TIPE KROMATOGRAFI

Pri Iswati Utami

Tipe Kromatografi Berdasarkan Mekanisme Pemisahan

Adsorption Chromatography• Adsorption chromatography (kromatografi

adsorpsi ) adalah tipe kromatografi yang paling tua.

• Di sini digunakan fase gerak cairan atau gas yang akan dapat diadsorpsi pada permukaan fase diam padat.

• Kesetimbangan diantara fase gerak dan fase diam akan menentukan pemisahan solut yang berbeda-beda.

Partition Chromatography• Bentuk kromatografi ini berdasarkan pada

suatu fase diam cair yang dilapiskan tipis pada suatu permukaan pendukung zat padat.

• Solut akan berkesetimbangan (terbagi) diantara fase gerak dan fase diam cair.

Ion Exchange Chromatography• Pada tipe kromatografi ini, resin (fase

diam) digunakan untuk secara kovalen diikatkan anion atau kation kepadanya.

• Solut (ion) yang muatannya berlawanan di dalam fase gerak akan tertarik dan berikatan kepada resin (fase diam) dengan gaya elektrostatik.

• Separates molecules based on charge.

• Mobile phase– Generally liquid

• Stationary phase– Electrostatically charged ions bound to insoluble, chemically

inert martrix.

• Elution of protein – Add salt to compete with binding of sample to stationary phase.

– Change pH (alters charge of protein).

H2C

C

O

O-

carboxymethyl (CM)

cellulose

H2C

CH2

N

CH2

CH3

H2C

CH3

H

diethylaminoethyl (DEAE)

cellulose

(Anion exchange)

(Cation exchange)

Low salt High salt

Molecular Exclusion Chromatography

• Dikenal juga dengan gel permeation (permeasi gel) atau gel filtration (filtrasi gel), tipe kromatografi ini melibatkan sedikit kekuatan interaksi antara fase diam dan solut.

• Fase gerak cairan atau gas dilewatkan melalui gel berpori yang akan memisahkan molekul sesuai dengan ukurannya.

• Pori biasanya kecil, sehingga molekul yang besar tidak akan masuk, sedangkan molekul yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori gel.

• Hal ini menyebabkan molekul yang lebih besar akan melewati kolom lebih cepat dibandingkan molekul yang lebih kecil.

Exclusion chromatography

• Separates molecules based on size.

• Large molecules exit first.

• Mobile phase– Liquid

• Stationary phase– Insoluble, porous carbohydrate

beads

Affinity Chromatography • Tipe kromatografi ini adalah yang paling selektif.

Adanya interaksi yang spesifik antara molekul solut dan molekul kedua yang dilapiskan pada fase diam. Sebagai contoh, molekul yang dilapiskan pada fase diam adalah antibodi untuk beberapa protein spesifik.

• Ketika solut yang mengandung campuran protein melewati molekul ini, hanya protein spesifik saja yang bereaksi dengan antibodi, terikat pada antibodi yang ada melapisi fase diam.

• Protein ini kemudian diekstraksi/ dilepaskan dari ikatannya dari fase diam dengan merubah kekuatan ionik atau pH fase gerak.

Affinity chrom

Immunoaffinity column

• Mobile phase– Usually liquid

• Stationary phase– Receptor bound to

inert bead

glutathione

GST tag

Affinity chromatography dapat digunakan untuk:

1.)Memurnikan atau memekatkan molekul dari campuran menjadi larutan dalam suatu buffer.

2.)Menurunkan jumlah molekul dalam suatu campuran.

3.)Menentukan komponen yang terikat pada molekul tertentu, misalnya obat.

Kromatografi Kolom

Column Chromatography

Example

• Anggaplah anda akan memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru.

• Warna campuran yang tampak adalah hijau.

• Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom.

• Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom.

• Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.

Gambar berikut menunjukkan perubahan yang mungkin terjadi sejalan dengan perubahan waktu.

• Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen.

• Anda dapat mengatakan ini karena senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom.

• Itu berarti bahwa senyawa biru harus dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina dibanding dengan senyawa kuning.

• Karena kurang polar, senyawa kuning menghabiskan waktu dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat.

• Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi.

• Pelarut disebut sebagai eluen.

• Anggaplah anda mengganti pelarut yang anda telah digunakan selama ini dengan pelarut yang lebih polar, setelah seluruh senyawa kuning selesai terkumpulkan.

• Ini akan mempunyai dua pengaruh, keduanya akan mempercepat senyawa biru melalui kolom.

• Pelarut polar akan bersaing untuk mendapatkan ruang pada jel silika atau alumina dengan senyawa biru. Beberapa ruang untuk sementara dipergunakan oleh molekul-molekul pelarut pada permukaan fase diam, tidak menyediakan molekul-molekul biru untuk melekat dan ini akan cenderung menjaga pergerakannya dalam pelarut.

• Akan ada atraksi yang lebih besar antara molekul-molekul pelarut polar dan molekul biru yang polar. Kecenderungan ini akan menarik molekul-molekul biru menempel pada fase diam kembali pada larutan.

• Pengaruh total yaitu dengan bertambahnya kepolaran pelarut, senyawa biru akan menghabiskan waktu dalam larutan dan karenanya akan bergerak lebih cepat.

http://www.drugdevelopment-technology.com/contractors/genomics/amersham/amersham4.html