固相抽出（SPE）カラムの基礎とあなたの日々の作...

シグマアルドリッチジャパン合同会社ライフサイエンスアプライド事業部

アナリティカルテスティング営業部佐々木豊

JASIS2017 新技術説明会 A-8

2017年9月8日(金) 12:15～13:05

【基礎から学ぶ】

固相抽出（SPE）カラムの基礎とあなたの日々の作業に役立つ弊社独自のノウハウを伝授

固相抽出とは？

• 固相抽出の目的、特長 • 目的物質・充填剤・溶媒の三角関係

固相抽出カラムの使用方法

• 様々なカラム形状 • サンプルマトリクスからの充填剤選択 • 各充填剤の選択と使用方法 • 分散型固相抽出について

コンディショニングの目的

• コンディショニングの重要性 • チャネリングの予防 • 充填剤間、フリッツの気泡除去 • 充填剤の活性化

自然落下を快適に行うテクニック

• 通液速度と回収率の関係 • 様々な溶出方法 • ディスポーサブルライナーの活用

1 2

3 4

本日の内容

3

・目的物質

マトリクス

膨大な量のマトリクスに含まれる、微量な分析対象物を測定するため機器分析の前に「前処理」という工程が必要

１．固相抽出とは？固相抽出の目的、特長

液液抽出・・・有機溶媒を大量に使用操作が煩雑で時間がかかる

固相抽出・・・簡単、迅速に前処理

4

マトリクス（妨害物質）を除去し精製する → マトリクスを保持させ除去する


マトリクス

目的物質

5


マトリクス

目的物質

分析に適した濃度に濃縮する → 目的物質を保持させ溶出する

１．固相抽出とは？

6

目的物質・充填剤・溶媒の三角関係

目的物質

溶媒充填剤

疎水性・親水性イオン性配位性

化学構造分子量

有機溶媒組成バッファー pH

充填剤の種類充填剤量

１．固相抽出とは？

7

目的物質・充填剤・溶媒の三角関係目的物質の極性

カーボン系充填剤＜保持が強く溶出が困難＞充填剤の適用範囲と使用する溶媒

水、メタノール、アセトニトリル、アセトン、トルエン、ヘキサン C18・C8系充填剤

水、メタノール、アセトニトリルポリマー系充填剤

水、メタノール、アセトニトリル

シリカゲル充填剤ヘキサン、ジクロロメタン

イオン交換系充填剤水溶液（バッファー）

高い（親水性）低い（疎水性）









1 2

3 4

本日の内容

96well プレートシリンジ型

最も汎用な形状カラムがサンプルや溶媒

のリザーバーになり、操作が簡単ポリプロピレン製と

ガラス製を用意

通液方向とは逆方向から溶出が可能複数のカートリッジの

連結が容易

96サンプルを迅速処理自動化システムに対応

大容量サンプルに対し迅速処理が可能

リバーシブル型ディスク型

２．固相抽出カラムの使用方法様々なカラム形状

10

２．固相抽出カラムの使用方法サンプルマトリクスからの充填剤選択

サンプルマトリクスサンプルは何に溶解しているか？

水溶液有機溶媒

イオン性化合物非～中極性化合物

中～高極性化合物

順相吸着吸着逆相ｱﾆｵﾝｶﾁｵﾝ

C18 C8 Phenyl ST/DVB Poly Amide HLB

ENVITM-Carb Carboxen®

ST/DVB

NH2 PSA SAX

SCX WCX MCAX

CN NH2 PSA Si DIOL Florisil®

Alumina

ENVI-Carb Carboxen ST/DVB

①サンプル調製水溶液、バッファー溶液で調製（有機溶媒を10%以下にする）酸性化合物はpH3~4、中性化合物はpH6~7、塩基性化合物はpH7~9に調整粘性のあるサンプルは、1:1か1:2の割合でバッファー溶液で希釈

②コンディショニング再現性や回収率に関わる重要な作業 ⇒この後、詳しくメタノールやアセトニトリルのような水混和性溶媒をカラムサイズの

１～２倍量を通液サンプル溶液が水の場合は、溶媒通液後に水を通液させる

③サンプルロード通液速度を1秒間に1、2滴の一定速度に保つ

④洗浄 5～20%の溶媒やバッファー溶液通液速度は、液滴がつながらない程度

⑤溶出メタノールやアセトニトリルのような水混和性溶媒カラムサイズの１～２倍量を、1秒間に1,2滴の速度で通液イオン性化合物の場合、pH調整で回収率が改善

２．固相抽出カラムの使用方法 C18, C8, Phenyl, HLBなど（逆相モード）

①サンプル調製非極性溶媒（ヘキサン、ジクロロメタンなど）で抽出、希釈サンプル溶液中に水分が残存すると保持が弱くなるため、

硫酸Naや硫酸Mgで乾燥させる

②コンディショニングサンプルと同じ溶媒、もしくは非極性溶媒をカラムサイズの

2～3倍量を通液固相カラムに付着した水分も影響 ⇒この後、詳しく！

③サンプルロード通液速度を1秒間に1、2滴の一定速度に保つ

④洗浄サンプルと同じ溶媒、もしくは非極性溶媒通液速度は、液滴がつながらない程度

⑤溶出アセトン、メタノール、IPA、アセトニトリルのような溶媒カラムサイズの1～2倍量を通液分画を取る時は、徐々に溶媒の極性を高めていく

２．固相抽出カラムの使用方法シリカゲル, フロリジル, アルミナなど（順相モード）

①サンプル調製サンプル溶液をバッファー溶液で1:1に希釈し、目的物質が

イオン化するようpHを調整塩基性化合物は、pH3~6のバッファー溶液を10～25ｍM用いる酸性化合物は、pH7~9のバッファー溶液を10~50mM用いる

②コンディショニングメタノールやアセトニトリルをカラムサイズの1~2倍量通液サンプル調製で用いたバッファー溶液と同一のpHと塩濃度を持つ

バッファー溶液で充填剤固定相をイオン化させる

③サンプルロード通液速度を1秒間に1滴以下の一定速度に保つ

④洗浄サンプル調製で使用したようなpHを持つバッファー溶液通液メタノール、アセトニトリル水溶液通液速度は、液滴がつながらない程度

⑤溶出塩基性化合物は、2~5%水酸化アンモニウム/50~100%メタノール溶液酸性化合物は、2~5%酢酸/50~100%メタノール溶液強イオン性化合物は、1M以上の高塩濃度溶液

または、より選択性の高い対イオンの投入

２．固相抽出カラムの使用方法 SAX, NH2, SCX, WCXなど（イオン交換モード）

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２．固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について QuEChERS（キャッチャーズ）とは？抽出用の塩類や精製用の充填剤をサンプルと共に振盪し、遠心分離する前処理方法

Quick 迅速 : 前処理に必要な時間は約10分

Easy 簡単 : 複雑な操作なし

Cheap 安価 : 高額な機器は不要使用する消耗品はいずれも安価

Effective 効果的 : サンプル量が少量で使用可能

Rugged 堅牢 : 多検体ルーチン分析を行うのに十分な方法

Safe 安全 : 有害な化学物質や塩素系溶媒は不使用 1サンプルの溶媒の使用量は約10~12mL と少量なため安全

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２．固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について苺の残留農薬分析抽出工程

• サンプルを凍らせドライアイスと共にホモジナイズしたものを、秤量しアセトニトリルを添加、振盪する

• 抽出用塩類の充填剤を加えて振盪し、遠心分離をする

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２．固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について苺の残留農薬分析精製工程

• 遠心分離後、上澄みを分取し精製用充填剤を加え振盪する

• 遠心分離後、上澄みを分取し試験溶液に調製する

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２．固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について製品ラインアップ









1 2

3 4

本日の内容

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３．コンディショニングの目的コンディショニングの重要性

カラムの洗浄ブランク低減

チャネリングの予防充填剤と溶媒をしっかり接触させる

充填剤間・フリッツの気泡を抜く通液速度の安定化

充填剤（順相系）の活性化保持挙動の安定化

固相抽出カラムの性能を最大限に発揮するには？

コンディショニングをしっかりと行うことが大切

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サンプルが均一なバンドを形成しないと、適切なクロマトグラフィーが行えない

３．コンディショニングの目的チャネリングの予防

使用した固相抽出カラム：C18 1g/6mL

左：コンディショニング無し

右：アセトニトリル5mL 水5mL×2回でコンディショニング

サンプル：アズレンスルホン酸ナトリウム水溶液 40mg/mLを2滴(うがい薬）を添加洗浄：水 5mL

チャネリング

コンデイショニング無し

コンデイショニング有り

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気泡の除去により、通液速度は約2.5倍に上昇

３．コンディショニングの目的充填剤間・フリッツの気泡除去

• カーボン系の固相抽出カラムにヘキサンを流した通液速度・・・・・0.9mL/min

• 気泡が存在したので除去した通液速度・・・・・2.3mL/min

気泡気泡の存在で通液速度が大幅に異なったこの実験ではカラム出口付近に気泡があったため除去できたが、充填剤間やフリッツ中の気泡に対してどう対処するか？

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• 気泡を除去して、通液速度を安定化させる • 固相抽出カラムごとの通液速度のバラツキを無くす • 充填剤と溶媒・サンプルの接触効率を向上させ、負荷量を最大化する

ユニークな気泡の除去方法をご紹介します。バキュームマニホールドが使用できる環境をご用意ください。

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①必要な本数の固相抽出カラムをバキュームマニホールドの付属ラックにセットする

②コンディショニング溶媒を固相抽出カラムに入れる

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③付属ラックごと真空槽に入れる

④減圧する

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充填剤とフリッツ中の気泡が、ほぼ完全に除去できる


⑤減圧するおよそ30秒～1分間

細かい気泡が上昇

下部からも気泡が抜ける

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各コンディショニング方法による比較使用した固相抽出カラム：C18 1g/6mL

A B C

5ｍLアセトニトリルを用い、3つの方法でコンディショニングした後、 5ｍLアセトニトリルを自然落下で通液させその時間を測定

ばらつきがある

均一である


自然落下による通液速度比較アセトニトリル 5mL通液時間コンディショニング方法 Tube#1 Tube#2 A：マニホールド気泡除去 4m19s 4m17s B：吸引法 3m51s 5m02s C：加圧法 4m47s 5m06s

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順相系充填剤では、活性度の違いが保持挙動に表れやすい

３．コンディショニングの目的充填剤の活性化

使用した固相抽出カラム：シリカゲル 1g/6mL（同一ロットで保管条件が異なる２本を比較）

コンディショニング: n-ヘキサン 3mL ↓ サンプル: 200µL アズレン 2mg/mLヘキサン溶液 ↓ 溶出：n-ヘキサン 3mL × 2回

ヘキサン 3mL

ヘキサン 3mL追加

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順相系充填剤はヘキサンを通液させても、水分は残存し活性度は上がらない


水

一般的な順相系固相抽出のコンディショニング

ヘキサン

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順相系固相抽出カラム（シリカ・アルミナ・フロリジルなど）の活性度を高く一定にするには？

第21回農薬残留分析研究会 1998年シリカゲルカラムの前処理効果（財団法人残留農薬研究所、杉本、島村、小林、加藤）でも、一定した活性度と固相抽出由来の妨害物質の低減化が可能との報告あり。

• 従来法充填剤を130℃のオーブンで一晩乾燥させる

カートリッジ充填されているカラムは、加熱不可能充填剤のみを乾燥させて、使用前にカートリッジへ充填する

• 代替案アセトン通液後、ヘキサンで平衡化する

30

アセトンで水を除去することで活性度を高く一定にする


改良した順相系固相抽出のコンディショニング

水

アセトンヘキサン

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0

10,000

20,000

30,000

40,000

50,000

60,000

70,000

80,000

90,000

100,000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Acetone Volume (mL)

Mos

itur

e C

onte

nt (

ppm

) in

elu

ate

Ag ION 750mg/6mL

Alumina N 2g/6mL

DSC-NH2 1g/6mL

DSC-SAX 1g/6mL

DSC-SCX 1g/6mL

PSA 1g/6mL

LC-Florisil/LC-Si = 1g/1g/6mL

アセトン洗浄によるカラム中の水分除去

水分測定アセトンを流し溶出液を分画捕集した溶出液中の水分量をKarl Fisher水分測定装置（電量法）で測定

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0

100 ,000

200 ,000

300 ,000

400 ,000

500 ,000

600 ,000

700 ,000

800 ,000

900 ,000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Hexane Voume (mL)

Peak

are

a of

ace

tone

in el

uate

Ag ION 750mg/6mL

Alumina N 2g/6mL

DSC-NH2 1g/6mL

DSC-SAX 1g/6mL

DSC-SCX 1g/6mL

PSA 1g/6mL

アセトンからヘキサンへの平衡化

アセトン-ヘキサン平衡化アセトン洗浄後ヘキサンを流し、その溶出液を分画捕集した溶出液中のアセトン含有量をHPLC-UVで測定

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同一ロットだが保管状況により活性が変わったため、保持挙動にも影響した


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Elution Volume (mL)

Elut

ion %

Supelclean LC-Alumina-N 1g/6mL without acetone washing

#1#3

Biphenyl

#77

#54

#30

#37#104

#126#155

#169

#188

#189

#194

#202

#206

#208

#10 #15

#209

Hexane Acetone

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

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80%

90%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Elution Volume (mL)

Elut

ion %

Biphenyl

#1

#37

#10

#15

#3#169

#155

#77

#54

#104

#30

#188#202

#209

#194

#206

#208

#189

Oil

#126

Hexane Acetone

ヘキサンコンディショニングのみ

Tube#1 Tube#2

使用した固相抽出カラム：Alumina N 1g/6mL

PCB異性体20成分を分画 Tube#1とTube#2は、同一ロットで保管状況が異なる


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Elution Volume (mL)

Elut

ion

%

Hexane Acetone

Biphenyl

#1

#3

# 10

# 15

#30 #37

#54

#77

#104

#126

#169

#155

#188

#189

#202

#194#208

#206

#209

Oil

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水分除去により活性が上がるため、保持は強くなる傾向にある


0%

10%

20%

30%

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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Elution Volume (mL)

Elut

ion %

Biphenyl

#1

#37

#10

#15

#3#169

#155

#77

#54

#104

#30

#188#202

#209

#194

#206

#208

#189

Oil

#126

Hexane Acetone

アセトン-ヘキサンコンディショニング

Tube#1 Tube#3

使用した固相抽出カラム：Alumina N 1g/6mL

PCB異性体20成分を分画 Tube#3は、アセトン-ヘキサンコンディショニングを行った










1 2

3 4

本日の内容

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通液速度は、1～2mL/min（約1～2滴/秒）程度が最適である

４．自然落下を快適に行うテクニック通液速度と回収率の関係

Journal of Chromatography, 622 (1993) 53-60

回収率90%以上

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４．自然落下を快適に行うテクニック様々な溶出方法

• 減圧吸引迅速に作業できるが、液枯れの恐れあり ⇒ 液面監視が必要なため、多検体処理は困難

• 加圧方式この3つの中では最もデメリットが少ない。 ⇒ 加圧させる専用器具が必要、多検体処理は困難

• 自然落下最も簡便な方法で、多検体処理も可能気泡の影響により、通液速度が安定しない ⇒ マニホールドを使用した気泡除去で解決溶出に時間がかかる ⇒ ディスポーサブルライナーの使用で解決

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４．自然落下を快適に行うテクニックディスポーサブルライナーの活用

• マニホールドを使用した気泡除去後は、固相カラム毎の通液速度が均一になっている

• 気泡除去後は、自然落下での溶出において

充填剤部の液枯れの心配がなく作業が容易 • さらに、ディスポーザブルライナーの接続で

通液速度をアップさせる

製品型番：57059 ディスポーザブルライナー

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ディスポーザブルライナー：8cm の接続で、通液速度は約2倍になったこのライナーの長さに比例して通液速度が変化するため、調整も可能

４．自然落下を快適に行うテクニックディスポーザブルライナーの活用

使用した固相抽出カラム：Supelclean™ Sulfoxide 3g/6mL ディスポーザブルライナーの長さと自然落下での通液速度

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Discovery®シリーズシリカゲル基材のラインアップ Lot 間のバラツキを最小にする為、厳重な品質管理を行っており、製品には充填剤物性の証明書付き

逆相：C18、C8、Phenyl、CN 順相：Si、Diol、NH2

イオン交換：SAX、SCX、WCX、MCAX

固相抽出カラム製品ラインアップ

SupelTM-Selectシリーズポリマー基材のラインアップ

シリカゲルではないため、残存シラノールの影響や不純物金属の影響を受けないため、高い回収率が得られます。

逆相：HLB イオン交換：SAX、SCX、WCX、MCAX

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使用目的別の固相抽出カラム

固相抽出カラム製品ラインアップ

HybridSPE®-Phospholipid リン脂質除去用

SupelMIP®

分子構造認識ポリマー

EZ-POP NP 油中のPAHs用

Sulfoxide トランス油中のPCBs用

Supel™-Tox マイコトキシン専用多機能カラム

Ag-ION 脂肪酸メチルエステル分画用

Z-Sep 脂質除去用

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ありがとうございました

【お問い合わせは】シグマアルドリッチジャパンテクニカルサポート TEL 03-6756-8245 E-Mail: [email protected]

固相抽出カラム、ディスポーサブルライナーはサンプルのご用意がございます。

ブースにお越しいただくか、後日お気軽にお申し付け下さい。

Webサイトからもご請求いただけます sigma.com/spe-jp

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2015年11月にメルクミリポアとシグマアルドリッチはひとつの会社メルクとして活動を開始しました。現在、世界65ヶ所の製造拠点を持ち、業界で高い評価を受けている多くのブランドを含む、30万を超える幅広い製品を提供しています。

主なお取扱いブランド：Millipore, Merck, Supelco, Sigma-Aldrich, Cerilliantなど

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