Post on 12-Jan-2016
description
Úvod do studia cytologie a histologie
Základní pojmy. Metody studia buněk a tkání. Histologický preparát. Odběr, fixace, značení a zpracování vzorků.
Základy mikroskopování.
Ústav histologie a embryologieMUDr. Blanka Zajícová
Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241
• Histologické vyšetření:– součást klinických vyšetřovacích metod– umožňuje stanovit diagnózu, rozpoznání nemoci je
předpokladem správné léčby pacienta– metoda vědecké práce
• Histologická technika– soubor postupů, metod a přístupů, které vedou ke
zhotovení preparátu
Preparát: • tenký řez tkáně (pro světelnou mikroskopii 6-8µm)
• zpracován histologickou metodou
• zamontován pod krycí sklo
• připraven ke studiu pod světelným mikroskopem
Odběr materiáluZpůsoby odběru:
1. Nekropsie – z mrtvého organismu, max. 12-24 h po smrti2. Biopsie – ze živého organismu (peroperační biopsie)
Odběr musí být rychlý, šetrný a bezpečný pro pacienta.
Excize – vyříznutí skalpelem, žiletkou, nesmí se příliš poškodit tkáň
Punkce – širší jehla se stříkačkou, např. kostní dřeň, játra, ledviny
Mikroabraze – kyreta, vyšetření endometria
Stěr, nátěr – tamponem nebo štětečkem se oloupou buňky, např. poševní cytologie
Endoskopický odběr, laparoskopie
Odebrané vzorky musí být okamžitě fixovány, označeny.
Průvodní list k zásilce histologického materiálu.
Odběr materiáluSmrt – přerušení koordinační a obranné činnosti organismu, zásobení živinami
a kyslíkem, odvodu metabolitů
Autolýza – samovolný rozklad tkáně způsobený nekoordinovanou činností vlastních endogenních enzymatických systémů
Hniloba – rozklad tkáně vnějšími činiteli (exogenní enzymy např. z bakterií, plísní)
Autolýza i hniloba porušují strukturu a barvitelnost vzorku, takový vzorek nelze hodnotit. Zabránit znehodnocení lze rychlou fixací vzorku.
Zásady odběru materiálu:
Odebírat čerstvý materiál
Šetrným způsobem
Řádně označit
Okamžitě fixovat
Vyplnit průvodku
FixaceFixace - rychlá a šetrná konzervace tkáně fixačními prostředky
1. Fyzikální fixační prostředky: ovlivňují transportní funkci vody a tím naruší enzymaticky katalyzované reakce v buňkách- fixace působením nízké teploty: rychlé zmrazení, „suchý led“, zkapalněné plyny (tekutý dusík)- fixace vysušením tkáně za nízké teploty (freezing-drying): mrazová sublimace, histochemie – průkaz aktivity enzymů- fixace mikrovlnným zářením
2. Chemické fixační prostředkyZaloženy na působení par nebo roztoků účinných látek – fixačních tekutin,které ve vhodné koncentraci vyvolávají jemnou a šetrnou denaturacienzymových proteinů.
3. Fyzikálně chemické metody - kombinace předchozích, např. chlazená fixační tekutina
Požadavky na fixaci- musí rychle působit v celém vzorku
- musí dobře uchovat strukturu buněk a tkání
- musí umožňovat další požadované zpracování, vyšetření
Z toho důvodu musí být vzorky přiměřeně velké: pro světelnou mikroskopii max. 1cm3, spíše ploténky.
Fixační tekutiny musí být nadbytek – 20 až 50x větší objem.
Vzorek se nesmí přilepit ke dnu ani plavat neponořený.
Dostatečně velké hrdlo nádobky, řádné uzavření.
Správné označení materiálu: nalepovací štítek + označení přímo ke vzorku. Nesmí dojít k záměně materiálu!
Žádanka na histologické vyšetření.
Fixační prostředkyFormol:
100% formol je 40% vodný roztok formaldehydu
Nejpoužívanější, dostupný, relativně levný.
Neutrální formol: neutralizovaný uhličitanem vápenatým (asi ¼ láhve), běžně používaná koncentrace je 10%
Rychle proniká do tkáně, je šetrný, zachovává strukturu, dobře se po něm barví. Fixujeme asi 24h, menší kousky i méně, nemůžeme přefixovat.
slaný formol (ředěný fyziologickým roztokem)
pufrovaný formol
Bakerova tekutina:
10% formol, chlorid vápenatý, voda
Vhodná pro průkaz lipidů, enzymů vázaných na membrány.
Fixační prostředky
Bromformol:
15% formol, bromid amonný
Použití u impregnačních metod, průkaz gliových buněk v nervové tkáni.
Bouinova tekutina:
25% formol, kys. pikrová, ledová kyselina octová - 5ml těsně před použitím
Po fixaci se dává do 80% etanolu. Nemůže přefixovat.
Nevýhody: nehodí se pro fixaci krevnatých orgánů, není vhodná pro průkaz lipidů
Fixační prostředkyFixační tekutiny se sublimátem:SUSA:sublimát (chlorid rtuťnatý), chlorid sodný, formol, destilovaná voda, kyselina
trichloroctová, před použitím ledová kyselina octováVýborná pro cytologii, kosti, zuby, chrupavky.Přenáší se rovnou do 90% etanolu, v němž se provádí jódování. Jódování – odstranění sublimátových sraženin (vznikají při fixaci) např. v Lugolově
roztoku či jódové tinktuře.
Zenkerova tekutina: sublimát, dvojchroman draselný, síran sodný, destilovaná voda, ledová kyselina
octová, NENÍ FORMOL!Fixace 24h, pak vypírání bločku v tekoucí vodě (24h), pak 70% etanol a jódování.
Fixační prostředky
Etanol:
použití zejména v neurohistologii – Nisslova metoda. Tkáň se značně
dehydratuje a extrahují se tuky – zvýraznění komplexů granulárního
endoplazmatického retikula (Nisslova substance), ta se pak barví např.
thioninem.
Aceton: 0-40C, enzymová histochemie
Osmiumtetroxid:
základní prostředek fixace v technice elektronové mikroskopie. Pro světelnou
mikroskopii se nehodí – proniká pomalu do tkáně.
ZaléváníPro běžné histologické vyšetření je potřeba odebraný a fixovaný materiál nakrájet
na řezy 4-8µm silné. Po prosycení tkáně tekutým zalévacím médiem médium
ztuhne a zvýší konzistenci (tvrdost, pevnost) vzorku, což umožní krájet tenké řezy.
1. Média rozpustná ve vodě:
celodal, želatina, metakrylátové umělé pryskyřice
Výhodná proto, že po fixaci a vyprání ve vodě můžeme přímo prosycovat, zalévat a tvrdit.
2. Média nerozpustná ve vodě:
parafin, celoidin, umělé epoxidové pryskyřice
Zalévání do těchto médií vyžaduje nejprve důkladné odvodnění vzorku a prosycení intermédiem (látka, která se mísí s odvodňujícím i zalévacím médiem). Teprve pak prosycujeme zalévacím médiem.
Zalévání do parafínuNejpoužívanější metoda, nevhodná ale k zalévání tuhých tkání, průkazu lipidů.Nevýhoda: smrštění tkáně při odvodnění, prosycování při vysoké teplotě
Etapy:A/ odvodnění tkáně – dehydrataceVzestupná řada alkoholů - etanolu (30-50-70-80-90-96-100%)- musí být šetrné, první použitá koncentrace závisí na obsahu vody ve tkáni (např.
embryonální tkáně začínají 30%, šlacha či zub i 90%, po fixaci Bouinovou tekutinou 80%, SUSA 90%)
- každá lázeň několik hodin, 2x se vyměňuje, celkem 1-2 dny
B/ prosycení tkáně intermédiem, projasněníbenzen, xylen, toluen, metylsalicylát, metylbenzoátIntermédium musí rozpouštět parafín a mísit se se 100% alkoholem. Vysoký index lomu, provádí se ve 3 lázních po 15 minutách.
C/ prosycení tekutým parafínem
parafín 560C
3 lázně parafínu při 560C, 1. lázeň asi 2-4h, 2. lázeň 4-6h, 3. lázeň 8-12h, celkem cca 24 hodin. Teplota nesmí překročit 580C.
D/ vlastní zalití
V zalévací komůrce, používá se výhradně zkvalitněný parafín (zahřátí na 800C, přidá se 3-5% včelího vosku a přefiltruje).
Bloček se přenese pinzetou, nahřátou preparační jehlou se zorientuje, nechá ztuhnout. Stále u vzorku musí zůstat značení.
E/ tvrzení média
Rovnoměrné tuhnutí při pokojové teplotě, úprava bločku, přitmelení na podložku. Pro rutinní zpracování histologických vzorků se používají zalévací automaty.
Zalévání do celoidinuPoužití: tuhé tkáně, šlachy, chrupavky,
zuby, odvápněné kosti
Výhoda: pokojová teplota
Nevýhody: trvá dlouho, nelze použít pro lipidy, nádobky musí být dobře uzavřené
Postup:
- odvodnění vzestupnou řadou alkoholů
- prosycení alkoholéterem
- vzestupná řada celoidinu (2%,4%,8%,10%)
- vlastní zalití do 10% celoidinu a tuhnutí
- tvrzení bločku v 70-80% alkoholu
Zalévání do želatinyPoužití: řídké struktury – placenta,
sliznice střeva, průkaz lipidů ad.
Postup:
- vyprání ve vodě
- prosycení želatinou ve stoupajících koncentracích (10% a 15% vodný roztok)
- vlastní zalití do 15% nebo 20% roztoku želatiny v komůrce
- tvrzení v 10-20% formolu
Krájení na kryostatu!
Krájení řezůKrájí řezy cca 6-10 µm
Sáňkový mikrotom: krájí parafín, celoidin, celodal
Rotační mikrotom: parafínové bloky – zhotovení sériových řezů, např. embryologie
Zmrazovací mikrotom – krájení tkání nezalitých, zalitých do želatiny
Napínání a lepení parafínových řezůŘezy se napínají na vodní hladině (povrchové napětí) a lepí na podložní sklo např:
• směsí bílku a glycerinu 1:1
Nelze použít např. pro imunohistochemii, impregnaci.
Na sklíčko se rozetře bílek s glycerinem, přenese se řez a podlije destilovanou vodou. Natažení na napínací ploténce. Označení podložního skla! Sušárna.
• roztokem želatiny 0,5 až 1%
Řezy se podlévají želatinou, sušárna, koagulace želatiny.
Světelný mikroskop
Mechanická část: stativ, stolek, šrouby
Optická část: objektiv, okulár
Osvětlovací zařízení: světlo, kondenzor, clony
Druhy objektivů: suché, imerzní
Rozlišovací schopnost mikroskopu
– dána jeho stavbou a optickými vlastnostmi objektivu
– je vyjádřena numerickou aperturou.
NA = n*sin α
– n je index lomu media, α je polovina otvorového úhlu objektivuRozlišovací schopnost je minimální vzdálenost 2 bodů, které můžemerozlišit, mezní hodnota u světelného mikroskopu při použití šikméhoosvětlení je asi 0,2μm.
Přednášková prezentace je určena výhradně pro osobní studium studentů 1. LF UK.