1

KROMATOGRAFİKROMATOGRAFİ

2

Kromatografi kantitatif ayırma teknikleri Kromatografi kantitatif ayırma teknikleri içinde en populer yöntemlerden biridir.içinde en populer yöntemlerden biridir.

Kromatografi öncelikle bir ayırma Kromatografi öncelikle bir ayırma yöntemidir. Ancak sistem çıkışına uygun yöntemidir. Ancak sistem çıkışına uygun bir dedektör eklenerek kalitatif ve kantitatif bir dedektör eklenerek kalitatif ve kantitatif tayin yapmakta mümkündür. tayin yapmakta mümkündür.

3

Kromatografik Yöntemlerin Tarihçesi Kromatografik Yöntemlerin Tarihçesi

İlk kromatografik çalışmalar; İlk kromatografik çalışmalar; Rus botanikçi Rus botanikçi Tswett (1901) Tswett (1901)

Kromatografik çalışmaların hız kazanması; Kromatografik çalışmaların hız kazanması; Kuhn Kuhn ve Lederer (1931) ve Lederer (1931)

Sıvı-Sıvı kromatografisinin temeli; Sıvı-Sıvı kromatografisinin temeli; Martin ve Martin ve Synge (1941)Synge (1941)

İlk gaz kromatografisi; İlk gaz kromatografisi; James ve Martin (1950)James ve Martin (1950) Gaz-sıvı kromatografisinin gelişimi (1954 ile Gaz-sıvı kromatografisinin gelişimi (1954 ile

1962) 1962) Gaz kromatografisi bir analitik teknik olarak Gaz kromatografisi bir analitik teknik olarak

kullanılması (1962)kullanılması (1962)

4

•• KromatografiKromatografi-- Kromatografi; yüzey alanı Kromatografi; yüzey alanı büyük sabit bir faz ve bu sabit faz üzerinde hareket eden büyük sabit bir faz ve bu sabit faz üzerinde hareket eden hareketli faz arasında bir karışımdaki bileşenlerin hareketli faz arasında bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasını esas alan bir yöntemdir.ayrılmasını esas alan bir yöntemdir.

•• Hareketli FazHareketli Faz - - Sabit faz üzerinden analitlerin Sabit faz üzerinden analitlerin hareketini sağlayan bir sıvı hareketini sağlayan bir sıvı

yada gazdır. yada gazdır.

•• SSabitabit FazFaz-- Analitlerin hareketli fazın akışı Analitlerin hareketli fazın akışı süresince ayrılmasını sağlayan bir katı dolgu maddesidir.süresince ayrılmasını sağlayan bir katı dolgu maddesidir.

Kromatografik Ayırmalara GirişKromatografik Ayırmalara Giriş

5

Hareketli fazın ilerlemesiyle, çözünen Hareketli fazın ilerlemesiyle, çözünen maddelerin durgun faz üzerinden yıkanarak maddelerin durgun faz üzerinden yıkanarak taşınmalarına taşınmalarına elusyonelusyon adı verilir. adı verilir.

Faz üzerinde tutunan bir karışımdaki Faz üzerinde tutunan bir karışımdaki bileşenleri faz üzerinden taşımakta bileşenleri faz üzerinden taşımakta kullanılan çözücüye kullanılan çözücüye eluenteluent denir. denir.

Elusyon zamanı veya elusyon hacmine karşı Elusyon zamanı veya elusyon hacmine karşı çözünen madde konsantrasyonuna bağlı çözünen madde konsantrasyonuna bağlı sinyalin oluşturduğu grafiğe sinyalin oluşturduğu grafiğe kromatogramkromatogram denir. denir.

6

Bir karışımdaki bileşenlerin seçici olarak Bir karışımdaki bileşenlerin seçici olarak ayrılması için bileşenlerin katı faz üzerinde ayrılması için bileşenlerin katı faz üzerinde ayrıcalıklı olarak tutunması gereklidir. ayrıcalıklı olarak tutunması gereklidir.

Hareketli faz olarak gaz kullanıldığında (GC’de), Hareketli faz olarak gaz kullanıldığında (GC’de), ayrılan bileşenlerle gaz molekülleri arasında ayrılan bileşenlerle gaz molekülleri arasında herhangi bir etkileşim olmaz. Bu nedenle gaz herhangi bir etkileşim olmaz. Bu nedenle gaz kromatografisinde seçiciliği sabit faz sağlar. kromatografisinde seçiciliği sabit faz sağlar.

Sıvı kromatografisinde ise bileşenlerle her iki faz Sıvı kromatografisinde ise bileşenlerle her iki faz arasında bir etkileşim söz konusudur. Bu yüzden arasında bir etkileşim söz konusudur. Bu yüzden sıvı kromatografisinde sabit faz ve hareketli fazı sıvı kromatografisinde sabit faz ve hareketli fazı kontrol ederek seçiciliği artırmak mümkündür. kontrol ederek seçiciliği artırmak mümkündür.

7

Ayrılacak bileşenlerle sabit ve hareketli faz Ayrılacak bileşenlerle sabit ve hareketli faz molekülleri arasında etkileşim gösteren farklı molekülleri arasında etkileşim gösteren farklı güçler vardır. Bunları temel olarak iki türde güçler vardır. Bunları temel olarak iki türde inceleyebiliriz. inceleyebiliriz.

Bunlar; Bunlar;

- İyonik kuvvetler- İyonik kuvvetler

- Polar kuvvetler- Polar kuvvetler

8

İyonik Kuvvetlerİyonik Kuvvetler

İyonik güçler elektriksel yükün bir İyonik güçler elektriksel yükün bir sonucudur. İyonik bir türü ayırmak için sonucudur. İyonik bir türü ayırmak için sabit fazda anyonik yada katyonik gruplar sabit fazda anyonik yada katyonik gruplar içeren sabit faz kullanılabilir içeren sabit faz kullanılabilir

9

Polar KuvvetlerPolar Kuvvetler

Moleküllerdeki dipolün yada anlık meydana gelen Moleküllerdeki dipolün yada anlık meydana gelen dipolun bir sonucu olarak doğan moleküller arası dipolun bir sonucu olarak doğan moleküller arası güçlerdir. Örneğin alkoller, ketonlar ve aldehitler güçlerdir. Örneğin alkoller, ketonlar ve aldehitler kalıcı dipolleri olan polar maddelerdir. Benzen ve kalıcı dipolleri olan polar maddelerdir. Benzen ve toluen ise polarlanabilen maddelere örnek olarak toluen ise polarlanabilen maddelere örnek olarak verilebilir. Bir kromatografik sistemde polar verilebilir. Bir kromatografik sistemde polar maddeler seçici olarak tutunabilir. Sabit faz en maddeler seçici olarak tutunabilir. Sabit faz en azından polarize olabilen aromatik çekirdek yada azından polarize olabilen aromatik çekirdek yada hidroksil bileşikleri gibi polar moleküller içeririler hidroksil bileşikleri gibi polar moleküller içeririler

10

Kromatografik Yöntemlerin Sınıflandırılması:Kromatografik Yöntemlerin Sınıflandırılması:

1.1. KolonKolon KromatografisiKromatografisi - - Sabit fazın Sabit fazın dar bir kolona doldurulur ve hareketli faz basınç dar bir kolona doldurulur ve hareketli faz basınç ile (yer çekimi, vakum yada basınç) sabit faz ile (yer çekimi, vakum yada basınç) sabit faz üzerinden geçirilir. üzerinden geçirilir.

•• TeTemmeel olarak üç türü vardırl olarak üç türü vardır: :

2.2. DüzlemDüzlem KromatografisiKromatografisi-- Bu yöntemde; Bu yöntemde; sabit faz bir düz tabak yada bir kağıttır. Hareketli sabit faz bir düz tabak yada bir kağıttır. Hareketli faz sabit faz üzerinden kapiler hareket ile sabit faz faz sabit faz üzerinden kapiler hareket ile sabit faz üzerinden hareket eder. üzerinden hareket eder.

KolonKolon KromatografisiKromatografisi

1.1. Sıvı KromatografisiSıvı Kromatografisi

2.2. GaGazz KromatografisiKromatografisi

3.3. SSüüperperkkritiritikk Akışkanlı SıvıAkışkanlı Sıvı KromatografisiKromatografisi

11

•• Bir karışımdaki bileşenlerin Bir karışımdaki bileşenlerin bazıları sabit faz üzerinde güçlü bazıları sabit faz üzerinde güçlü bazıları ise zayıf tutunurlar. Sabit bazıları ise zayıf tutunurlar. Sabit fazda zayıf tutunan türlerin fazda zayıf tutunan türlerin hareketli fazdaki hızları güçlü hareketli fazdaki hızları güçlü tutunanlardan daha hızlıdır. tutunanlardan daha hızlıdır.

•• Bileşenler bir bant verecek Bileşenler bir bant verecek şekilde ayrılırlar.şekilde ayrılırlar.

•• Bu bantlar, hareketli fazda Bu bantlar, hareketli fazda türlerin göç hızlarına bağlıdır. türlerin göç hızlarına bağlıdır.

12

KKROMATOGRAROMATOGRAFİKFİK KKOLOLOONN

13

ADSORBADSORBANAN PAR PARÇACIĞIÇACIĞI

14

Kolonda Analitlerin GöçüKolonda Analitlerin Göçü

•• Bir kromatografi kolonunun iki çözüneni ayrılmadaki verimliliği, iki türün Bir kromatografi kolonunun iki çözüneni ayrılmadaki verimliliği, iki türün eluasyon sırasındaki bağıl hızlarına bağlıdır. Analitin kolondan göç hızı eluasyon sırasındaki bağıl hızlarına bağlıdır. Analitin kolondan göç hızı analitin sabit faz ile hareketli faz arasındaki dengesine bağlıdır. analitin sabit faz ile hareketli faz arasındaki dengesine bağlıdır.

Partisyon OranıPartisyon Oranı (K) (K)

•• AAnalnaliitt, sabit fazda bağlanma ve ayrışarak kolonda hareket eder., sabit fazda bağlanma ve ayrışarak kolonda hareket eder.

A stationary A mobile

•• Partisyon sabiti Partisyon sabiti ((KK) ) çözünenlerin hareketli ve sabit fazdaki çözünenlerin hareketli ve sabit fazdaki konsantrasyonlarının oranını esas alan denge sabiti ifadesi olarak konsantrasyonlarının oranını esas alan denge sabiti ifadesi olarak tanımlanır. tanımlanır.

m

s

c

cK ccss = = Analitin sabit fazdaki k Analitin sabit fazdaki kononsantrasyonusantrasyonu

ccmm = = Analitin hareketli fazdaki konsantrasyonuAnalitin hareketli fazdaki konsantrasyonu

15

Alıkonma ZamanıAlıkonma Zamanı ((ttRR)) - - Örneğin enjeksiyonundan analitin dedektöre Örneğin enjeksiyonundan analitin dedektöre

ulaşıncaya kadar geçen zamana ulaşıncaya kadar geçen zamana alıkonma zamanı (alıkonma zamanı (ttRR))

denir.denir.

A B Unretained

Species

(tR)A

(tR)B

tM Det

ecto

r S

ign

al

Time

•• Ölü ZamanÖlü Zaman ((ttMM)) -- Hiç tutunmayan bir türün kolondan Hiç tutunmayan bir türün kolondan

geçmesi için geçmesi için gerekli olan zamana gerekli olan zamana ölü zamanölü zaman denir. denir.

•• Ayarlanmış tutunma zamanıAyarlanmış tutunma zamanı - - Analitin kolonda Analitin kolonda gerçek tutunma gerçek tutunma zamanını verir.zamanını verir.

ttRR - - ttMM

16

Analitin Göç HızıAnalitin Göç Hızı: : Kapasite Kapasite FaFaktörüktörü

A B Unretained

Species

(tR)A

(tR)B

tM Det

ecto

r S

ign

al

Time

•• Kapasite FaktörüKapasite Faktörü ( (k'k')) - - Bir kolonda analitin göç Bir kolonda analitin göç hızlarını tanımlanmasında en yaygın kullanılan hızlarını tanımlanmasında en yaygın kullanılan önemli bir deneysel parametredir. önemli bir deneysel parametredir.

AA Analiti için Analiti için ::

M

MAR

A t

ttk

)('

BB Analiti için Analiti için::

M

MBRB t

ttk

)('

17

RelatiRelatif Göç Hızlarıf Göç Hızları: Se: Seçicilik çicilik FaFaktörüktörü

A B Unretained

Species

(tR)A

(tR)B

tM Det

ecto

r S

ign

al

Time

•• Seçicilik Faktörü Seçicilik Faktörü ( (aa)) – – Bir karışımdaki analitler Bir karışımdaki analitler arasındaki seçiciliği (yani ayrılmayı) seçicilik arasındaki seçiciliği (yani ayrılmayı) seçicilik faktörü faktörü ((aa)) gösterir. gösterir.

MAR

MBR

A

B

tt

tt

k

k

)(

)(

'

' k’k’AA = A = A analitinin kapasite faktörü analitinin kapasite faktörü

k’k’BB = B = B analitinin kapasite faktörü analitinin kapasite faktörü

•• Kapasite ve seçicilik faktörü kolonun ayırma gücünün hesaplamasında Kapasite ve seçicilik faktörü kolonun ayırma gücünün hesaplamasında kullanılır.kullanılır.

18

KKololoon n VerimiVerimi

•• Kolon verimi; bir karışımdaki bileşenleri kolonun ayırma gücü olarak Kolon verimi; bir karışımdaki bileşenleri kolonun ayırma gücü olarak tanımlanabilir. tanımlanabilir.

Tabaka TeorisiTabaka Teorisi - - Tabaka teorisinde; kolon verimliliğinin kantitatif Tabaka teorisinde; kolon verimliliğinin kantitatif ölçümünde birbiriyle bağıntılı iki terim kullanılır. Bunlar;ölçümünde birbiriyle bağıntılı iki terim kullanılır. Bunlar;

1- Tabaka yüksekliği1- Tabaka yüksekliği

2- Teorik tabaka sayısı2- Teorik tabaka sayısı

19

Tabaka yüksekliği (Tabaka yüksekliği (HH) genellikle ) genellikle 00,,1 cm 1 cm ile ile 00,,001 cm001 cm arasında değişirken arasında değişirken, , teorik tabak teorik tabak sayısı sayısı N N 100100 ile ile 100 100..000000 arasında arasında değişebilir. değişebilir.

Kolon verimi, tabaka yüksekliğinin Kolon verimi, tabaka yüksekliğinin HH azalması ve tabaka sayısının azalması ve tabaka sayısının NN artmasıyla artmasıyla artar. artar.

20

Bir gaus eğrisinin genişliği standart sapma Bir gaus eğrisinin genişliği standart sapma σσ yada varyans yada varyans σσ22 değerleriyle tanımlanır. değerleriyle tanımlanır.

Kromatografik bantlarda gaus eğrisine Kromatografik bantlarda gaus eğrisine benzediğinden ve kolon verimliliği benzediğinden ve kolon verimliliği kromatografik piklerin genişlikleri ile kromatografik piklerin genişlikleri ile doğrudan ilgili olduğundan birim kolon doğrudan ilgili olduğundan birim kolon uzunluğu başına varyans değeri kolon uzunluğu başına varyans değeri kolon verimliliğinin bir ölçüsü olarak verimliliğinin bir ölçüsü olarak kullanılabilir. kullanılabilir.

Plaka yüksekliğinin belirlenmesi Plaka yüksekliğinin belirlenmesi ((HH) )

21

LH

2

22 = var = varyansyans

22

Teorik tabaka sayısı N ve tabaka yüksekliği Teorik tabaka sayısı N ve tabaka yüksekliği H kolon performansının ölçütü olarak H kolon performansının ölçütü olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. yaygın olarak kullanılmaktadır.

H ve N’nin deneysel tayininde, pikin H ve N’nin deneysel tayininde, pikin tutulma süresi tutulma süresi ttRR ve pikin tabanının kalınlığı ve pikin tabanının kalınlığı

WW (zaman olarak) ölçülür. Bu verilerden (zaman olarak) ölçülür. Bu verilerden faydalanılarak H ve N hesaplanabilir. faydalanılarak H ve N hesaplanabilir.

HH veve NN’ ’ nin deneysel tayininin deneysel tayini

23

•• Zamanın bir fonksiyonu olarak sZamanın bir fonksiyonu olarak standartandart sapma t sapma (())

= = zamanınzamanın standar standartt sapmasısapması

ttRR = = alıkonma zamanıalıkonma zamanı

RtL

•• Gaus eğrisinde, ortalamanın Gaus eğrisinde, ortalamanın ±s±s olduğunda oluşan üçgenin alanı gaus eğrisinin olduğunda oluşan üçgenin alanı gaus eğrisinin % 68 ini verir. Benzer şekilde ortalamanın % 68 ini verir. Benzer şekilde ortalamanın ±2s±2s aralığındaki alanın altında aralığındaki alanın altında kalan pik alanı gaus eğrinin yaklaşık kalan pik alanı gaus eğrinin yaklaşık % % 96’sını kapsar.96’sını kapsar. Bu nedenle pikin Bu nedenle pikin taban genişliği 4 standart sapmaya eşittir. taban genişliği 4 standart sapmaya eşittir.

W = 4W = 4 or or = W/4 = W/4

2

2

16R

t

LWH

2

16

W

tN R

yadayada

24

VAN DEEMTER EVAN DEEMTER EŞİTLİĞİŞİTLİĞİ

H = H = B/uB/u + + CCs s uu + C + Cm um u

H = Tabaka yüksekliği H = Tabaka yüksekliği uu = saniye başına cm olarak hareketli = saniye başına cm olarak hareketli

fazın doğrusal hızıfazın doğrusal hızı BB = Uzunlamasına difüsyon katsayısı = Uzunlamasına difüsyon katsayısı CCss ve C ve Cmm == sırasıyla durgun ve hareketli sırasıyla durgun ve hareketli

fazın kütle aktarım katsayısıdır.fazın kütle aktarım katsayısıdır.

25

Uzunlamasına difüzyon Uzunlamasına difüzyon katsayısı B/ukatsayısı B/u

Türlerin çok yoğun ortamdan az yoğun Türlerin çok yoğun ortamdan az yoğun ortama geçmesine difüzyon denir. ortama geçmesine difüzyon denir. Bileşenlerin göç hızı, türlerin difüzyon Bileşenlerin göç hızı, türlerin difüzyon katsayısına Dkatsayısına DMM ve bölgeler arasındaki ve bölgeler arasındaki

konsantrasyon farkına bağlıdır. konsantrasyon farkına bağlıdır. Kromatografide uzunlamasına difüzyon, Kromatografide uzunlamasına difüzyon,

çözünen türlerin bantın merkezinden her çözünen türlerin bantın merkezinden her iki yöne göçünden oluşur. iki yöne göçünden oluşur.

26

Durgun faz kütle aktarım katsayısı CDurgun faz kütle aktarım katsayısı Css u u

Durgun faz tutuklanmış bir sıvı ise kütle Durgun faz tutuklanmış bir sıvı ise kütle aktarım katsayısı Caktarım katsayısı Css, destek parçacıklarının , destek parçacıklarının üzerindeki film kalınlığının karesi ile üzerindeki film kalınlığının karesi ile doğrudan, çözünenin bu film içindeki doğrudan, çözünenin bu film içindeki difüzyon katsayısı Ddifüzyon katsayısı Dss ile ters orantılıdır. ile ters orantılıdır.

Durgun faz bir katı yüzey ise kütle aktarım Durgun faz bir katı yüzey ise kütle aktarım katsayısı Ckatsayısı Css, türlerin absorpsiyonu ve , türlerin absorpsiyonu ve desorpsiyonu için gerekli süre ile doğrudan desorpsiyonu için gerekli süre ile doğrudan orantılıdır. Bu süre ise hareketin birinci orantılıdır. Bu süre ise hareketin birinci derece hız sabitiyle ters orantılıdır.derece hız sabitiyle ters orantılıdır.

27

Hareketli faz kütle aktarım katsayısı CHareketli faz kütle aktarım katsayısı Cmm

Hareketli faz kütle aktarımı olayları çok Hareketli faz kütle aktarımı olayları çok karmaşıktır. karmaşıktır. Hareketli faz kütle aktarım katsayısı Hareketli faz kütle aktarım katsayısı CCmm analitin hareketli fazdaki difüzyon katsayısı analitin hareketli fazdaki difüzyon katsayısı

DDMM ile ters orantılıdır. Dolgudaki parçacıkların ile ters orantılıdır. Dolgudaki parçacıkların

çapının karesi ile, kolon çapının karesi ve akış çapının karesi ile, kolon çapının karesi ve akış hızı ile ilgilidir. hızı ile ilgilidir.

28

Hareketli fazda bölge genişlemesi hareket Hareketli fazda bölge genişlemesi hareket eden analitin aldığı yola bağlıdır. eden analitin aldığı yola bağlıdır.

Eddy DifEddy Difüzyonuüzyonu

29

KKolunolununun Re Rezolüsyon (Ayırma Gücü)zolüsyon (Ayırma Gücü) (R (RSS)) – –Kolonun ayırma gücünün kantitatif Kolonun ayırma gücünün kantitatif

ölçütüdür. ölçütüdür.

BA

ARBR

SWW

ttR

)()(2

30

BaBant genişlemesi ve Knt genişlemesi ve Kololoon n VerimiVerimi

PPiik k ŞekliŞekli

•• Hareketli fazda analitlerin kalma zamanı farklı olduğundan pikler bir Hareketli fazda analitlerin kalma zamanı farklı olduğundan pikler bir GausGaus dağılımı verir.dağılımı verir.

•• Bazı analit molekülleri hareketli fazda diğerlerinden daha az hızlarda Bazı analit molekülleri hareketli fazda diğerlerinden daha az hızlarda hareket edebilir. Eğrinin tepe noktası analitlerin kolonda geçirdikleri hareket edebilir. Eğrinin tepe noktası analitlerin kolonda geçirdikleri ortalama zamanı verir.ortalama zamanı verir.

•• Pikin genişliği kolonun uzunluğu ile direkt olarak ilişkilidir. Daha uzun Pikin genişliği kolonun uzunluğu ile direkt olarak ilişkilidir. Daha uzun olan kolonlarda pik genişliği artar. olan kolonlarda pik genişliği artar.

•• PPik genişliği hareketli fazın akış hızına da (hacmine)ik genişliği hareketli fazın akış hızına da (hacmine) bağlıdır.bağlıdır. Daha Daha yüksek akış hızlarında daha dar pikler görülür. yüksek akış hızlarında daha dar pikler görülür.

31

Sonuç olarak; kolon uzunluğunun Sonuç olarak; kolon uzunluğunun artmasıyla ve hareketli fazın akış hızının artmasıyla ve hareketli fazın akış hızının azalmasıyla pikin genişliği artar. Bunun azalmasıyla pikin genişliği artar. Bunun tam tersi olan durumlarda pik genişliği tam tersi olan durumlarda pik genişliği azalır yani pik darlaşır ve sivrilir. İdeal bir azalır yani pik darlaşır ve sivrilir. İdeal bir bant dar ve sivri olmalıdır. bant dar ve sivri olmalıdır.

Sıvı kromatografisindeSıvı kromatografisinde; hareketli fazın akış ; hareketli fazın akış hızı gaz kromatografisine göre çok hızı gaz kromatografisine göre çok düşüktür. düşüktür.

32

Sıvı kromatografisindeSıvı kromatografisinde tabaka yüksekliği tabaka yüksekliği gaz kromatografisindengaz kromatografisinden yaklaşık 10 kat yaklaşık 10 kat daha büyüktür. Bu yüzden daha büyüktür. Bu yüzden sıvı sıvı kromatografisindekromatografisinde kullanılan kolonların kullanılan kolonların boylarını 50 cm’den büyük yapmak pratik boylarını 50 cm’den büyük yapmak pratik değildir. değildir.

Gaz kromatografisindeGaz kromatografisinde ise kolon boyları 50 ise kolon boyları 50 m ve daha büyük olabilir. Sonuç olarak gaz m ve daha büyük olabilir. Sonuç olarak gaz kromatografisinde kullanılan kolonların kromatografisinde kullanılan kolonların tabaka sayısı çok daha fazla olduğu için tabaka sayısı çok daha fazla olduğu için ayırma gücüde daha iyidir. ayırma gücüde daha iyidir.