Qrt pcr final

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    20-Jul-2015
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MTODOS DE ANLISIS DE LA EXPRESIN GENTICA QRT-PCR (real time pcr, quantitative pcr)

MTODOS DE ANLISIS DE LA EXPRESIN GENTICA

QRT-PCR(real time PCR, quantitative pcr)Julin Danilo Bonilla 070100062009Germn Andrs Caicedo070150052009

Real Time PCRTcnica de laboratorio usada para reproducir segmentos cidos nucledos mediante un proceso cclico, que genera gran cantidad de copias que pueden ser usadas en estudios o anlisis posteriores PCRCuantificacin extremadamente difcil, ya que la PCR da origen a la misma cantidad de producto independientemente de la cantidad inicial de molculas de DNA presente en las muestrasLimitaciones- Higuchi et al- Producto es monitoreado durante el curso de la reaccin y no en el punto final (end point)- Sondas fluorescentesQRT-PCR

Agentes Intercalantes

Fluorocormos que aumentan su fluorescencia cuando se unen a una doble cadena de DNA

SYBR Green Ventajas DesventajasFacilita las condiciones de optimizacin y es mas barato que las sondas especificas

Unin inespecfica a cualquier doble cadena de DNA y tambin a los dmeros de cebadores (fluorescencia inespecfica)

DesventajasSondas de hidrlisis y de hibridacin

Las sondas TaqmanSondas Molecular BeaconsSondas FRET

Sondas TaqMan

Oligonucletidos lineales que son etiquetados con un fluorocromo donador (reporter) en la porcin 5 como FAM (6-carboxifluorescena) y un aceptor (quenber) en la porcin 3 como TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).

Dependen de la actividad 5 nucleasa de la Taq ADN polimerasa para su ruptura durante la sntesis de una nueva hebra.

Sonda Molecular Beacons Oligonucletidos de cadena simplezona de apareamiento de basesinternaNo dependen de su hidrlisis para generar la seal fluorescente

Forman una horquilla (harpin)

La sonda FRET

Se compone de dos sondas que se unen especficamente a secuencias del ADN blanco.

Una de la sonda lleva una molcula donadora en su porcin 3 y la otra lleva un aceptor en su porcin 5

Definiciones sobre anlisis de DatosEn PCR en tiempo real se deben manejar una serie de conceptos relacionados con el anlisis e interpretacin de graficas generadas por el software luego de un proceso de amplificacin.

Eficiencia de la PCR en tiempo realParmetro que permite establecer la confiabilidad de la estimacin del numero de copias y se debe calcular para cada reaccin.Directamente en el software.

Debe estar entre el 90 y el 100%

Doble de molculas de DNA que en el ciclo anterior

Estrategias de Cuantificacin

Cuantificacin Relativa

Cuantificacin AbsolutaSon altamente reproducibles y permiten generar datos especficos y sensibles.

Controles y ContaminacinInstrumentacinEl equipo necesario:TermocicladorLector de fluorescenciaFiltros Fuente lumnica (lmpara halgena, LED o un laser)

AplicacionesVIDEOConclusionesPermite obtener resultados reproducibles, confiables, rpidos y ofrece gran cantidad de aplicaciones.Facilita la cuantificacin de ADN y ARN sea mas precisa ya que se utilizan curvas estndar y los resultados se basan en la obtencin de los valores de CtAlgunas complicaciones se pueden solucionar si se tiene un experimento diseado y realizado rigurosamente y con lo controles adecuados.

Articulo de AplicacionDeteccin cuantitativa del virus psorosis de ctricos mediante RTPCR tiempo realQuantitative diagnosis of citrus psorosis virus by real time RTPCR

Implementar un protocolo de RTPCR tiempo real para la deteccin del CPsV y determinar concentracin viral en hojas de rboles de naranja Mars afectados por psorosis en el Estado de Nuevo Len (NL), Mxico.

Gracias!