Richiami di Bioenergetica
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Richiami di Bioenergetica
Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare col
Potenziale Elettrochimico
Il Potenziale Elettrochimico è l’Energia disponibile nelle Reazioni
Chimiche per compiere Lavoro
Potenziale Elettrochimico
J/Mol
Unità = Energia/Mole
o=Go/mol
L’Energia in una Reazione
= iprodotti – Nireagenti Ni = Rapporto Molare dei Reagenti
1 A + 1 B 2C
= C – A – B
In generale:
Per la nosra particolare reazione:
All’Equilibrio:
= 0
Equilibrio
Ene
rgia
del
Sis
tem
a
Per una Reazione che va verso l’Equilibrio:
< 0
Equilibrio
Ene
rgia
del
Sis
tem
a
Il Potenzale Elettrochimico è la risultante di diversi fattori:
1) Composizione Molecolare
4) Pressione Osmotica, …
2) Concentrazione3) Potenziale Elettrico
Energia dovuta alla Composizione Molecolare
• Energia Conformazionale – Energia Entropica contro Stabilità dei legami
• Solubilità-Interazione con il Solvente– Coefficiente di Partizione
• Misurata in Condizioni Standard
o
Condizioni Standard
• Concentrazione 1 Molare • In Acqua Pura• pH=7• Pressione = 1 atmosfera
Le Condizioni Standard sono le condizioni della reazione appropriate per l’esperimento con i reagenti ad una concentrazione Molare:
Energia di Concentrazione
• L’Energia del Gradiente di Concentrazione:
= RT ln([C]/Molare)
R = Costante dei Gas (Joules*Mole-1*K-1)
T = Temperatura (Kelvin, K)
Energia del Potenziale Elettrico
• L’Energia dovuta alle cariche in un Campo Elettrico:
= z F z = Cariche (Moli di Carica/Mole) = Potenziale Elettrico (Energia/Coulomb di Carica) V = J/C F = Costante di Faraday: 105 Coulomb/Mole di Carica
Potenziale Elettrochimico
= o + RT ln + zF[Conc]
[Conc]o
[Conc]o è la Concentrazione in Condizioni Standard
Cambiamento Conformazionale
A B
= (oB +RT ln([B]))-(o
A + RT ln([A]))
= B – A= 0
All’Equilibrio:
(oB + RT ln([B]))-(o
A + RT ln([A])) = 0
-RT ln ([B]) + RT ln ([A]) =oB – o
A =o
-RT ln ([B]) + RT ln ([A])
Distribuzione di Boltzmann
A B(o
B + RT ln([B]))-(oA + RT ln([A])) = 0
-RT ln ([B]/[A]) =o
[B]/[A] = Keq
All’Equilibrio:
Risolvendo rispetto a:
= exp (-o/RT)
Cambiamento Conformazionale
Modello di Gating del Canale
Le particelle di gating agiscono all’interno della proteina-canale con modalità interpretabili in termini di una distribuzione di Boltzmann.
Consideriamo un sistema a due stati nel quale ciascun canale è aperto dal movimento di una singola particella di gating di carica z
Secondo il modello di H&H un unico movimento della particella di gating causato da una variazione del campo elettrico provoca un cambiamento conformazionale del canale:
)(A)(C 21
Voltaggio-dipendenza del gating
Le posizioni e corrispondono a due minimi nel profilo energetico e vi è una singola barriera energetica tra di esse. In una popolazione di N canali simili, n1 avranno la loro particella di gating in posizione e n2 in posizione , cosicchè n1+n2=N.
En
erg
ia
Barrieraenergetica
+ +
Equazione di Boltzmanndella meccanica statistica
Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato o nello stato con le differenze di energia u2-u1=u dei due stati:
kTuu
PP 12
1
2exp
k cost. di BoltzmannT temp. assolutau2-u1 è espressa in joules
La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore
Stato 1 Stato 2
Energiau
In assenza di campo elettrico (E=0) la distribuzione di Boltzmann dell’energia della popolazione di molecole sarà:
Dove:n1 il no di particelle con energia u1 in posizione (1) (canale chiuso)n2 il no di particelle con energia u2 in posizione (2) (canale aperto),u2-u1 è la variazione di energia libera (G) relativa al cambio conformazionale da 1 a 2
kT
wexp
kT
uuexp
n
n 12
1
2
Quindi, in assenza di un campo elettrico la differenza di energia conformazionale (u2-u1) tra le posizioni 1 e 2 corrisponde al lavoro chimico (w) per muovere ciascuna particella di gating da 1 a 2.
1o caso: il campo elettrico transmembrana è zero
Se esiste un campo elettrico (E0) la componente energetica posseduta dalla particella in quanto elettricamente carica sarà: -zeV
z no di cariche in ciascuna particella di gatinge carica elementare dell’elettrone (=4.8·10-10 ues=1.6·10-10 coulombV potenziale elettrico
Quindi, includendo la componente di energia (lavoro) elettrica, avremo:
kT
zeVwexp
n
n
1
2
Se nel nostro sistema il canale è aperto quando la particella di gating è in (2) e chiuso quando è in (1),
la frazione di canali aperti è anche uguale alla frazione di particelle in (2):
)(A)(C 21
kT/zeVwexpnn
nPo
1
1
21
2
2o caso: il campo elettrico transmembrana è da zero
Fra
z. d
i can
ali a
pert
i Po
Ponendo si ottiene:ze
wV / 21 kTVVze
Po/)(exp1
12/1
dove V1/2 è il voltaggio V al quale metà dei canali sono aperti (Po=0.5).
Notare che quanto più è elevata la carica z, tanto maggiore è la pendenza della curva
kT/zeVwexpPo
1
1Ritorniamo all’equazione:
Ricordiamo che w corrisponde al lavoro per muovere ciascuna particella di gating dalla posizione 1 alla 2 ovvero, la differenza di energia tra le due posizioni in assenza di un potenziale di membrana.
L’equazione di Boltzmann dà una curva sigmoide in un grafico lineare di Po in funzione di V. Quanto più elevata è z tanto maggiore è la pendenza della curva
Fittando i dati sperimentali di H&H per il Na e per il K con
l’equazione si ottiene z(K)3.9 e z(Na)
4.8 kTzeV
Po/exp1
1
Z=4.8 (Na) Z=3.9 (K)
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Co
nd
utt
an
za (
S)
Voltaggio (mV)
0
0.5
1
Pro
b.
ca
na
le a
pe
rto
Gmax
1) Semplicemente potrebbe essere la quantità di carica mossa da un lato all’altro della membrana durante il processo di gating.
2) Potrebbero però esistere più particelle di gating per canale.
Che significato ha il valore di z?
Per esempio con quattro particelle che si muovono indipendentemente, il valore di z ottenuto applicando la precedente equazione si riferirebbe a ciascuna singola particella e la carica di gating per l’intero canale sarebbe 4z.
)kT/qVexp(
)RT/FVexp(
)kT/Gexp(
)RT/exp(
]A[
]B[
P
P
o
o
A
B
R=8.3143 joule·K-1·mol-1
k=1.38054·10-23 joule·K-1
R=NA·k (6.0222·1023 mol-1·1.38054·10-23 joule·K-1)
NA≡Numero di Avogadro: n. di molecole contenute in una mole (6.0222·1023mol-1)
F=96490 C·mol-1
V=statVolt (299.8 volt)=erg/ues=10-7 joule/0.333 ·10-9 C
eo ≡carica elementare dell’elettrone (0.16022 ·10-18 C)
o=Go/mol
F/RT=eo/kT
Alcune definizioni…..
A 0 mV
L’attività del canale è caratterizzata dalla
relativa stabilità dello Stato Attivato rispetto
a quello chiuso e non dipende dalla
posizione delle cariche rispetto al campo
elettrico, dal momento che non c’è un
gradiente di potenziale elettrico.
A)=o(A)
C)=o(C)
Bagno
Citoplasma
Membrana
EM
0 mV
Distribuzione di Boltzmann Basata solo su o
EM Nessun Effetto
EM Nessun Effetto
A)=o(A)
C)=o(C)
+
+
(Gate) = zG · F · 0 mV = 0
(Gate) = zG · F · 0 mV = 0C
A
En
erg
ia
A -70 mV
L’attività del canale è caratterizzata dalla
relativa stabilità dello Stato Chiuso e
dipende dalla posizione delle cariche
rispetto al campo elettrico, dal momento che
c’è un gradiente di potenziale elettrico.
A)
Bagno
Citoplasma
CMembrana
EM
-70 mV
La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo stato C
EM Stabilizzante
+
+
A
(Gate) = zG · F · 0 mV = 0
(Gate) = zG · F · -70 mV < 0
EM Destabilizzante
o(A)
o(C)E
ne
rgia
C)
a +40 mV
L’attività del canale è caratterizzata dalla
relativa stabilità dello Stato Attivato e
dipende dalla posizione delle cariche
rispetto al campo elettrico, dal momento che
c’è un gradiente di potenziale elettrico.
Bagno
Citoplasma
Membrana
EM Destabilizzante
+
+
EM
+40 mV
La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo Stato A
C
A
(Gate) = zG · F · 0 mV = 0
(Gate) = zG · F · 40 mV > 0
EM Stabilizzante
A)=o(A)
C)=o(C)
A)C)
En
erg
ia
Il gating dei canalivoltaggio-dipendenti
Come fa il voltaggio ad aprire i canali?
Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling
ovvero
Canali ionici voltaggio-dipendentiFamiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM)
Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità
Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P)
Vi appartengono:Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+
Canali del K+ Ca2+-attivatiCanali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.
Questa è una delle 4 (pseudo)subunità
H5
I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci
Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
OUT
IN
N
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
C
Ca2+ channel
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
OUT
IN
N
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++
C
Na+ channel
OUT
IN
N C
S1 S2 S3 S4 S5 S6P+
+
++K+ channel X 4
Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa.
Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer
Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
In
V
-
- +
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-Out
Attiva la spirale
2
5
4
2
4
5
Il movimento del sensore del voltaggio, facendo aprire il canale,
produce una corrente ionica
+50 mV-100 mV
1000 pACorrente Ionica
+50 mV-100 mV
Corr. di Gating Soluzione senza K+
1000 pA
10 pA1 ms
Corrente Ionica
Il movimento del sensore del voltaggio produce anche una corrente di gating
come è possibile smascherare la corrente di gating?
+50 mV-100 mV
10 pA1 ms
Carica totale di gating
Numero dei canali= cariche elementari /canale
Corr. di Gating Soluzione senza K+
Il movimento del sensore del voltaggio produce una corrente di gating
Ig = dqg/dt qg = ∫Igdt
Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL4
2
0
-2
-4
q/n
(e- charges)
1 2 3 4 5 6 7
R KR neutral AA
R=arginina
K=lisina
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL4
2
0
-2
-4
q/n
(e- charges)
1 2 3 4 5 6 7
R KR neutral AA
Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
Nel canale del K+ “Shaker” la presenza di 4 segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la “ripida” dipendenza dell’attivazione del canale dal voltaggio.
Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in due fasi distinte:
1) Prima indipendentemente l’una dall’altra;
2) Poi in maniera cooperativa, portando all’apertura.
MacKinnon_Nature01473.pdfMacKinnon_Nature01580.pdfMacKinnon_Nature01581.pdf
Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix
La visione del tetramero del canale K+ è dal lato intracellulare. Ciascuna subunità è colorata separatamente e contiene 6 -eliche (etichettate S1-S6 alle loro estremità N-terminali nella subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e il filtro di selettività per il K+. Le eliche S4 formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K+ sono colorati in verde.
Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix
Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)
Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+.
Chiuso: Vr=-100 mV
Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Aperto: depolarizz.
Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+.
Lo stato chiuso prevale al potenziale di riposo della cellula (~ -100 mV).
Lo stato aperto è favorito da una depolarizzazione della membrana.
In questo modello, S2 è assunto rimanere inalterato durante lo switch; S3a e S3b subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia rimodellata.
Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
chiusoUna Subunità, Chiusa: Delle eliche S2-S4 è mostrata l’ossatura. Le arginine che conferiscono la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come bastoncini colorati. Sono mostrati anche l’ossatura del filtro di selettività e gli ioni K+.
Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
In aggiunta al movimento della “paletta sensore del voltaggio", notare nello stato aperto la formazione di un ponte salino (legame ionico) tra l’Asp 80 e l’Arg 133.
aperto
Accessibilità dei Residui
Interno
Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati in magenta sono esposti allo spazio interno.
Accessibilità dei Residui
Nella conformazione aperta, i residui evidenziati in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o si estendono verso di esso.
Esterno
La struttura del canale del K+ KvAP è descritta in:A. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, & MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure of a Voltage-Dependent K+ Channel". Nature 423: 33
I movimenti delle palette del voltaggio sono descritti in:B. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A, & MacKinnon, R. (2003) "The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ Channel". Nature 423: 42
[1ORQ.pdb & 1ORS.pdb]
FINE