TÜBERKÜLOZ TANISI ve

LABORATUVARLAR

Doç.Dr. Alpaslan Alp

Hacettepe Üniversitesi Tıp FakültesiTıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Türkiye’de Tüberküloz Kontrolü:

Son Beş Yılda Neler Değişti?

• Ulusal Tüberküloz Kontrol Programında Laboratuvarların Yeri

• Laboratuvar Uygulamalarındaki Gelişmeler-Yenilikler

Tüberküloz Laboratuvarı Çalışma Grubu

• Çıkış Noktası: Stop-TB oluşumu tarafından hazırlanan ve DSÖ’nün uygulamaya koyduğu, 2006-2015 yıllarını kapsayan “Tüberkülozu Durdurmak için Küresel Plan”(Global Plan to Stop TB 2006-2015)

Tüberküloz Laboratuvarı Çalışma Grubu

• Temel Amaç:

Tüberkülozu durdurma stratejisinin tüm bileşenleri ile uygulanmasının sağlanması amacıyla kamu ve sivil toplum örgütleri ile birlikteliği artırmak ve veremsiz bir Türkiye yaratmak.

Tüberküloz Laboratuvarı Çalışma Grubu

Grubun Öncelikli Amaçları:

1. Ulusal tüberküloz laboratuvar ağının düzenlenmesi ve tüberküloz laboratuvarlarında standardizasyonun sağlanması.

2. Ulusal Kontrol Programı kapsamındaki tüberküloz laboratuvarları için Tanı Rehberi hazırlanması.

3. Tüberküloz Enfeksiyon Kontrol Rehberi hazırlanması.

Amaç-1: Ulusal tüberküloz laboratuvar ağının düzenlenmesi ve tüberküloz laboratuvarlarında standardizasyonun sağlanması.

• Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Düzey-I, II ve III Tüberküloz Tanı Laboratuvarları’nda çalışılması gereken tetkiklerin belirlenmesi

• Ulusal Tüberküloz Referans Laboratuvarı’nın görevlerinin belirlenmesi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Düzey-I Tüberküloz Tanı Laboratuvarı:

– Örnek kabulü– Direkt mikroskobik inceleme (ARB boyaması)– Örneklerin Düzey-II laboratuvarına

gönderilmesi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Düzey-II Tüberküloz Tanı Laboratuvarı:

– Örneklerin işlenmesi– Mikroskobik inceleme (ARB boyaması)– Kültür– M. tuberculosis kompleksi ve TDM ayrımı– Birinci seçenek tüberküloz ilaçları için duyarlılık

testi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Düzey-III Tüberküloz Tanı Laboratuvarı:

– Mikobakterilerin tür düzeyinde tanımlanması– İkinci seçenek tüberküloz ilaçları için duyarlılık

testi– Moleküler genotiplendirme

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Ulusal Tüberküloz Referans Laboratuvarı:

– Tüberküloz tanısı ve tedavisi ile ilgili testlerin uygulanması, denetimi, iyileştirilmesi, kalite kontrolü

– Periyodik olarak eğitimlerin organizasyonu– Ulusal Tüberküloz Laboratuvarı Ağı’nın koordinasyonu

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Klinik örnek alımı• Direkt mikroskobik inceleme• Klinik örneğin işlenmesi ve incelenmesi• Kültür ve M. tuberculosis kompleksi tanımlanması• Birinci seçenek antitüberküloz ilaç duyarlılık testi• İkinci seçenek antitüberküloz ilaç duyarlılık testi• TDM için ilaç duyarlılık testi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Moleküler Yöntemler:

– Doğrudan Tanı: Klinik olarak kuvvetle tüberküloz düşünülen; mikroskopi veya kültür negatif akciğer tüberkülozu ve akciğer dışı olgularda (BOS, kemik biyopsisi, eklem sıvısı vb. örneklerde) moleküler yöntemler kullanılabilir.

– Tür Tanımı: Kültür pozitif örneklerde M. tuberculosis kompleksi ve TDM’lerin gerektiği hallerde tür ve tip düzeyinde belirlenmesi amacıyla moleküler yöntemler, diğer tanımlama testlerine alternatif olarak kullanılabilir.

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Moleküler Yöntemler:

– İlaç Direncinin Saptanması: Mikroskopisi pozitif saptanan örneklerde moleküler yöntemle M. tuberculosis kompleksi olarak belirlenen örneklerde RİF direnci de bakılabilir.

– Tanı ve direnç tespiti için kullanılan moleküler testlerin sonuçları en geç 3 gün içinde istemi yapan hekim/kuruma ve UTRL’ye bildirilir.

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Laboratuvarların Fiziki Şartları:

– Tüberküloz Tanı Laboratuvarları’nın düzeylerine göre, açılabilmeleri ve çalışabilmeleri için oluşturmaları gerekli olan asgari fiziki altyapı şartlarının belirlenmesi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Laboratuvarların Cihaz ve Ekipmanları:

– Tüberküloz Tanı Laboratuvarları’nın düzeylerine göre, açılabilmeleri ve çalışabilmeleri için oluşturmaları gerekli olan asgari cihaz ve ekipmanın belirlenmesi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Laboratuvarların personel görev ve sorumlulukları, istihdamı, eğitim ve değerlendirilmesinin belirlenmesi

Tüberküloz Tanı Laboratuvarları Çalışma Usul ve Esasları Yönergesi

• Tüberküloz laboratuvarlarında alınması gereken biyogüvenlik önlemlerinin belirlenmesi

Amaç-2:

“Tüberküloz Enfeksiyon Kontrolü Rehberi” Hazırlanması

• Ana Başlıklar:

– Yönetimsel (İdari) kontroller– Çevresel (Mühendislik) kontroller

• Havalandırma• Filtreler• Ultraviyole ışını

– Solunum korunması

Amaç-3:

“Tüberküloz Laboratuvarları için Tanı Rehberi” Hazırlanması

• Ana başlıklar, çıkarılacak olan yönetmelik temel alınarak belirlenecektir.

Dünya Sağlık Örgütü 2009 Yılı Raporu

• Aktif tüberkülozlu hasta sayısı: 13.7 milyon

• Yeni hasta sayısı: 9.27 milyon

• Tüberküloz nedeniyle hayatını kaybeden hasta sayısı: 1.76 milyon

Tüm uğraşlara rağmen, yıllardan beri bu sayılar düşme eğilimine girmiyor !

NEDEN?

Tüberkülozun Rutin Laboratuvar Tanısı

• Mikroskobik inceleme• Kültür yöntemleri

– Sıvı– Katı

Soru(n)…?

• Tüberküloz tanısında mikroskobik inceleme duyarlılığı uygun maliyetle nasıl arttırılabilir?

Yayma Mikroskobisi

• Tüberküloz laboratuvar tanısının vazgeçilmezi: Mikroskobik inceleme

• Floresan mikroskobisi, Ziehl-Neelsen mikroskobisinden daha duyarlı (%10) ve daha hızlı inceleme sağlıyor.Ancak daha pahalı ve idamesi daha zor.

LED Mikroskobu Kullanımı

• LED: Light-emitting diodes• Ziehl-Neelsen mikroskobisinden

daha duyarlı• Floresan mikroskobisinden daha

kullanışlı ve hesaplı• DSÖ, floresan mikroskobu yerine

LED mikroskobunun kullanımını tavsiye ediyor.

LED Mikroskobu Kullanımı

• Daha ucuz• Daha az güç tüketiyor (pille de

çalışabilir)• Ampulleri daha uzun ömürlü ve

kırıldığında toksik madde yaymıyor• Aydınlık ortamda da çalışılabiliyor

Tüberkülozun Rutin Laboratuvar Tanısı

• Mikroskopik inceleme• Kültür yöntemleri

– Sıvı– Katı

• Moleküler yöntemler ???

Tüberküloz ve Moleküler Yöntemler

• Tüberküloz tanısı• Mikobakterilerin tür düzeyinde

tanımlanması• M. tuberculosis’e karşı ilaç direncinin

saptanması• M. tuberculosis suşlarının

genotiplendirilmesi

Soru(n)…?

• Tüberküloz tanısında moleküler yöntemlerin yeri nedir?

Kanıt…

• Bilimsel literatürün taranması ve incelenmesi

• Deneyimler

Kanıt…

Ling DI, Flores LL, Riley DW, Pai M. Commercial nucleic acid amplification tests for diagnosis of pulmonary tuberculosis in respiratory specimens: Meta-analysis and meta-regression. PLoS One 2008; 3(2): e1536

Yayın tarama kriterleri:

• Pulmoner tüberküloz tanısı için NAAT kullanılmış olması;

• Altın standart kültür yöntemiyle karşılaştırma yapılmış olması;

• Duyarlılık ve özgüllük değerlerinin verilmiş olması;

• En az 50 örnekle çalışılmış olması.

Ling DI, Flores LL, Riley DW, Pai M. Commercial nucleic acid amplification tests for diagnosis of pulmonary tuberculosis in respiratory specimens: Meta-analysis and meta-regression. PLoS One 2008; 3(2): e1536

• İlk tarama sonucu bulunan çalışma sayısı: 2948

• Kriterlere uygun olup incelemeye alınan çalışma sayısı: 125

• Ortalama örnek sayısı: 715 (57-7539)

Ling DI, Flores LL, Riley DW, Pai M. Commercial nucleic acid amplification tests for diagnosis of pulmonary tuberculosis in respiratory specimens: Meta-analysis and meta-regression. PLoS One 2008; 3(2): e1536

SONUÇLAR:

• Duyarlılık ve özgüllük sonuçları çok değişken.

• Duyarlılık: %85

• Özgüllük: %96

• Klinik olarak anlamlı bir tanısal doğruluk derecesi yok.

Ling DI, Flores LL, Riley DW, Pai M. Commercial nucleic acid amplification tests for diagnosis of pulmonary tuberculosis in respiratory specimens: Meta-analysis and meta-regression. PLoS One 2008; 3(2): e1536

YORUM:

• Bu duyarlılık seviyelerindeki bir test grubuna rutin uygulamada tek başına güvenilemez.

• Bu test grubu, ancak altın standart yöntemi destekleyen bir yöntem olarak kullanılabilir.

Hangi tür PCR Yöntemi?

• Laboratuvar yapımı (in house) yöntemler– Optimizasyona açık– Ucuz

• Hazır ticari kitler– Standardizasyon imkanı– Solunum yolu örnekleri için optimize edilmiş

Hangi tür PCR Yöntemi?

– Laboratuvar yapımı yöntemlerle hazır ticari kitlerin duyarlılık ve özgüllükleri arasında önemli bir fark olmadığı gösterilmiş:

Huang TS et al: Comparison of the Amplicor assay and Digene system with in house PCR... J Clin Microbiol 1996, 34:3092-3096.

Yuen KY et al: Comparison of two automated DNA amplification systems with a manual one-tube nested PCR... J Clin Microbiol 1997, 35:1385-1389.

Cohen RA et al: Diagnosis of pulmonary tuberculosis using PCR assays on sputum... Am J Respir Crit Care Med 1998, 157:156-161.

Flores LL, Pai M, Colford JM, Riley LW. In-house nucleic acid amplification tests for the detection of M. tuberculosis in sputum specimens: Meta-analysis and meta-regression. BMC Microbiol 2005; 5:55.

• İlk tarama sonucu bulunan çalışma sayısı: 2520

• Kriterlere uygun olup incelemeye alınan çalışma sayısı: 84

• Ortalama örnek sayısı: 149 (14-727)

Flores LL, Pai M, Colford JM, Riley LW. In-house nucleic acid amplification tests for the detection of M. tuberculosis in sputum specimens: Meta-analysis and meta-regression. BMC Microbiol 2005; 5:55.

SONUÇLAR:

• Duyarlılık ve özgüllük sonuçları çok değişken.

• Duyarlılık: %9.4 - %100

• Özgüllük: %5.6 - %100

• Klinik olarak anlamlı bir tanısal doğruluk derecesi yok.

• Hedef bölge olarak IS6110 bölgesinin kullanıldığı çalışmalarda tanısal doğruluk derecesi daha yüksek.

Flores LL, Pai M, Colford JM, Riley LW. In-house nucleic acid amplification tests for the detection of M. tuberculosis in sputum specimens: Meta-analysis and meta-regression. BMC Microbiol 2005; 5:55.

YORUM:

• Bu duyarlılık seviyelerindeki bir test grubuna rutin uygulamada tek başına güvenilemez.

• Bu test grubu, ancak altın standart yöntemi destekleyen bir yöntem olarak kullanılabilir.

“Evaluation of the value of PCR method in diagnosis of tuberculosis”

Alp A, Hasçelik G, Özkara Ş

40th Union World Conference on Lung Health, 2009

• İki yıllık süreçte laboratuvara gönderilen örneklere, mikroskobik inceleme, kültür ve PCR yöntemleri uygulandı.

• PCR duyarlılığı: %80.7 (46/57)

• Sadece PCR ile pozitif bulunan 13 örneğe, klinik açıdan nasıl bakıldığı araştırıldı.

“Evaluation of the value of PCR method in diagnosis of tuberculosis”

Alp A, Hasçelik G, Özkara Ş

40th Union World Conference on Lung Health, 2009

• Bu hastalardan 7’sine, sadece PCR pozitifliği ile tüberküloz tedavisi başlandığı saptandı.

• Yedi örnek de akciğer-dışı örnekler idi.

• Sonuç: – Solunum yolu örneklerinde PCR ancak kültürü destekleyici bir

tanı aracı olabilir.

– Solunum yolu dışındaki örnekler için PCR kullanımı daha yararlı sonuçlar doğurabilir.

“Is PCR an essential method for the diagnosis of tuberculosisin a routin laboratory”

Alp A, Hasçelik G,

ASM 110th General Meeting, 2010

• Üç yıllık süreçte izole edilmiş 170 M. tuberculosis izolatının mikroskobik inceleme, kültür ve PCR sonuçları incelendi.

• Solunum yolu örneklerinde PCR duyarlılığı: %72

• Solunum yolu-dışı örneklerde PCR duyarlılığı: %76

• Yorum: PCR, mevcut duyarlılık oranı ile, rutin laboratuvara önemli bir katkı sağlamaktan uzaktır.

Teknik olarak umut veren yeni test yok mu?

• Xpert MTB/RIF Testi• LAMP (Loop Mediated Isothermal

Amplification Test)• Mikroçip çalışmaları• Düzenleyici RNA’ların (sRNA) keşfi

Xpert MTB/RIF Testi

• Ortak bir çalışmanın ürünü:– FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics)

– Cepheid (A.B.D.)

– University of Medicine ad Dentistry of New Jersey

• İki saat içerisinde M. tuberculosis varlığının ve rifampin direncinin saptanması

• Üç primer ve beş prob kullanılarak uygulanan “hemi-nested real-time PCR”

Xpert MTB/RIF Testi

2010 yılında yayınlanan ilk çalışmalarda tatmin edici sonuçlar alınmış:

• Yayma-pozitif, kültür-pozitif örneklerde duyarlılık :%99

• Yayma-negatif, kültür pozitif örneklerde duyarlılık: %90

Xpert MTB/RIF TestiMeta-Analiz Çalışması

• Toplam 90 çalışma içinden 18’i seçilmiş.• Toplam 10.224 örnek

– 2983 bakteriyolojik TB tanısı– 6183 yayma ve kültür negatif

• TB tanısı için ortalama duyarlılık: %90.4• TB tanısı için ortalama özgüllük: %98.4

Xpert MTB/RIF TestiMeta-Analiz Çalışması

• Rifampisin direnci için ortalama duyarlılık: %94.1• Rifampisin direnci için ortalama özgüllük: %97.0

• Akciğer-dışı örneklerde ortalama duyarlılık: %80.4• Akciğer-dışı örneklerde ortalama özgüllük: %86.1

Xpert MTB/RIF TestiMeta-Analiz Çalışması

YORUM:

• Xpert MTB/RIF testi klinik örneklerden tüberküloz tanısı ve rifampisin direncinin saptanmasında hızlı ve güvenilir bir yöntemdir.

• Ancak rifampisin direncine neden olan mutasyonların %5’inin, bu test ile bakılan bölgenin dışında görülebileceği unutulmamalıdır.

DSÖ’nün Xpert MTB/RIF Testi Değerlendirmesi-2011

• Xpert MTB/RIF testi:– Analitik duyarlılık: 5 genom kopyası/saf

DNAveya 131 cfu/ml balgam (kültürde 10-100 cfu/ml balgam)

DSÖ’nün Xpert MTB/RIF Testi Değerlendirmesi-2011

• Ortalama saptama zamanları:– Katı kültür: >30 gün– Sıvı kültür: 17 gün– Mikroskopi: 1 gün– Xpert MTB/RIF: <1 gün

DSÖ’nün Xpert MTB/RIF Testi Değerlendirmesi-2011

Tavsiyeler:

• Xpert MTB/RIF testi ÇİD-TB veya HIV+TB şüphesi bulunan olguların ilk tanısal testi olarak kullanılmalıdır.

• Xpert MTB/RIF testi, ÇİD-TB veya HIV+TB olgularının çok olmadığı bölgelerde, özellikle yayma-negatif olguların tanısında mikroskobiye ek olarak kullanılabilir.

DSÖ’nün Xpert MTB/RIF Testi Değerlendirmesi-2011

Tavsiyeler:

• Ancak, Xpert MTB/RIF testinin kullanımı, geleneksel mikroskobi, kültür ve ilaç duyarlılık testlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırmaz.

Xpert MTB/RIF Testi

• DSÖ tarafından istenen standartlar ile kıyaslandığında, dezavantajları:– Kitlerin raf ömrü en fazla 14 ay

– Cihaz yıllık bakım gerektiriyor

– Cihaz pille çalışmıyor

– Basit bir test ortaya çıkarılmış ancak çok karmaşık bir teknoloji kullanılıyor

– Ucuz değil