第三节 Oxidative phosphorylation

一 . 氧化磷酸化的机理

What is oxidative

phosphorylation

氧化磷酸化（ oxidative

phosphorylation ）是指细胞内伴随有机物氧化，利用生物氧化过程中释放的自由能，促使 ADP 与无机磷酸结合生成 ATP 的过程。

？

一 . 氧化磷酸化的机理

20 世纪 30 年代包括德国生物化学家、诺贝尔奖获得者 Meyerhof & Warburg 在内的许多生化学家对代谢过程中能量的产生和利用作了深入研究，发现无论在糖酵解或三羧酸循环等代谢过程中，都有伴随着 ATP 磷酸根的放出或 ADP

得到磷酸根的变化这类化学能量高效率的传递方式，指出腺苷三磷酸（ ATP ）是代谢中能量产生和利用的关键化合物。

一 . 氧化磷酸化的机理

1941 年 Fritz Lipmann 引入“高能磷酸键 ( ～

P)” 的概念。 1949 年美国生化学家 Eugene

Kennedy 和 Albert Lehninger 发现线粒体含有三羧酸循环和呼吸链所需要的全部酶系统，并且发现生物氧化与 ADP 磷酸化相偶联构成了氧化磷酸化。但是， NADH 的氧化和电子传递过程是如何与 ADP

磷酸化生成 ATP 反应偶联起来一直不清楚。

一 . 氧化磷酸化的机理

关于这一问题目前至少有三种假说

比较著名的假说有三个：

化学偶联假说

构象偶联假说

化学渗透学说

目前得到公认的是“化学渗透学说”。

这个假说是 1953 年由 Edward Slater 最先提出。假说认为在 NADH 氧化和电子传递过程中产生了一种活泼的高能共价中间物，通过此中间物进一步氧化产生的能量来驱动 ATP 的合成。这一假说完全是依据底物水平磷酸化机理提出的，例如在糖酵解中，由 3-磷酸甘油醛脱氢酶催化的反应就产生了一种活泼且具有高能磷酸基转移势能的酰基磷酸化合物 1 ， 3- 二磷酸甘油，随后其分子中的高能磷酸基团在磷酸甘油酸激酶的作用下被转移到 ADP 生成 ATP 。虽然在糖酵解过程中存在这种例证，但是人们至今未能在线粒体中分离到与之相类似的高能共价中间物。

化学偶联假说 Chemical coupling hypothesis

这个假说是 1964 年由 P.D.Boyer 提出。该假说认为作为电子传递体的蛋白质有两种不同的构象：低能构象和高能构象。电子传递的结果使低能构象转变为高能构象，后者再将能量传递给 F0-F1-ATP 合成酶，使

之也发生构象变化，从而推动 ADP 磷酸化形成ATP 。这种假说有一定的实验根据，在电子沿呼吸链流动时，观察到线粒体内膜发生迅速的物理变化，但由于测定构象比较困难，支持这个假说的实验太少。

构象偶联假说 Conformational coupling hypothesis

英国生物化学家 Peter D Mitchell 在 1961年提出化学渗透假说，由于该假说提出后逐渐拥有越来越多的实验证据，因而成为目前解释氧化磷酸化偶联机理最为公认的一种假说，并且 Peter

Mitchell 因提出该假说而获得了 1978 年的诺贝尔化学奖。

化 学 渗 透 学 说 Chemiosmotic hypothesis

电子传递体在线粒体内膜上有着不对称分布，传氢体和传电子体交替排列，催化是定向的；

Chemiosmotic hypothesis—key points

一 . 氧化磷酸化的机理

复合物 I 、 III 、 IV 将 H+ 从基质内泵向内膜的外侧，而将电子传向其后的电子传递体；

化学渗透学说

一 . 氧化磷酸化的机理

内膜对质子不具有通透性，这样在内膜两侧形成质子浓度梯度，这就是推动 ATP 合成的原动力；

化学渗透学说

一 . 氧化磷酸化的机理

当存在足够高的跨膜质子化学梯度时，强大的质子流通过 F1-F0-ATPase 进入基质时，释放的自由能推动 ATP 合成。

化学渗透学说

一 . 氧化磷酸化的机理

The

reconstituted

vesicles

containing ATP

synthase and

bacteriorhodopsi

n, a light-driven

proton pump,

reported by

Efraim Racker

and Walther

Stoeckenius in

1974

化学渗透学说

(min)

0 30 60 90 120

A 4

92

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02ATP

Gramicidin

AO

ADP + P

AO

H+

AOH+

ATP

i

一 . 氧化磷酸化的机理

F1 ：球形头部，伸

入线粒体基质，由五种亚基组成 33 , 是

ATP 合酶的催化部分；

F0: 横贯线粒体内膜

，含有质子通道，由十多种亚基组成。位于 F1

与 F0 之间的柄含有寡霉

素敏感性蛋白。

F1-F0-ATPase 复合物

一 . 氧化磷酸化的机理

由上述化学渗透假说可知，该模型必需具备两个条件：一是线粒体内膜必须是质子不能透过的封闭系统，否则质子梯度将不复存在；二是要求呼吸链和 ATP合酶在线粒体内膜中定向地组织在一起，并定向地传递质子、电子和进行氧化磷酸化反应。

重 要

一 . 氧化磷酸化的机理

目前这两方面都获得了一些实验证据，例如能携带质子穿过线粒体内膜的物质（如 2,4- 二硝基苯酚）可破坏线粒体内膜对质子的透性壁垒，使质子电化学梯度消失。

另外根据测算，膜间隙的 pH 较内膜低 1.4 个单位，并且线粒体内膜两侧原有的外正内负跨膜电位升高。

重 要

一 . 氧化磷酸化的机理

F1-F0-ATPase 复合物

P/O( 磷氧比 ) ：在生物氧化过程中，伴随 ADP 磷酸化所消耗的无机磷酸的磷原子数与消耗的分子氧的氧原子数之比。即每消耗 1个氧原子所产生的 ATP的分子数。

二 . 氧化磷酸化的 P/O比

测定结果表明：

NADH经呼吸链完全氧化时， P/O 为 3 ，即 1分子的 NADH 通过呼吸链将电子最终传递给 O2 可产生 3 个 ATP；

二 . 氧化磷酸化的 P/O比

二 . 氧化磷酸化的 P/O比

FADH2 经呼吸链完全氧化时， P/O 为 2 ，即 1分子的 FADH2 通过呼吸链将电子最终传递给 O2可产生 2 个 ATP 。

为什么？

二 . 氧化磷酸化的 P/O比为什么？

二 . 氧化磷酸化的 P/O比

但是 , 近年来很多实验结果都证明，以 NADH 作

为电子供体时，测得的 P/O 比值大于 2 。以琥珀酸作为电子供体时，侧得的 P/O 比值大于 1 ；所以 P/O

比值不一定是整数。例如， - 羟丁酸经过 NADH 途径的 P/O 比值为 2.4~2.6 ，产生的 ATP 数目为 2.5

；而琥珀酸经过 FADH2 的 P/O 比值为 1.7 ，产生的

ATP 数目为 1.5 。

二 . 氧化磷酸化的 P/O比

因此，虽然电子转移伴随着 ATP 的合成，但不能仅以 P/O 比值作为 ATP 生成数的依据，而应考虑一对电

子从 NADH或 FADH2 传递到氧的过程中，有多少质

子从线粒体基质泵出，以及有多少质子必须通过 ATP

合酶返回基质以用于 ATP 的合成，这样才能从本质上确定 ATP 的生成数量。

二 . 氧化磷酸化的 P/O比

目前被广泛接受的观点是： ATP 、 ADP 和无机磷酸通过线粒体内膜的转运是由 ATP-ADP载体和磷酸转位酶催化的。已知每合成 1 个 ATP 需要 3 个质子通过 ATP 合酶。与此同时，把一个 ATP 分子从线粒体基质转运到胞液需要消耗 1 个质子，所以每形成1 个分子的 ATP 就需要 4 个质子的流动。因此，如果一对电子通过 NADH 电子传递链可泵出 10 个质子，则可形成 2.5 个分子 ATP；如果一对电子通过

FADH2 电子传递链有 6 个质子泵出，则可形成 1.5

个 ATP 分子。

三 . ATP 酶 - 构象偶联假说

该假说是 1964 年由美国生物化学家 Paul

Boyer 最先提出，他认为电子传递过程中，线粒体内膜上的蛋白质组分发生了构象变化，转变成一种高能形态。这种高能形态通过将能量转移到 ADP 合成ATP 后，又得以恢复其原来的构象。随着人们对ATP 合酶结构的研究和认识不断深入，在构象偶联假说的基础上形成了 ATP 合酶结合变化和旋转催化假说。

三 . ATP 酶 - 构象偶联假说

ATP 合酶结合变化和旋转催化假说认为， ATP 合酶与底物核苷酸的作用是按照结合变化机理进行的。

构成 ATP 合酶头部的 α3β3 亚基构成 3 个催化部位，

中部的 γε亚基在质子推动力的驱动下相对于 α3β3 作

旋转运动。由于 3 个 β亚基与 γε亚基的不对称接触，使其分别处于三种不同的状态，即无核苷酸结合的空置状态（ O ）、结合 ADP+Pi 的松散结合状态（ L ）和结合 ATP 的紧密结合状态（ T ）。

Rotation of leads to sequential binding changes

for each subunit.

三 . ATP 酶 - 构象偶联假说

当质子推动力驱使 H+ 经 F0 质子通道进入时， F0

组分质子化而发生构象改变，积累足够的扭矩力，推

动 γε 相对 α3β3 旋转 120° ，使处于 T态的催化部位

释放 ATP 变成 O 态，同时 L态催化部位上生成 ATP

变为 T态， O 态结合 ADP+Pi 变为 L态

Boyer

The binding-change model was elegantly supported by two other

experimental observations

• X-ray crystallography revealed that the three subunits of F1 assumes three different conformations, with bound ADP, ATP analog, or empty respectively.

• Rotations of the subunit and the c -ring of the F1 unit in three discrete steps of 120o (as being powered by ATP hydrolysis catalyzed by the subunits) have been directly observed using fluorescence microscopy (1997)

Rod-shaped subunit.

ADP App(NH)p

Empty

Structure determination indicates that indeed the three subunits

are inequivalent in conformation! (John Walker, 1994)

T (tight)

L (loose)

O (open)

Rotation of the subunit and the ring of c subunitsin the FoF1 complexwas observed byin vitro studies using fluorescencemicroscopy (K. Kinosita, 1997)

33, with the subunit linked toan actin filamentwill also rotatewhen ATP is added.

Fluorescencetlylabeled

The world’s smallestmolecular motor:rotational catalysis.

Model on the rotation of the c-ring in ATP synthase:two half-channels for H+ on the a subunit hasbeen proposed.

(3ATP made per 10-14 protons transported:~3H+/ATP.)

Asp

1. 解偶联剂

解偶联剂（ uncoupler ）是指那些不阻断呼吸链的电子传递，但能抑制 ADP 通过磷酸化作用转化为 ATP

的化合物。它们也被称为氧化磷酸化解偶联剂。

最早发现的一个解偶联剂是 2, 4- 二硝基苯酚（ 2, 4-dinitrophenol, DNP ），它是一种弱酸性亲脂化合物，在 pH7条件下， DNP以解离形式存在，不能通过线粒体内膜。但是在酸性环境中， DNP 转变为脂溶性的非解离形式，可携带质子透过线粒体内膜。这样就破坏了电子传递形成的跨膜质子电化学梯度

四、氧化磷酸化的抑制

1. 解偶联剂

在解偶联剂存在时，电子沿呼吸链的传递能正常进行，但不能偶联产生 ATP ，这样就使电子传递所产生的自由能以热能的形式被消耗。由于 DNP 解偶联剂只专一性地抑制与呼吸链相偶联的 ATP 的形成过程，因此，它不会影响底物水平的磷酸化。

四、氧化磷酸化的抑制

这类化合物直接作用于 ATP合酶复合体，从而抑制 ATP的合成。

它们使膜外质子不能通过 ATP合酶复合体返回膜内，使膜内质子继续泵出到膜外显然越来越困难，最后不得不停止，所以这类抑制剂间接抑制了电子传递和分子氧的消耗。

寡霉素 属于此类抑制剂，它与 F0 的一个亚基

结合而抑制 F1 。

2. 氧化磷酸化抑制剂四、氧化磷酸化的抑制

3. 离子载体抑制剂

离子载体抑制剂（ ionophore ）是指那些能与某种离子结合，并作为这些离子的载体携带离子穿过线粒体内膜的脂双层进入线粒体的化合物。

这类抑制剂均是脂溶性物质，它们与解偶联剂的区别在于它们能结合除 H+ 以外的其它一价阳离子，例如缬氨霉素（ Valinomycin ）可结合 K+ ，短杆菌肽可结合K+ 、 Na+ 和其它一价阳离子穿过线粒体内膜。因此离子载体抑制剂增大了线粒体内膜对一价阳离子的通透性，从而破坏了膜两侧的电位梯度，最终导致氧化磷酸化过程被抑制。

四、氧化磷酸化的抑制

五 . 电子传递抑制剂

凡是能够阻断电子传递链中某部位电子传递的物质称为电子传递抑制剂，由于阻断部位物质的氧化还原状态能被测定，所以利用电子传递抑制剂是研究电子传递顺序的重要方法，下面列举了若干种常见的重要的电子传递抑制剂。

1、鱼藤酮等 阻断从 NADH 向 CoQ的传递

鱼藤酮（ rotenone ）、安密妥（ amytal ）、杀粉蝶菌素（ piericidine ）等。它们的作用是抑制复合物 I ，阻断电子由 NADH 向 CoQ 的传递

，但不影响 FADH2 到 CoQ 的氢传递。鱼藤

酮是一种极毒的植物毒素，常用作杀虫剂。

五 . 电子传递抑制剂

2、抗霉素 A 阻断复合物 III 的电子传递

抗霉素 A （ antimycin A ），它是从灰色链球菌分离出的一种抗生素，抑制复合物Ⅲ的电子传递，即阻断细胞色素还原酶中电子的传递，从而抑制了电子从还原型的

CoQ （ QH2）到细胞色素 c1 的传递。

五 . 电子传递抑制剂

3、氰化物、叠氮化物、 CO、H2S

阻断复合物 IV向 O2 的传递

氰化物（ cyanide, CN －）、叠氮化物（ azide, N3

－）、一氧化碳（ carbon

monoxide, CO ）和硫化氢 ( hydrogen

sulphide ) ，这些抑制剂均能阻断电子在细胞色素氧化酶的传递，即阻断细胞色素 aa3 至 O2 的电子传

递，其中氰化物（ CN －）和叠氮化物（ N3－）能与

血红素 a3 的高铁形式（ ferric form ）作用而形

成复合物 , 而一氧化碳（ CO ）则抑制血红素 a3 的亚铁形式（ ferrous form ）。

五 . 电子传递抑制剂

五 . 电子传递抑制剂

线粒体外的 NADH通过间接的途径 —— 穿梭机制进入线粒体。动物细胞内已知有两个穿梭系统：

磷酸甘油穿梭系统，主要存在于肌细胞；

苹果酸穿梭系统，主要存在于肝细胞。

1. 动物细胞内六、线粒体穿梭系统

为什么存在穿梭系统于？

磷酸甘油穿梭系统

N A D H + H +

N A D+

胞 液

- 磷 酸 甘 油脱 氢 酶

磷 酸 二 羟丙 酮

磷 酸 二 羟丙 酮 - 磷 酸 甘 油

线 粒 体 内膜

基 质FA D H 2 FA D

C o Q b c 1 c a a 3 O 2

- 磷 酸 甘 油

- 磷 酸 甘 油脱 氢 酶

线 粒 体 外膜

六、线粒体穿梭系统

磷酸甘油穿梭系统

通过 3-磷酸甘油与 DHAP之间的转换，胞液中的 NADH 间接地转变为内膜上的FADH2 ，经由内膜上的 3-磷酸甘油脱氢酶 (也是以 FAD为辅基的黄素蛋白 )进入 FADH2呼吸链。

这种方式不通过复合物Ⅰ ,因此只生成2分子 ATP 。

六、线粒体穿梭系统

苹果酸穿梭系统

谷草转氨酶，苹果酸脱氢酶，以及一系列的透性酶。

通过苹果酸与草酰乙酸之间的转换，间接地将细胞质中的 NADH 转变为线粒体内的NADH，从而进入 NADH呼吸链。

这种方式要通过复合物Ⅰ。

六、线粒体穿梭系统

谷 氨 酸 草 酰 乙 酸 N A D H + H+

天 门 冬 氨酸 苹 果 酸 N A D+

- 酮 戊 二 酸 天 门 冬 氨酸 苹 果 酸 N A D+

谷 氨 酸 草 酰 乙 酸 N A D H + H+

苹 果 酸 脱氢 酶

苹 果 酸 脱氢 酶

电 子 传 递链

胞 液

线 粒 体 内膜

基 质

草 酰 乙 酸

草 酰 乙 酸

- 酮 戊 二 酸

苹果酸穿梭系统

六、线粒体穿梭系统