免疫共沉淀技术验证蛋白质相互作用的研究

翟华立

2013-7-25

免疫共沉淀技术原理

hCLP46 与 calnexin 相互作用研究背景

hCLP46 与 calnexin 相互作用研究方法

结果分析

讨论与展望

目录

Co-Immunoprecipitation(CO-IP)• a classical method used for research protein-protein interaction on the basis of specificity of antibody to antigen.• an effective method to confirm two kinds of proteins endogenous interaction in cell.• It utilizes antibody to precipitate the corresponding specific molecule meanwhile the other molecules with specific binding to the molecule will be precipitated.• be used to validate proteins specific binding.

免疫共沉淀技术原理

• 基本原理是：在非变性条件下，将细胞裂解，细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行 SDS-PAGE 及 Western blotting 分析 .

免疫共沉淀技术原理

免疫共沉淀技术原理图解

hCLP46 与 calnexin 相互作用研究背景 细胞中 DNA 复制和转录、蛋白质的翻译、剪切 和分泌、细胞周期的调控、信号传导途径和中间 代谢等都受到蛋白质相互作用的调控，因此，研 究蛋白质的相互作用具有十分重要的意义。 以往的 CO-IP 研究主要是蛋白质紧密结合的相

互 作用，对于短暂的或较弱的相互作用研究较少。 通过研究 hCLP46 与 calnexin 的相互作用，为

开展蛋白质弱的相互作用的验证提供参考。

hCLP46 与 calnexin 相互作用研究方法

Step 1 Step 2

Step 4 Step 3

Western Blotting 检测

细胞培养 CO-IP预实验

CO-IP

实验

通过对免疫共沉淀不同影响因素的优化探究最佳的较弱蛋白质相互作用的实验条件

方法

CO-IP 预实验

Co-IP的基本步骤Co-IP的基本步骤

对细胞裂解液中各成分浓度、抗体用量及抗体的结合

时间、 hCLP46 蛋白的量以及交联剂 DSP 等影响因素

进行调整和改进。

1. 收集细胞，用磷酸缓冲液清洗。

2. 细胞裂解液冰上裂解，离心，收集上清液，加标签抗体混合旋转。

3. 加 Protein G 混合，加SDS 煮沸处理。

4. 离心，电泳Western Blottimg检测蛋白质相互作用。

CO-IP 操作步骤

CO-IP 实验用预冷并添加 0.1mmol/LCaCl2 和MgCl2 的磷酸缓冲液洗涤细胞 3 次，弃磷酸缓冲液后加入交联剂 DSP1mmol/L, 冰浴 2h, 每隔 20min 轻晃细胞培养皿。

弃 DSP 后，加入 20mmol/L pH7.4Tris-HCl,冰浴 15min 以终止 DSP 反应。

磷酸缓冲溶液洗涤细胞 3 次，每皿 800μL 预冷的细胞裂解液，冰上裂解 30min.

4 ,13500r/min℃离心 20min 。上清液转移至新离心管，加入 3.6μg Myc 抗体， 4℃ 混合旋转 2h 。

再加入预清洗的30 μL Protein G breads, 4℃混合旋转 2h 。孵育后 4℃ 静置30min 。

4℃,2500r/min离心 5min ，不含 PMSF 的细胞裂解液洗涤 beads3 次，每次 1mL 。加入SDS 煮沸 10min, 离心后电泳。

Western Blotting 检测 calnexin 与 hCLP46的相互作用

Western Blotting 检测 calnexin 与 hCLP46 的相互作用

• 用 12%SDS-PAGE 胶对蛋白样品进行电泳，每孔上样 20μL 。分离后， 200mA 电转至 PVDF 膜 , 上。含 5% 脱脂奶粉的 TBST(20mmol/L Tris pH7.6,150mmol/LNaCl,0.1% tween-20) 室温封 , 闭 PVDF 膜1h 。含 3% 脱脂奶粉的 TBST 按 1:2000, 稀释 Myc抗体，按 1:100 稀释 calnexin 抗体。

• 4℃ 杂交过夜。 TBST 洗膜 3 次，每次 10min, 含 5% 脱脂奶粉的 TBST 按 1:2000 稀释偶联 HRP 的二抗，室温杂交 1h

• TBST 洗膜 3 次，每次 10min ， TBST 再洗膜 3 次，每次 5min,Millipore 发光液按 1:1 混合，滴在膜上显色 10s, 暗室曝光。

结果分析

• 裂解液中各成分浓度对免疫共沉淀的影响

• 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP anti-Myc 沉淀 未检测到沉淀中存在 calnexin ．

• Fig.1 Damage of high concentrations of salt and partial alkaline environment to interaction between hCLP46 and calnexin

结果分析

• 抗体用量对免疫共沉淀的影响

• 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP control ， 293Trex 细胞做对照 ; 4: IP anti-Myc 沉淀，未检测到沉淀中存在 calnexin ．

• Fig.2 No interaction between hCLP46 and calnexin with low concentration of antibodies

结果分析

• 抗体用量对免疫共沉淀的影响

• 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP control ， 293Trex 细胞做对照 ; 4: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在 calnexin ．

• Fig.3 Interaction between hCLP46 and calnexin after exalting the dosage of antibody

结果分析

• hCLP 蛋白量对免疫共沉淀的影响

• 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在 hCLP46; 4: IP anti-Myc 沉淀，未检测到沉淀中存在 calnexin

• Fig.4 Damage of too high hCLP46 expression to interaction between hCLP46 and calnexin

结果分析

• 交联剂 DSP 对免疫共沉淀的影响

• 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在 hCLP46; 4: IP control ， 293Trex 细胞做对照 ; 5: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在 calnexin ．

• Fig.5 Interaction between hCLP46 and calnexin stabilized by cross link reagent DSP

结果分析• 采用优化和筛选后的最佳免疫共沉淀条件，得到

了 hCLP46 蛋白和 calnexin 的相互作用。

• 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP control ， 293Trex 细胞做对照 ; 4: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在 calnexin ．

• Fig.6 Interaction between hCLP46 and calnexin with best conditions of co-immunoprecipitation

讨论讨论

高浓度的盐离子和偏碱性的微环境会破坏 hCLP46 和 calnexin 的相互作用。 Nacl 的浓度由 150mmol/L 降至 100mmol/L ， PH 由 8.0 降至 6.8 ，NP40 由 1% 降至 0.5% 。

增加抗体用量、减少 hCLP46 蛋白量。抗体用量采用 0.48X10-2 μg / μL ，四环素用量由 1 μg / mL 降至 0.5 μg / mL 。

使用交联剂 DSP 稳定 hCLP46 和calnexin 的相互作用，在后续洗脱的极端条件下使得 hCLP46-calnexin 蛋白复合体不会发生解聚。

讨论与展望

讨论与展望注意事项1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所

有蛋白质－蛋白质相互作用。2. 最需要注意点是抗体的性质，特别是多抗的特异性是问题。

抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP 反应。

3. 低温下进行实验。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂。

4. 考虑抗体 / 缓冲液的比例。（抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在 beads 上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释）

5. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的。

讨论与展望

• 通过条件的优化和筛选得到 hCLP46 与 calnexin

相互作用的适宜条件，二者的相互作用需要温和 的细胞裂解条件、中性的环境、二者的蛋白表达 量保持相当、交联剂 DSP 的稳定。• 通过对 hCLP46 与 calnexin 蛋白相互作用的 Co-I

p

影响因素的研究探讨，为研究蛋白质的相互作用提供了参考。

应用实例：• Development of a Flow Cytometric Co-Immunoprecipitation

Technique for the Study of Multiple Protein—Protein Interactions and Its Application to T-Cell Receptor Analysis

• Identification of protein complexes from co-immunoprecipitation data

• Microsphere-based co-immunoprecipitation in multiplex • Verificafion of the Interaction between SET and eEFl Al in

Hnlnan Liver Cells by Co-immunoprecipitation• Determining the Target Genes of RIN Transcription Factor

by Chromatin Immunoprecipitation• Screening of HMGB4 interacting Proteins Using Co-immun

oprecipitation Technology and Mass Spectrometric Analysis

讨论与展望

讨论及展望应用前景：1.寻找新的相互作用蛋白2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用3.优化免疫共沉淀的实验条件，探究更多的蛋白质弱的相互作用。4.与其他验证蛋白质相互作用的新技术联用，研究具有重要意义的蛋白质短暂的、弱的相互作用。