Úvod do studia cytologie a histologie

Základní pojmy. Metody studia buněk a tkání. Histologický preparát. Odběr, fixace, značení a zpracování vzorků.

Základy mikroskopování.

Ústav histologie a embryologieMUDr. Blanka Zajícová

Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241

• Histologické vyšetření:– součást klinických vyšetřovacích metod– umožňuje stanovit diagnózu, rozpoznání nemoci je

předpokladem správné léčby pacienta– metoda vědecké práce

• Histologická technika– soubor postupů, metod a přístupů, které vedou ke

zhotovení preparátu

Preparát: • tenký řez tkáně (pro světelnou mikroskopii 6-8µm)

• zpracován histologickou metodou

• zamontován pod krycí sklo

• připraven ke studiu pod světelným mikroskopem

Odběr materiáluZpůsoby odběru:

1. Nekropsie – z mrtvého organismu, max. 12-24 h po smrti2. Biopsie – ze živého organismu (peroperační biopsie)

Odběr musí být rychlý, šetrný a bezpečný pro pacienta.

Excize – vyříznutí skalpelem, žiletkou, nesmí se příliš poškodit tkáň

Punkce – širší jehla se stříkačkou, např. kostní dřeň, játra, ledviny

Mikroabraze – kyreta, vyšetření endometria

Stěr, nátěr – tamponem nebo štětečkem se oloupou buňky, např. poševní cytologie

Endoskopický odběr, laparoskopie

Odebrané vzorky musí být okamžitě fixovány, označeny.

Průvodní list k zásilce histologického materiálu.

Odběr materiáluSmrt – přerušení koordinační a obranné činnosti organismu, zásobení živinami

a kyslíkem, odvodu metabolitů

Autolýza – samovolný rozklad tkáně způsobený nekoordinovanou činností vlastních endogenních enzymatických systémů

Hniloba – rozklad tkáně vnějšími činiteli (exogenní enzymy např. z bakterií, plísní)

Autolýza i hniloba porušují strukturu a barvitelnost vzorku, takový vzorek nelze hodnotit. Zabránit znehodnocení lze rychlou fixací vzorku.

Zásady odběru materiálu:

Odebírat čerstvý materiál

Šetrným způsobem

Řádně označit

Okamžitě fixovat

Vyplnit průvodku

FixaceFixace - rychlá a šetrná konzervace tkáně fixačními prostředky

1. Fyzikální fixační prostředky: ovlivňují transportní funkci vody a tím naruší enzymaticky katalyzované reakce v buňkách- fixace působením nízké teploty: rychlé zmrazení, „suchý led“, zkapalněné plyny (tekutý dusík)- fixace vysušením tkáně za nízké teploty (freezing-drying): mrazová sublimace, histochemie – průkaz aktivity enzymů- fixace mikrovlnným zářením

2. Chemické fixační prostředkyZaloženy na působení par nebo roztoků účinných látek – fixačních tekutin,které ve vhodné koncentraci vyvolávají jemnou a šetrnou denaturacienzymových proteinů.

3. Fyzikálně chemické metody - kombinace předchozích, např. chlazená fixační tekutina

Požadavky na fixaci- musí rychle působit v celém vzorku

- musí dobře uchovat strukturu buněk a tkání

- musí umožňovat další požadované zpracování, vyšetření

Z toho důvodu musí být vzorky přiměřeně velké: pro světelnou mikroskopii max. 1cm3, spíše ploténky.

Fixační tekutiny musí být nadbytek – 20 až 50x větší objem.

Vzorek se nesmí přilepit ke dnu ani plavat neponořený.

Dostatečně velké hrdlo nádobky, řádné uzavření.

Správné označení materiálu: nalepovací štítek + označení přímo ke vzorku. Nesmí dojít k záměně materiálu!

Žádanka na histologické vyšetření.

Fixační prostředkyFormol:

100% formol je 40% vodný roztok formaldehydu

Nejpoužívanější, dostupný, relativně levný.

Neutrální formol: neutralizovaný uhličitanem vápenatým (asi ¼ láhve), běžně používaná koncentrace je 10%

Rychle proniká do tkáně, je šetrný, zachovává strukturu, dobře se po něm barví. Fixujeme asi 24h, menší kousky i méně, nemůžeme přefixovat.

slaný formol (ředěný fyziologickým roztokem)

pufrovaný formol

Bakerova tekutina:

10% formol, chlorid vápenatý, voda

Vhodná pro průkaz lipidů, enzymů vázaných na membrány.

Fixační prostředky

Bromformol:

15% formol, bromid amonný

Použití u impregnačních metod, průkaz gliových buněk v nervové tkáni.

Bouinova tekutina:

25% formol, kys. pikrová, ledová kyselina octová - 5ml těsně před použitím

Po fixaci se dává do 80% etanolu. Nemůže přefixovat.

Nevýhody: nehodí se pro fixaci krevnatých orgánů, není vhodná pro průkaz lipidů

Fixační prostředkyFixační tekutiny se sublimátem:SUSA:sublimát (chlorid rtuťnatý), chlorid sodný, formol, destilovaná voda, kyselina

trichloroctová, před použitím ledová kyselina octováVýborná pro cytologii, kosti, zuby, chrupavky.Přenáší se rovnou do 90% etanolu, v němž se provádí jódování. Jódování – odstranění sublimátových sraženin (vznikají při fixaci) např. v Lugolově

roztoku či jódové tinktuře.

Zenkerova tekutina: sublimát, dvojchroman draselný, síran sodný, destilovaná voda, ledová kyselina

octová, NENÍ FORMOL!Fixace 24h, pak vypírání bločku v tekoucí vodě (24h), pak 70% etanol a jódování.

Fixační prostředky

Etanol:

použití zejména v neurohistologii – Nisslova metoda. Tkáň se značně

dehydratuje a extrahují se tuky – zvýraznění komplexů granulárního

endoplazmatického retikula (Nisslova substance), ta se pak barví např.

thioninem.

Aceton: 0-40C, enzymová histochemie

Osmiumtetroxid:

základní prostředek fixace v technice elektronové mikroskopie. Pro světelnou

mikroskopii se nehodí – proniká pomalu do tkáně.

ZaléváníPro běžné histologické vyšetření je potřeba odebraný a fixovaný materiál nakrájet

na řezy 4-8µm silné. Po prosycení tkáně tekutým zalévacím médiem médium

ztuhne a zvýší konzistenci (tvrdost, pevnost) vzorku, což umožní krájet tenké řezy.

1. Média rozpustná ve vodě:

celodal, želatina, metakrylátové umělé pryskyřice

Výhodná proto, že po fixaci a vyprání ve vodě můžeme přímo prosycovat, zalévat a tvrdit.

2. Média nerozpustná ve vodě:

parafin, celoidin, umělé epoxidové pryskyřice

Zalévání do těchto médií vyžaduje nejprve důkladné odvodnění vzorku a prosycení intermédiem (látka, která se mísí s odvodňujícím i zalévacím médiem). Teprve pak prosycujeme zalévacím médiem.

Zalévání do parafínuNejpoužívanější metoda, nevhodná ale k zalévání tuhých tkání, průkazu lipidů.Nevýhoda: smrštění tkáně při odvodnění, prosycování při vysoké teplotě

Etapy:A/ odvodnění tkáně – dehydrataceVzestupná řada alkoholů - etanolu (30-50-70-80-90-96-100%)- musí být šetrné, první použitá koncentrace závisí na obsahu vody ve tkáni (např.

embryonální tkáně začínají 30%, šlacha či zub i 90%, po fixaci Bouinovou tekutinou 80%, SUSA 90%)

- každá lázeň několik hodin, 2x se vyměňuje, celkem 1-2 dny

B/ prosycení tkáně intermédiem, projasněníbenzen, xylen, toluen, metylsalicylát, metylbenzoátIntermédium musí rozpouštět parafín a mísit se se 100% alkoholem. Vysoký index lomu, provádí se ve 3 lázních po 15 minutách.

C/ prosycení tekutým parafínem

parafín 560C

3 lázně parafínu při 560C, 1. lázeň asi 2-4h, 2. lázeň 4-6h, 3. lázeň 8-12h, celkem cca 24 hodin. Teplota nesmí překročit 580C.

D/ vlastní zalití

V zalévací komůrce, používá se výhradně zkvalitněný parafín (zahřátí na 800C, přidá se 3-5% včelího vosku a přefiltruje).

Bloček se přenese pinzetou, nahřátou preparační jehlou se zorientuje, nechá ztuhnout. Stále u vzorku musí zůstat značení.

E/ tvrzení média

Rovnoměrné tuhnutí při pokojové teplotě, úprava bločku, přitmelení na podložku. Pro rutinní zpracování histologických vzorků se používají zalévací automaty.

Zalévání do celoidinuPoužití: tuhé tkáně, šlachy, chrupavky,

zuby, odvápněné kosti

Výhoda: pokojová teplota

Nevýhody: trvá dlouho, nelze použít pro lipidy, nádobky musí být dobře uzavřené

Postup:

- odvodnění vzestupnou řadou alkoholů

- prosycení alkoholéterem

- vzestupná řada celoidinu (2%,4%,8%,10%)

- vlastní zalití do 10% celoidinu a tuhnutí

- tvrzení bločku v 70-80% alkoholu

Zalévání do želatinyPoužití: řídké struktury – placenta,

sliznice střeva, průkaz lipidů ad.

Postup:

- vyprání ve vodě

- prosycení želatinou ve stoupajících koncentracích (10% a 15% vodný roztok)

- vlastní zalití do 15% nebo 20% roztoku želatiny v komůrce

- tvrzení v 10-20% formolu

Krájení na kryostatu!

Krájení řezůKrájí řezy cca 6-10 µm

Sáňkový mikrotom: krájí parafín, celoidin, celodal

Rotační mikrotom: parafínové bloky – zhotovení sériových řezů, např. embryologie

Zmrazovací mikrotom – krájení tkání nezalitých, zalitých do želatiny

Napínání a lepení parafínových řezůŘezy se napínají na vodní hladině (povrchové napětí) a lepí na podložní sklo např:

• směsí bílku a glycerinu 1:1

Nelze použít např. pro imunohistochemii, impregnaci.

Na sklíčko se rozetře bílek s glycerinem, přenese se řez a podlije destilovanou vodou. Natažení na napínací ploténce. Označení podložního skla! Sušárna.

• roztokem želatiny 0,5 až 1%

Řezy se podlévají želatinou, sušárna, koagulace želatiny.

Světelný mikroskop

Mechanická část: stativ, stolek, šrouby

Optická část: objektiv, okulár

Osvětlovací zařízení: světlo, kondenzor, clony

Druhy objektivů: suché, imerzní

Rozlišovací schopnost mikroskopu

– dána jeho stavbou a optickými vlastnostmi objektivu

– je vyjádřena numerickou aperturou.

NA = n*sin α

– n je index lomu media, α je polovina otvorového úhlu objektivuRozlišovací schopnost je minimální vzdálenost 2 bodů, které můžemerozlišit, mezní hodnota u světelného mikroskopu při použití šikméhoosvětlení je asi 0,2μm.

Přednášková prezentace je určena výhradně pro osobní studium studentů 1. LF UK.