxi de hierro. La falta de tetrahidrobiopterina perjudica este proceso y conduce a la generación
–
es un radical libre inestable que reacciona rápidamente con el NO libre para formar peroxinitrito
(NOO–) que a su vez puede reaccionar con otros compuestos para generar varias especies
reactivas del oxígeno (ROS). Estas ROS son productos intermedios de la cadena de transporte de
electrones, son electroquímicamente inestables, y dan lugar a un estado de mayor estrés
oxidativo. Por tanto, la deficiencia de tetrahidrobiopterina ocasiona una función anormal de la
NOS que subyace en la disfunción endotelial, donde hay disminución de NO y un aumento en la
producción de ROS (9).
El NO, además de ser una sustancia vasodilatadora, actúa como antiagregante plaquetario,
inhibidor de la proliferación de las células musculares lisas, antioxidante e inhibidor de la
expresión de moléculas de adhesión y de la adhesión de monocitos. Por todo ello, el NO desarrolla
un papel crucial en la función endotelial normal (6,7).
Figura 1. Mecanismos de la célula endotelial productores de la relajación de la célula muscular lisa (8).
eNOS: óxido nítrico sintetasa endotelial. NO: óxido nítrico. COX: ciclooxigenasa. PGI2: prostaciclina CYP4502C: citocromo
P450 2C. EETs.: ácidos eicosatrienoicos. KCA: canales de potasio dependientes de calcio. Gap: uniones gap. BH4: tetrahidrobiopterina. H2O2: peróxido de hidrógeno. SOD: superóxido dismutasa. AC: adenilil ciclasa. cAMP: adenosín
monofosfato cíclico . cGMP: monofosfato de guanosina cíclico. sGC : guanilato ciclasa soluble. IP: receptor de prostaciclina.
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Por otra parte, los factores que estimulan la liberación endotelial de NO también activan la
síntesis de las prostaciclinas (como la PGI 2), a partir del ácido araquidónico, por la acción de la
ciclooxigenasa de las células endoteliales. La PGI 2 es un vasodilatador al igual que el NO, y lleva
a cabo su acción mediante la activación específica de receptores de superficie celular de inositol
fosfato (IP). Estos receptores están acoplados a la proteínas G que trasmiten la señal a la adenilato
ciclasa (AC), elevándose los niveles de adenosín monofosfato cíclico (AMPc) conduciendo a la
relajación del músculo liso (figura 1). Por otro lado, la PGI 2 también disminuye los niveles de
endotelina-1 (potente vasoconstrictor) y de calcio intracelular, lo cual ayuda en la relajación del
músculo liso vascular. PGI 2 también posee propiedades fibrinolíticas y de inhibición de la
adhesión y agregación plaquetaria (6,8).
En último término, además del NO y la prostaciclina como vasodilatadores endoteliales
principales, encontramos al factor de hiperpolarización derivado del endotelio (FHDE), cuya
naturaleza aún no se conoce con exactitud.
Se ha observado que, incluso, después de la inhibición completa de la síntesis de NO y de
prostaglandinas, la vasodilatación persiste a través de la hiperpolarización de las células del
músculo liso vascular. Este proceso se ha atribuido al FHDE, de manera que puede compensar la
pérdida de vasodilatación mediada por NO, principalmente en la microcirculación (6).
El efecto vasodilatador del FHDE parece relacionarse, por tanto, con la hiperpolarización del
músculo liso vascular mediante la apertura de canales de potasio dependientes de calcio (KCA).
El proceso se desencadena en respuesta a la acción de determinados metabolitos del ácido
araquidónico (ácidos eicosatrienoicos), el peróxido de hidrógeno, el sulfuro de hidrógeno y otros
péptidos liberados por las células del endotelio. También, las uniones comunicantes
mioendoteliales (uniones gap) estarían involucradas en el mecanismo de relajación mediado por
FHDE (figura 1), de manera que se produciría la transmisión de la hiperpolarización de las células
endoteliales al músculo liso vascular a través de estas uniones (6,8).
Determinación del óxido nítrico
El NO puede cuantificarse por métodos directos (cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas, cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detectores
electroquímicos, resonancia electrónica paramagnética, quimioluminiscencia) y por métodos
indirectos (espectrometría de masas, espectrofotometría ultravioleta-visible y métodos
electrométricos). Las concentraciones de este gas in vivo (entre 10 nM y 1 μM) y su vida media en
disolución acuosa (entre 3,8 y 6,2 segundos), reducen la aplicabilidad de estos métodos para la
evaluación en muestras biológicas (10).
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Para solventar estas dificultades inherentes a la determinación del NO se recurre a la
cuantificación de sus metabolitos estables: el nitrito (NO2 –) y el nitrato (NO3
–). En muestras
plasmáticas, el NO es oxidado completamente a NO3 –, el cual es estable durante varias horas. Por
otra parte, el NO2 – es convertido rápidamente a NO3
– en la sangre mediante su oxidación por la
hemoglobina (7,10).
Existen varias técnicas para la detección de NO3 – y NO2
–, siendo la más utilizada la detección
colorimétrica con reactivos de Griess. Esta reacción involucra la formación de un cromóforo
mediante la diazoación de la sulfanilamida con ácido nitroso, seguido de la asociación con una
amina bicíclica (figura 2)(10). Debido a que la reacción de Griess no detecta al anión NO3 –, se
procede a un paso de reducción previo de NO3 – a NO2
– por la nitrato reductasa.
Figura 2. Reacción de Griess acoplada a la actividad enzimática nitrato reductasa para la cuantificación
de los metabolitos estables del NO: NO2 – y NO3
– (10)
En el análisis de muestras biológicas, particularmente en el caso de suero, la reacción de
Griess convencional tiene limitaciones respecto a la sensibilidad (1 a 5 μM) por lo que a lo largo
del tiempo se han ido introduciendo varias modificaciones a este respecto. El límite de
cuantificación puede incrementarse utilizando dapsona en lugar de sulfanilamida, seguido de una
ultracentrifugación, alcanzando límites de cuantificación de hasta 0,2 μM. Por otro lado, las
reacciones que sustituyen a la nitrato reductasa por una reducción química con cadmio o vanadio
pueden alcanzar límites de cuantificación de hasta 0,69 pM, aunque implican la utilización de
metales pesados potencialmente tóxicos (10).
Respecto al tratamiento de la muestra biológica, se recomienda llevar a cabo un tratamiento
previo de desproteinización para llevar a cabo la lectura a una longitud de onda analítica de 540-
550 nm. Es necesario tener en cuenta que los anticoagulantes (EDTA, citrato de sodio y heparina)
interfieren con la reacción de Griess sobreestimando los resultados (10).
Las condiciones de estabilidad de la muestra exigen una centrifugación inmediata tras la
extracción, y una vez separado el suero, procesarlo rápidamente o almacenarlo a una
temperatura de -70°C, pudiendo así permanecer estable por más de tres meses.
Dimetilarginina asimétrica (ADMA)
La metilación de residuos de arginina en las proteínas es una característica bien conocida en
procesos de señalización y metabolismo celular. Las más frecuentes son: la monometilación, la
dimetilación y la trimetilación de la arginina y la lisina.
La dimetilarginina asimétrica (ADMA, NG,NG-dimetilarginina) es una molécula endógena que
presenta una homología estructural con el aminoácido L-arginina, pero se diferencia de ella en
que contiene dos grupos metílicos y actúa como inhibidor competitivo de la enzima NOS. Por
tanto, concentraciones elevadas de ADMA pueden bloquear la síntesis de NO. La ADMA procede
de la hidrólisis de proteínas nucleares previamente metiladas, implicadas en el procesamiento y
la transcripción del ARN. La enzima encargada de estas metilaciones se denomina proteinarginina
metiltransferasa (PRMT). La PRMT tipo I se ocupa de la formación de ADMA mediante la
dimetilación en un solo grupo nitrogenado, mientras que la PRMT tipo II produce una metilación
simétrica de los restos de arginina originando una dimetilarginina simétrica (SDMA, su isómero
simétrico – NG,N’G-dimetilarginina), que no interfiere con la NOS (11).
Cuando se produce la hidrólisis de las proteínas que contienen los restos de ADMA, este
metabolito puede tener varios destinos: a) excreción renal, b) hidrólisis hasta citrulina y
metilaminas, y c) otras vías metabólicas secundarias (reacciones de transaminación en el riñón o
100
reacciones de acetilación en el hígado). La mayoría de los estudios indican que la principal vía de
eliminación de ADMA es la renal (6).
La ADMA, pero no la SDMA, se metaboliza por la enzima denominada dimetilarginina
dimetilaminohidrolasa (DDAH) para producir la L-citrulina y la dimetilamina. La actividad de la
DDAH, que media la degradación metabólica de la ADMA, parece conducir a mecanismos
reguladores complejos que no están completamente claros.
La acumulación de ADMA en el organismo se previene en sujetos sanos por la excreción renal
y por su degradación metabólica. Cambios en la función excretora renal o en la actividad de la
DDAH, como los que pueden inducir los factores de riesgo cardiovascular, conducen a
concentraciones de ADMA elevadas en diversas enfermedades metabólicas y cardiovasculares
(11).
Determinación de dimetilarginina asimétrica
Las técnicas comúnmente empleadas para el análisis de la metilación de proteínas en plasma
son la cromatografía de intercambio iónico y, más recientemente, la cromatografía líquida con
espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS). No obstante se han desarrollado toda una gama
de métodos de determinación con sus correspondientes ventajas e inconvenientes.
La principal ventaja de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) sobre la
cromatografía de intercambio iónico es una reducción de varias horas en el tiempo de análisis. El
método de HPLC que parece más sensible para la determinación de argininas metiladas utiliza o-
ftaldialdehído (OPA) para la derivatización y detección fluorescente con longitudes de onda de
excitación a 340 nm y emisión a 455 nm. La etapa crucial del análisis es la separación
cromatográfica de ADMA y SDMA. Para ello se emplean columnas en fase reversa de octadecil-
sílice o fenil-sílice (es preciso tener en cuenta que los derivados OPA de ADMA y SDMA eluyen en
una columna de fenil-sílice en el orden opuesto a como lo hacen en una de octadecil-sílice). Para
concentrar los analitos del plasma antes del análisis, es esencial un pretratamiento de las
muestras mediante extracción en fase sólida (SPE). Por otra parte, los protocolos actuales para la
determinación de argininas metiladas por HPLC inciden en la utilización de un estándar interno
apropiado. Algunos de los más empleados son: homoarginina, NG-monometil-L-arginina (NMMA)
y Nω-propil-L-arginina (N-PLA). Un cromatograma modelo se representa en la figura 3 (12).
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Figura 3. Cromatograma de un combinado de estándares que contiene arginina, homoarginina, dimetilarginina simétrica (SDMA), y dimetilarginina asimétrica (ADMA) (12).
La fluorescencia se detecta después de la extracción en fase sólida (SPE), la derivatización se realiza con o-ftaldialdehído (OPA), y la separación en una columna de fenilo.
Identificación de los picos: 1) Arginina; 2) Homoarginina; 3) SDMA; 4) ADMA.
Un inconveniente importante de los productos derivatizados con OPA es su inestabilidad
debido a una rápida descomposición, por lo que puede plantearse utilizar otros agentes de
derivatización en combinación o en lugar del OPA.
Los productos de derivatización con OPA de las argininas metiladas pueden también ser
empleados para el análisis por espectrometría de masas. El ADMA-OPA y el SDMA-OPA muestran
patrones de fragmentación idénticos bajo ionización por electroespray (ESI), con masa/carga
(m/z) = 379. Los demás derivados de L-arginina formados con OPA quedan bien diferenciados por
sus diferentes relaciones masa/carga.
La ventaja de la espectrometría de masas es su excelente especificidad y, por lo tanto, el paso
de SPE puede omitirse. Aun así, debido a la incapacidad para diferenciar los isómeros de
dimetilarginina es imprescindible acoplar el sistema de espectrometría de masas a un sistema de
separación (habitualmente cromatografía líquida, cromatografía gaseosa o electroforesis capilar)
en sistemas en tándem (LC-MS, GC-MS y CE-MS, respectivamente). Para prescindir del proceso
previo de separación cromatográfica, la derivatización debe utilizar otros compuestos distintos
del OPA.
Endotelina
El endotelio, además de sustancias vasodilatadoras como el NO, sintetiza compuestos
predominantemente vasoconstrictores, como la endotelina 1 (ET-1), que además promueve la
agregación plaquetaria y proliferación de células musculares lisas (CML) (13).
La ET-1 pertenece a una familia conformada por 3 péptidos de 21 aminoácidos (ET-1, 2 y
3) con una estructura peptídica muy similar. La ET-1 (2,49 KDa) es sintetizada en el endotelio y
músculo liso vascular. Estímulos importantes como la hipoxia o la isquemia inducen la
transcripción de ARN mensajero, síntesis y secreción de ET-1 en minutos. Se libera hacia el
músculo liso fundamentalmente y una pequeña proporción hacia el lumen. Su vida media en
plasma es de 4 a 7 minutos, se une a receptores específicos de músculo liso y provoca
vasoconstricción, pudiendo considerarse como una hormona paracrina. Está constituida por 21
aminoácidos con cuatro residuos de cisteína, estableciendo dos puentes disulfuro
intramoleculares y formando una estructura semicónica inusual. Los puentes disulfuro y el
dominio carboxiterminal son cruciales, tanto para la unión de la endotelina con su receptor
específico como para conservar su actividad biológica (13,14).
El gen que codifica la ET-1 (END-1) se halla en el brazo corto del cromosoma 6 (6p24.1) y
se transcribe como una preproendotelina de 212 aminoácidos. A través de la acción proteolítica
de una endopeptidasa se transforma en Big-endotelina-1, de 39 aminoácidos (Big-ET-1). Este
fragmento posteriormente sufre la acción de la enzima convertidora de endotelina (ECE-1, EC
3.4.24.71) de las que existen cuatro isoformas (a,b,c,d).
La enzima ECE-1 es una metaloendoproteinasa, que pertenece a la superfamilia de la
neprilisina (zinc metaloproteinasa unida a membrana), cuya máxima actividad es a pH de 7,40.
Esta enzima rompe la unión en la posición triptófano 21-valina 22 (Trp21-Val22), transformándola
en endotelina-1 de 21 aminoácidos (ET-1), siendo éste el péptido activo. La ET-1 formada es un
polipéptido 140 veces más potente que la Big-ET-1 y es la que ejerce los efectos biológicos (14).
Se ha descrito otro mecanismo paralelo para la formación de endotelina-1, que consiste
en la liberación de enzimas como la quimasa, quimotripsina, catepsina G y caboxipeptidasa A, tras
activación de los gránulos citoplasmáticos de mastocitos. Así, la quimasa ejerce su acción sobre
Big ET-1 logrando escindirla a nivel de sus residuos Tyr31-Gly32, resultando una endotelina- 1 de
31 residuos (ET 1-31) con efectos vasoconstrictores, pero de menor potencia que su homóloga de
21 aminoácidos. En la figura 4 se expone la estructura de estas endotelinas, así como las zonas de
escisión proteolítica y las enzimas que ejercen su función (14).
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Figura 4. Estructura de la endotelina-1 (14). Los puentes disullfuro en posición 1-15 y 3-11 se muestran en color azul. Adicionalmente la forma de 31 aminoácidos presenta una cadena polipeptídica de 10 aminoácidos adicionales (color gris) en su extremo
carboxi-terminal.
Existen factores de crecimiento y proteínas vasculares que modulan la transcripción de ECE-
1: angiotensina II, catecolaminas, insulina, LDL oxidadas, HDL y trombina la estimulan; mientras
que el péptido natriurético atrial, NO y prostaciclina, la inhiben.
La ET-1 ejerce su función en el mantenimiento del tono basal vasomotor, principalmente
por la estimulación de los receptores tipo A de endotelinas (ET-A) de las CML, aunque la
estimulación de los receptores tipo B (ET-B) de las CML de arterias coronarias también suelen
inducir vasoconstricción (14).
Determinación de endotelina
son de naturaleza inmunoquímica:
1 marcada (habitualmente con 125I).
104
- Enzimoinmunoanálisis (EIA), incluyendo ensayos de inmunoabsorción ligados a
enzimas (ELISA): sistemas tipo sándwich heterogéneos dirigidos contra endotelina
o formas de endotelina inmunorreactivas.
Los ensayos tipo RIA presentan de forma general una especificidad menor y, por otro lado,
necesitan equipos costosos, permisos especiales, los marcadores son de duración limitada y el
hecho de trabajar con material radiactivo siempre implica riesgos. Por todo ello han ido cediendo
en favor del uso de los ensayos enzimáticos.
Por su parte, los ensayos de ELISA más extendidos son heterogéneos, con fijación de uno de
los anticuerpos a una fase sólida (normalmente pocillos de una microplaca), utilizan peroxidasa
de rábano (horseradish peroxidase, HRP) como enzima conjugada y tetrametilbenzidina como
cromógeno, cuantificando la reacción de color por su absorbancia a 450 nm (DO450). Otros
sistemas menos comunes son homogéneos o usan fluorescencia, quimioluminiscencia y marcajes
cromáticos de detección directa (como los que se utilizan para sistemas Point-of-Care) (15).
El principal factor limitante en la cuantificación de ET-1 es su permanencia extremadamente
corta en la circulación (4-7 minutos). Se considera que es su distribución a los tejidos y su unión a
receptores (altamente rápida y afín) la responsable de ello. Por este motivo, la validez de la
determinación de ET-1 en muestras de plasma no parece ser el acercamiento más adecuado y su
verdadera relevancia como biomarcador radicaría en la cuantificación de todas las
concentraciones de ET-1: libres en plasma y asociadas a tejidos y receptores (14,15).
Es por ello que ha pasado a considerarse la determinación del precursor de la ET-1, la Big ET-
1, como un marcador mucho más útil al presentar una vida plasmática mayor y constituir un
reflejo de la ET-1 liberada. Aun así, la cuantificación selectiva de Big-ET-1 constituye únicamente
una solución parcial y no una resolución del problema, puesto que su período de
semidesintegración biológica es también relativamente corto (20-25 minutos) y, sólo representa
una concentración plasmática momentánea, sin reflejar las concentraciones fisiológicas reales de
ET-1. Por consiguiente, la cantidad total de endotelina fisiológicamente activa resulta igualmente
infravalorada al cuantificar Big-ET-1.
Para zanjar estas limitaciones, los estudios actuales optan por la “determinación indirecta de
la formación de endotelinas”, basada en la cuantificación de los precursores de origen de ET-1,
principalmente la preproendotelina-1. Estos ensayos (tipo sándwich y de metodología similar a
los anteriores) se dirigen contra epítopos de fragmentos estables en plasma de la región C-
terminal de la preproendotelina-1; dichos fragmentos no contienen secuencias de aminoácidos ni
de la ET-1 ni de la Big-ET-1. A falta de estudios más completos, parecen estar arrojando resultados
muy satisfactorios (14,15).
Moléculas de adhesión
La adhesión de los leucocitos circulantes al endotelio vascular es el paso fundamental para
su extravasación durante el proceso de inflamación que acontece en la aterogénesis. Las células
endoteliales son las encargadas de regular este movimiento de leucocitos hacia el subendotelio a
través de moléculas de adhesión (CAM) inducidas por las citoquinas durante la lesión inflamatoria.
Actualmente se conocen diversas CAM, que se agrupan fundamentalmente en dos familias:
la familia de las selectinas, denominadas así por su similitud estructural con las lectinas, y las
proteínas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas, como las moléculas de
adhesión vascular (VCAM-1) y las moléculas 1, 2 y 3 de adhesión intercelular (ICAM- 1, 2 y 3). Las
CAM actúan como ligandos de las integrinas presentes en las membranas de los leucocitos.
En cultivos celulares se ha observado que las concentraciones aterogénicas de LDL (> 160
mg/dl) incrementan la expresión de las CAM, incrementándose la adhesión de monocitos. La fase
de rodamiento y adhesión resulta de la interacción específica entre los leucocitos y las CAM
expresadas por el endotelio. El rodamiento representa la interacción entre los leucocitos y las
selectinas, con la consiguiente adhesión en la que participan la ICAM y la VCAM. Los niveles de
expresión de las CAM en las lesiones ateroscleróticas son superiores a los de las áreas que no
presentan aterosclerosis. Esta sobrexpresión de CAM, junto con la inducción de sustancias
quimiotácticas, como la proteína quimiotáctica de monocitos (MCP-1), facilita la unión y
migración de los monocitos a las áreas de lesión (3).
Las selectinas son glicoproteínas de transmembrana, cuya familia se compone de tres tipos
que llevan el nombre de la célula en la que fueron identificadas en un principio: L-selectina
(leucocitos), P-selectina (plaquetas), y E-selectina (endotelio). Se caracterizan por presentar una
estructura que incluye un dominio tipo lectina, seguido de un dominio tipo factor de crecimiento
epidérmico (EGF-like), dos o más dominios tipo proteína reguladora del complemento, una región
transmembranal y una región intracitoplasmática corta en el extremo carboxilo terminal (6).
Las ICAM y VCAM pertenecen, como se ha mencionado, a la superfamilia de las
inmunoglobulinas. Esta familia de moléculas de adhesión exhibe un amplio espectro de diversidad
estructural, pero todos sus miembros se caracterizan por contener en su porción extracelular
dominios similares a los de las inmunoglobulinas (dominios Ig).
El dominio extracelular de las CAM puede liberarse al torrente circulatorio, y parece que
sus niveles de expresión en la superficie celular se correlacionan con los valores de sus formas
solubles. Por ello, actualmente se evalúan los valores de los fragmentos solubles de estas
moléculas como marcadores válidos de evolución de las lesiones ateroscleróticas y los procesos
patológicos asociados, como diabetes, dislipemias o hipertensión (3,6,8).
106
Determinación de moléculas de adhesión
La cuantificación de las moléculas de adhesión circulantes en plasma se realiza mediante
métodos de ELISA similares a los descritos para ET-1, es decir, inmunoensayos heterogéneos en
microplacas tipo sándwich asociados a HRP como enzima conjugada y con tetrametilbenzidina
como cromógeno.
Aunque originalmente estas moléculas se expresan unidas a membrana plasmática, distintos
procesos las liberan al plasma utilizándose este tipo de muestras para cuantificar sus niveles. Así,
las formas solubles de E-selectina (sE-selectina), ICAM-1 (sICAM-1) y VCAM-1 (sVCAM-1) se
encuentran en sangre probablemente derivadas de la escisión proteolítica de las moléculas
expresadas en la superficie como parte de sus mecanismos de inhibición. La P-selectina soluble
(sP-Selectina) parece ser secretada directamente por megacariocitos y células endoteliales como
una forma circulante de la proteína, carente del dominio transmembrana de anclaje y con posibles
funciones paracrinas (16).
circulantes
La función vascular no sólo depende de las células que residen dentro de la pared vascular,
sino que también parece estar modulada por células endoteliales derivadas de células madre
procedentes de la médula ósea. Estas células madre se denominan células progenitoras
endoteliales (EPC), y se ha objetivado que mejoran la angiogénesis, promueven la reparación
vascular, mejoran la función endotelial, inhiben la aterosclerosis e incrementan la función
ventricular tras infarto agudo de miocardio. Cuando en los vasos sanguíneos se produce isquemia,
el factor inducible por hipoxia 1-α (HIF-1α), junto con citoquinas pro-angiogénicas, participan en
la movilización y reclutamiento de estas células desde la médula ósea hasta el tejido isquémico.
Las EPC proceden, por tanto, de precursores hemopoyéticos pluripotenciales (17).
También se han descrito las denominadas células endoteliales circulantes (CEC), asociadas
con lesión vascular. Parece claro que el número de estas células encontradas en la circulación se
relacionan directamente con la lesión en el revestimiento vascular, pero su relación cuantitativa
con la extensión de dicho daño no está aún bien definida. El mecanismo exacto por el cual las CEC
se desprenden a la circulación en estas condiciones no está bien dilucidado, pero se estipula que
pueda deberse a un proceso mediado por activación de las células endoteliales que causa de
forma controlada su liberación hacia la circulación (18).
Por otro lado, la liberación de micropartículas endoteliales (MPE) se ha documentado en
pacientes con diferentes enfermedades vasculares incluyendo el síndrome coronario agudo. Las
MPE son pequeñas vesículas de membranas liberadas desde las membranas plasmáticas hacia el
107
espacio extracelular. Diferentes tipos celulares como las células B, células T, monocitos y células
endoteliales liberan micropartículas tanto in vivo como in vitro. La formación de micropartículas
es una función de las células, pero está incrementada en condiciones que producen estrés celular,
apoptosis o alteración de la viabilidad celular. El interés en el estudio de las MPE radica en sus
propiedades procoagulantes, su papel en procesos inflamatorios y su importante participación
como componentes de la placa aterosclerótica (18,19).
Determinación por el laboratorio de CEC y CEP
La cuantificación precisa de CEC no es sencilla. Esto es debido principalmente a su baja
concentración en la circulación y a la diferente morfología que las células pueden presentar. Sin
embargo, su detección ha mejorado mediante el desarrollo de técnicas de
separación/concentración y sistemas de etiquetado con marcadores específicos. Las técnicas
actuales de enriquecimiento incluyen la exclusión de eritrocitos y leucocitos, centrifugación por
gradiente de densidad (Ficoll, Percoll…) y la captura por esferas inmunomagnéticas asociadas a
CD146. El sistema de marcaje basado en anticuerpos monoclonales de células endoteliales (mAbs
HEC 19 y S-Endo 1 principalmente) permite la identificación específica de las CEC por técnicas
de inmunofluorescencia indirecta, inmunocitoquímica o citometría de flujo (18,19).
Aunque CD146 se ha destacado como el marcador más extendido para la identificación de
CEC, esta molécula también se ha descrito en trofoblasto, células madre mesenquimales, tejido
periodontal, y algunos cánceres, como el de próstata y el melanoma, de modo que su uso exige
una cierta precaución.
El método por inmunoesferas y centrifugación en gradiente de densidad parece ser el más
específico en la identificación de CEC, mientras que la citometría de flujo puede resultar más
sensible.
La técnica con inmunoesferas utiliza perlas inmunomagnéticas (diámetro de 4,5 µm)
recubiertas con el anticuerpo anti-CD146 que forman rosetas con las células endoteliales, éstas
se recuperan con un imán, se procede a su marcaje y se realiza un recuento, normalmente,
mediante microscopía de fluorescencia. Pueden utilizarse otros marcadores endoteliales
adicionales (doble marcaje) para aumentar la especificidad, y adicionarse albúmina y EDTA que
minimice la auto-agregación de las CECs (18).
La alternativa más común es la citometría de flujo, siendo también la técnica de referencia
en la actualidad para la identificación de CEP y MPE. La muestra se marca con anticuerpos
monoclonales unidos a fluorocromos que reconocen antígenos de superficie concretos y el
estudio de patrones de fluorescencia permite diferenciar y cuantificar las células o vesículas de
interés (CEC, CEP o MPE). Sus ventajas incluyen la rapidez de análisis, la determinación
108
multiparamétrica, y la capacidad de detectar subpoblaciones. El principal problema radica en que
la descripción de CEC, CEP y MPE en cuanto a la expresión de antígenos de superficie celular está
aún muy discutida y no son fáciles de definir (19).
Aun así, en los numerosos estudios hasta la fecha (17,18,19) los marcadores de superficie
que parecen ser más empleados incluyen:
Para CEC: CD34, CD45, CD31, CD146 y AC133.
Para CEP: CD133, CD34, KDR y VGFR.
Para MPE: CD31 y CD42.
Pero como se ha comentado no son fáciles de precisar y aún es necesario alcanzar una
definición unánime.
4. TERAPIAS POTENCIALES
El control de la función endotelial está emergiendo como la llave de terapias que pueden interferir
en el desarrollo de la arteriosclerosis y sus complicaciones clínicas. La disfunción endotelial puede
mejorar mediante diversas intervenciones (20):
- Disminución de los valores plasmáticos de LDL mediante dieta o fármacos
hipolipemiantes: diversos estudios sugieren que las estatinas juegan un importante papel
en el tratamiento de la disfunción endotelial mediante la reducción de la adhesión de
células inflamatorias y la mejora de las funciones antiinflamatorias y antitrombóticas.
- Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECAS): los IECAS aumentan la
vasodilatación dependiente del endotelio, tanto en la circulación coronaria como en la
periférica.
- Betabloqueantes: se han reportado mejoras de la función endotelial con nevibolol y
carvedilol mediado por la activación de los receptores β3 en el caso del nevibolol y por
efecto antioxidante en el caso del carvedilol.
- Modificaciones del estilo de vida: abandono del hábito tabáquico, pérdida de peso,
cambios en la dieta y la actividad aeróbica de intensidad moderada.
5. CONCLUSIONES
Como se ha ido desarrollando a lo largo del tema, la disfunción endotelial es un proceso realmente
complejo para el que no existe una única forma de acercamiento. Es evidente que constituye un
proceso de base en la fisiopatología de muchas enfermedades cardiovasculares y sus fundamentos se
van dilucidando poco a poco.
109
En cuanto a una metodología de evaluación de la función endotelial, también se va avanzando
progresivamente en la mejora y el desarrollo de técnicas cada vez más eficientes. El principal
inconveniente radica en establecer una correcta organización en toda la batería de pruebas disponibles
y en los distintos enfoques que pueden abordarse en el estudio del proceso de disfunción endotelial.
Se espera que futuros estudios puedan ir sentado las bases para elaborar un protocolo práctico que
nos permita aprovechar el conocimiento y evaluación de la función endotelial para la práctica clínica
diaria.
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LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL PARA LA PRÁCTICA CLÍNICA

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