Qrt pcr final

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    30-Jun-2015
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Algo de información sobre métodos moleculares.

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  • 1. Tcnica de laboratorio usada para reproducir segmentos cidosnucledos mediante unproceso cclico, queCuantificacin genera gran cantidad extremadamente difcil, de copias que puedenya que la PCR da origenser usadas en estudios a la misma cantidad de o anlisis posteriores productoindependientemente dela cantidad inicial demolculas de DNApresente en las muestras- Higuchi et al- Producto es monitoreado durante elcurso de la reaccin y no en el puntofinal (end point)- Sondas fluorescentes

2. PCR En Tiempo RealTcnica de amplificacin y cuantificacin de ADN yARNm que utiliza tecnologas fluorescentes paraevidenciar la amplificacin de una secuencia corta sistemasfluorescentes sondas deagentes hidrolisis y de intercalanteshibridacin Sondas sondas TaqmanmolecularSondas FRETBeacons 3. Fluorocormos que aumentan su fluorescencia cuando se unen a una doble cadena de DNASYBR Green 4. Facilita las condiciones Unin inespecfica a de optimizacin y escualquier doble cadenamas barato que las de DNA y tambin a lossondas especificasdmeros de cebadores(fluorescencia inespecfica) 5. DesventajasSolucionesFundamento: Buen diseo de los Curva De Fusin cebadores y condiciones optimas(melting curve)de reaccinDiferentes molculas de DNA de doble cadena se abren a diferente temperaturas Factores Concentracin de La longitud de EstructuraFactores qumicos que hacen parte deguanina y fragmento desecundaria ylos componentes de citosina amplificacin terciaria reaccin 6. 1. Las sondas Taqman2. Sondas Molecular Beacons3. Sondas FRET 7. Oligonucletidos lineales que son etiquetados con un fluorocromodonador (reporter) en la porcin 5 como FAM (6-carboxifluorescena) y unaceptor (quenber) en la porcin 3 como TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).Dependen de la actividad 5 nucleasa de la Taq ADN polimerasa para suruptura durante la sntesis de una nueva hebra. 8. Cada amplicon nuevosintetizadoSeal emitidase generaAntes que los fragmento cebadoresdeamplificacin o secuenciablancoEl lugar en el que anilla la sonda 9. Oligonucletidos de cadena simple zona de apareamiento de bases interna No dependen de su hidrlisisForman una para generar la sealhorquilla fluorescente (harpin) 10. La emisin defluorescencia se dadurante la etapa deanillamientola sonda se linealisa lo que permite quelos fluorocromos se separenel donador emita su seal la cual esdetectada por elequipo. 11. Se compone de dosUna de la sonda lleva unasondas que se unenmolcula donadora en su especficamente a porcin 3 y la otra lleva unsecuencias del ADNaceptor en su porcin 5blanco. 12. se da la trasferencia deLa fluorescenciaenerga hacia el aceptorse excitar a la Cuando laemitida esque absorbe la energamolcula directamentesondas se anillanemitida por el donador y la donadora en una proporcional allongitud de onda al ADN blanco, emite en otra longitud deestas se unen aumento dedeterminadaonda ADN en cadaciclo 13. En PCR en tiempo real se deben manejar una serie deconceptos relacionados con el anlisis e interpretacin degraficas generadas por el software luego de un proceso deamplificacin.Fase inicial o backgroundLa curva deFaseComponentes amplificacinexponencial Fase de mesetao plateau 14. Nivel basal de la fluorescencia emitida Definido durante los primeros ciclos de la PCR Lnea base Programada en cada software de PCR en tiempo real (baseline) Es el punto de corte de la fluorescencia por encima de la lnea baseUmbral A partir de esta lnea de corte se calcula los valores de Ct(threshold) Refleja el punto en el cual un numero suficiente de amplicones seha acumulado dentro de la reaccin y se presenta un crecimiento Ct o CPexponencial(threshold cycle) 15. Parmetro que permite establecer laconfiabilidad de la estimacin del numero decopias y se debe calcular para cada reaccin. Directamente en el software.Debe estar entre el 90 y el 100%Doble de molculas de DNA que en el ciclo anterior 16. cuantificacinrelativa(expresin de cuantificacinun gen absolutadeterminado(numero en unexacto demomentocopias de unestableci del gen) ciclo celular) Establecer unnumero relativode copiascuando seutiliza un gen de referencia. 17. Mtodo mas sensible parala deteccin y cuantificacinde niveles de expresin degenes a partir de muestraspequeas de tejidoDepende de una RT-PCR entiempo real(retrotranscripcin o kinetic RT-PCR)mide el cambio relativo en losniveles de expresin deARNm y se basa en compararlos niveles de expresin deuna muestra problema frentea un gen constructivo 18. Se utiliza una curva de calibracin,la cual se realiza con diluciones seriadas de un estndar con unaconcentracin conocidaLa curva estndar produce una relacin linealentre Ct y la concentracin inicial de ARN oADN, lo que permite la determinacin de laSon altamente reproducibles yconcentracin de muestras desconocidas conpermitengenerardatosbase a sus valore de Ct especficos y sensibles. 19. Control sin DNAControl Negativo de Control Positivo de(NTC) con soloExtraccinReaccinmezcla de reaccin. Muestra negativa a Muestra positiva a Es muy importantela que se realizala que se realizaincluir los NTCstodo el proceso de todo el proceso de siempre en cadaextraccin.extraccin.reaccin paraasegurar que lo No debe generar Debe generarque se estacurva de curva demidiendo noamplificacin. amplificacin.corresponde aalgn tipo decontaminacin. 20. El equipo necesario:1. Termociclador2. Lector de fluorescencia3. Filtros4. Fuente lumnica (lmpara halgena, LED o un laser) 21. TERMOCICLADOR Permite el anlisis de los datos para reportarla cuantificacin, anlisis de curvas de fusiny la discriminacin allicas LECTOR DE FLUORESCENCIA Es una seria de componentes que colectan la luz a travs de varios dispositivos pticos que permiten el paso y la salida de la luz visible sobre el tubo de reaccin gracias a un grupo de filtros que detectan todo el rango de la luz visible. FUENTE LUMINICA Genera las longitudes de onda requeridas para excitar los fluorocromos utilizados en la PCR 22. Identificar pequeas La utilizacin de las En la detencin de mutaciones o curvas de fusin para el patgenos depolimorfismos en genesgenotipaje, ya que cadaimportancia medica, concausantes de fragmento generado gran nfasis en ensayos enfermedadestendra diferente tamao cuantitativos para virus, heredadas.y por ende, diferente Tm. bacterias, levaduras yparsitos protozoos.1. 2.3. 23. En oncologa ya que se en la deteccin de requiere de pequeas mutaciones puntuales, cantidades de tejido y es diagnostico, seguimiento til en ensayos dey respuesta al amplificacin y expresin tratamiento.de genes, duplicacin y deleccin gentica4.5. Monitorizacin para laseguridad de alimentos,bioterrorismo, en la rea de biotecnologa, etc. VIDEO 6. 24. Permite obtener resultados reproducibles,confiables, rpidos y ofrece gran cantidad deaplicaciones. Facilita la cuantificacin de ADN y ARN sea masprecisa ya que se utilizan curvas estndar y losresultados se basan en la obtencin de losvalores de Ct Algunas complicaciones se pueden solucionar sise tiene un experimento diseado y realizadorigurosamente y con lo controles adecuados. 25. Deteccin cuantitativa del virus psorosis de ctricos mediante RTPCR tiempo realQuantitative diagnosis of citrus psorosis virus by real timeRTPCR Implementar un protocolo de RTPCR tiempo real para la deteccin del CPsV y determinar concentracin viral en hojas de rboles de naranja Mars afectados por psorosis en el Estado de Nuevo Len (NL), Mxico.