ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

ĐỖ KHÁNH LINH

ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG

KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

ĐỖ KHÁNH LINH

ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG

KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. PHẠM VĂN HÙNG

TS. TRẦN THỊ THANH HUYỀN

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của rất

nhiều người.

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm

Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế,

TS. Trần Thị Thanh Huyền, Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự

nhiên ĐHQG Hà Nội, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá

trình thực hiện đề tài luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ trong bộ môn Vi

sinh vật học và khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia

Hà Nội đã có nhiều chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và

Sinh phẩm Y tế đã tài trợ kinh phí để tôi có thể thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Trần Văn Bé, Viện trưởng Viện vắc xin và

Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện vềphòng thí nghiệm và cung cấp lượng lớn động

vật thí nghiệm giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Để hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các bạn

đồng nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Lan Phương, CN.Nguyễn Lan

Anh, các anh chị đồng nghiệp của phòng QC,Viện vắc xin và Sinh phẩm Y tếvà Ths.

Lê Thị Hoàng Yến, CN. Nguyễn Phương Liên cùng các anh chị đồng nghiệp trong

Khoa Vi khuẩn – Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi

trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học Viên

Đỗ Khánh Linh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1.VI KHUẨN BẠCH HẦU VÀ BỆNH BẠCH HẦU ......................................... 3

1.1.1 Những nét chung về vi khuẩn bạch hầu ...................................................... 3

1.1.2Độc tố bạch hầu ............................................................................................ 4

1.1.3 Bệnh sinh ..................................................................................................... 4

1.1.4 Dịch tễ học ................................................................................................... 5

1.2VẮC XIN BẠCH HẦU ...................................................................................... 7

1.3MẪU CHUẨN .................................................................................................... 9

1.3.1Về thuật ngữ ................................................................................................. 9

1.3.2 Về phƣơng pháp điều chế ............................................................................. 9

1.3.3Tiêu chuẩn chất lƣợng ................................................................................ 11

1.3.4Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế ......................................................... 13

1.3.5Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia ...................................................... 14

1.4YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA ...... 16

1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU ................ 17

1.6PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU ............................. 19

1.6.1Phƣơng pháp thử thách trên chuột lang ...................................................... 20

1.6.2 Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt .......................................... 21

1.7ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN .............................................. 23

1.7.1Đánh giá độ ổn định dài hạn (Long- term Stability Studies) ..................... 23

1.7.2Đánh giá độ ổn định cấp tốc (Accelerated Stability Testing) .................... 23

1.7.2.1 Điều kiện tiến hành phƣơng pháp cấp tốc ............................................ 23

1.7.3 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff [1, 16]...................... 23

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 24

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ..................... Error! Bookmark not defined.

2.2.Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm và vật tƣ tiêu hao ........... Error!

Bookmark not defined.

2.2.1.Động vật thí nghiệm .................................. Error! Bookmark not defined.

2.2.2.Sinh phẩm –hóa chất ................................. Error! Bookmark not defined.

2.2.3.Vật tƣ trang thiết bị ................................... Error! Bookmark not defined.

2.3.THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU ............................. Error! Bookmark not defined.

2.4.THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU . Error! Bookmark not defined.

2.5.CỠ MẪU NGHIÊN CỨU ............................... Error! Bookmark not defined.

2.6.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... Error! Bookmark not defined.

2.6.1 Đánh giá cam quan .................................... Error! Bookmark not defined.

2.6.2Đánh giá vô trùng ....................................... Error! Bookmark not defined.

2.6.3Đánh giá đô âm tôn dƣ ............................... Error! Bookmark not defined.

2.6.4Đánh giá đô chân không ............................. Error! Bookmark not defined.

2.6.5Đánh giá nhận dạng .................................... Error! Bookmark not defined.

2.6.6 Đánh giá tính đồng nhất về khối lƣợng ..... Error! Bookmark not defined.

2.6.7Đánh giá công hiệu và tinh đông nhât về công hiệuError! Bookmark not

defined.

2.6.8Dƣ đoan han dung cua văc xin mâu chuân . Error! Bookmark not defined.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............. Error! Bookmark not defined.

3.1. ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU SAU XUẤT XƢỞNGError! Bookmark not

defined.

3.1.1. Đánh giá cảm quan ................................... Error! Bookmark not defined.

3.1.2. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng ........................ Error! Bookmark not defined.

3.1.3. Đánh giá độ chân không ........................... Error! Bookmark not defined.

3.1.4. Đánh giá độ ẩm tồn dƣ ............................. Error! Bookmark not defined.

3.1.5. Đánh giá nhận dạng .................................. Error! Bookmark not defined.

3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT ................. Error! Bookmark not defined.

3.2.1. Đánh giá tính đồng nhất về trọng lƣợng khôError! Bookmark not

defined.

3.2.2. Đánh giá tính đồng nhất về công hiệu ...... Error! Bookmark not defined.

3.3DỰ ĐOÁN TUỔI THỌ CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨNError! Bookmark

not defined.

KẾT LUẬN .................................................................. Error! Bookmark not defined.

KIẾN NGHỊ ................................................................. Error! Bookmark not defined.

Tài Liệu Tham Khảo ............................................................................................... 25

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1 Hình ảnh vi khuẩn bạch hầu 3

1.2 Cấu trúc độc tố bạch hầu 4

1.3 Màng giả ở hầu họng do độc tố bạch hầu 5

1.4 Nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tƣ. 11

2.1 Sơ đồ nhỏ mẫu của phƣơng pháp nhận dạng bạch hầu. 29

3.1 Sự nguyên vẹn của ống mẫu RD6 34

3.2 Đồ thị biểu diễn độ chụm của các kết quả độ ẩm tồn dƣ của mẫu

RD6 37

3.3 Kết quả nhận dạng thành phần bạch hầu trong mẫu RD6 38

3.4

Biểu đồ biểu thị trọng lƣợng khô của mẫu RD6 thực hiện tại NICVB

và IVAC. 39

3.5 Đồ thị biểu diễn độ chụm của các kết quả trọng lƣợng khô của mẫu

RD6 40

3.6 Biểu đồ biểu thị kết quả công hiệu của RD6 thực hiện bởi NICVB và

IVAC 41

3.7 Đồ thị biểu diễn độ chụm của các kết quả công hiệu của mẫu RD6 42

3.8 Đồ thị biểu diễn Sự phụ thuộc công hiệu bạch hầu của RD6 bảo

quản ở nhiệt độ 500C theo các tháng.

44

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên Bảng Trang

2.1 Công thức pha loãng vắc xin 31

2.2 Công thức pha các mẫu RD6 pha loãng 34

3.1 Kết quả kiểm tra cảm quan mẫu chuẩn RD6 tại NICVB và IVAC 35

3.2 Kết quả kiểm tra vô trùng tại NICVB và IVAC 36

3.3 Kết quả kiểm tra chân không của mẫu chuẩn RD6 36

3.4 Kết quả độ ẩm tồn dư thực hiện tại NICVB và tại IVAC 37

3.5 Kết quả công hiệu RD6 (trên chuột lang) tại các thời điểm ủ mẫu ở nhiệt độ 500C/ độ ẩm 75%

43

DANH MUC CHƢ VIÊT TĂT

STT Chƣ viêt tăt Chu giải

1. ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng

chuẩn Hoa Kỳ)

2. ĐTBH Độc tố bạch hầu

3. DTP Diphtheria- Tetanus- Pertussis

(Bạch hầu –Uốn ván – Ho gà )

4. ED50 Effective dose (Liều bảo vệ 50% động vật thí nghiệm).

5. IU International Unit (Đơn vị quốc tế)

6. KĐTBH Kháng độc tố bạch hầu

7. LD50 Lethal dose 50

(Liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm sau 96 giờ)

8. Lf Limes flocculation: Đơn vị lên bông quốc tế

9. MCQG Mẫu chuẩn quốc gia

10. MCQT Mẫu chuẩn quốc tế

11. NIBSC National Institute for Biological Standards and Control

(Viện Quốc gia về Sinh phẩm chuẩn và chuẩn sinh học)

12. NICVB National Instistute for Control of Vaccines and

Biologicals.

(Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế)

13. NMSL Nƣớc muối sinh lý

14. SSI Staten Serum institiute (Viện huyết thanh quốc gia Đan

Mạch)

15. IVAC Institute of vaccine and biological (Viện vắc xin và chế

phẩm sinh học)

1

MỞ ĐẦU

Bạch hầu là một bệnh nhiễm khuẩn , nhiêm đôc do vi khuân Gram (+)

Corynebacterium diphtheriae gây ra. Bênh bach hâu đa gây ra nhiêu vu dich lơn va

nguy hiêm ơ nhiêu quôc gia trên thê giơi . Và hiện nay sử dụng vắc xin là biện pháp

quan trong nh ất để phong bệnh bạch hầu . Chât lƣơng văc xin bach hâu đƣ ợc đánh

giá qua các tiêu chí: an toàn và hiệu quả. Thƣ nghiêm kiêm tra công hiê u la thƣ

nghiêm cân thiêt đ ể đánh giá hiệu quả của vắc xin. Thƣ nghiêm nay cân co mâu

chuân do công hiêu cua văc xin mâu thƣ đƣơc xac đinh qua so sanh tƣơng quan vơi

văc xin mâu chuân đa biêt trƣơc gia tri công hiêu .

Để thống nhất kết quả kiểm định vắc xin bạch hầu trên toàn thế giới, Tô

chƣc y tê thê giơi (WHO) đa thiết lập mâu chuân bach hâu quôc tê , do NIBSC

sản xuất và hiện đang sử dụng mẫ u chuân lân th ứ tƣ với hàm lƣợng 213 IU/ống.

Do số lƣợng mẫu chuẩn Quốc tế có hạn nên WHO khuyến cáo các quốc gia nên

có mẫu chuẩn tại địa phƣơng cho kiểm định tưng lô vắc xin [40]. Ở Việt Nam ,

ngoài vắc xin DTP sản xuất trong nƣớc , chúng ta con nhập vắc xin DTP của

nhiêu nƣơc đê phuc vu nhu câu phong bệnh cua nhân dân , do đo viêc kiêm tra

công hiêu thanh phân bach hâu co tân suât kha lơn . Nhà sản xuất cần vắ c xin

mâu chuân quôc gia đ ể kiểm định công hiệu của vắc xin trong quá trình sản

xuất, con Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế cần mẫu chuẩn

Quốc gia để kiểm định các vắc xin xuât xƣơng va đăng ky . Hiên nay , chúng ta

chƣa co văc xin m ẫu chuẩn quốc gia bạch h ầu, thêm vào đó mẫu chuẩn Quốc tế

chỉ có đơn vị trên chuột lang. Vì vậy, mẫu chuẩn Quốc gia đƣợc thiết lập và nối

chuẩn với MCQT theo đơn vị miễn dịch trên chuột lang. Phƣơng pháp này có

chi phí rất tốn kém và khả năng có đƣợc lƣợng chuột lang lớn để làm thƣờng

quy là không khả thi với nhiều phong thí nghiệm. Do vậy, việc chuyển đổi sang

phƣơng pháp dùng chuột nhắt và sử dụng đơn vị trên chuột nhắt là rất cần thiết.

Việc chuyển đổi này đƣợc thực hiện ở tưng Quốc gia. Song chƣa có bất cứ

phong thí nghiệm nào công bố. Tƣ nhƣng ly do đo Viên kiêm đinh Quôc gia Văc

2

xin va Sinh phâm y tê đa phôi hơp vơi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC)

sản xuất vắc xin bach hâu d ự tuyển mâu chuân Quôc gia và ti ến hành:

“Xác định tính khả dụng của Vắc xin bach hâu đông khô RD6 dự

tuyểnmẫu chuẩn Quốc gia” với mục tiêu sau:

Xây dựng một quy trình chuẩn định chất lượng Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia

Bạch hầu đông khô để làm thước đo đánh giá, kiểm định các vắc xin xuất xưởng

phục vụ cho sức khỏe cộng đồng.

Mục tiêu cụ thể:

1. Đánh giácác chỉ tiêu sau xuất xƣởng

2. Xác định giá trị công hiệu bạch hầu trên chuột lang của Vắc xin mẫu chuẩn

dự tuyển.

3. Dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn.

4. Đánh giá tính đồng nhất của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. VI KHUẨN BẠCH HẦU VÀ BỆNH BẠCH HẦU

1.1.1 Những nét chung về vi khuẩn bạch hầu

Vi khuẩn Bạch hầu ( tên La tinh: Corynebacterium diphtheriae) hay con

có tên “vi khuẩn Klebs-Loefler”, thuộc chi Corynebacterium, là những trực

khuẩn Gram (+), hình chùy, thƣờng đứng thành đám nhƣ chữ nho. Loại trực

khuẩn này thƣờng gặp trong tự nhiên. Chúng là những trực khuẩn thẳng hoặc hơi

cong, có thể chứa các hạt nhiễm sắc. Hạt nhiễm sắc thƣờng ở hai đầu trực khuẩn

làm cho vi khuẩn phình ra nhƣ hình chùy. Loài trực khuẩn này không có vỏ,

không có lông và không có nha bào. Vi khuẩn bạch hầu là loài hiếu kỵ khí tùy

tiện, chúng chuyển hóa glucose theo cả hai con đƣờng (Embden-Meyenhof-

Parnas và Pentose phospahte). Chúng ƣa môi trƣờng có máu, huyết thanh và

pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ 370C. Nuôi cấy vi

khuẩn bạch hầu cần môi trƣờng chọn lọc có chứa tellurite. Vì vậy trong sản xuất

vắc xin ngƣời ta thƣờng dùng môi trƣờng tổng hợp tư acid amin và một số yếu

tố khác, khi đó trực khuẩn bạch hầu phát triển tốt và thu đƣợc ngoại độc tố thuận

lợi hơn[5].

Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn bạch hầu.

Độc tố đƣợc tạo ra chỉ khi trực khuẩn này sản sinh ra loại vi rút đặc hiệu,

vi rút mang gen độc, có khả năng giết chính nó. Chỉ những loại mang gen độc

mới gây bệnh nghiêm trọng. Vi khuẩn bạch hầu có bốn tuýp sinh học là Gravis,

intermedius, mitis và belfanti. Tất cả các chủng này đều có khả năng sản xuất

4

độc tố gây bệnh nghiêm trọng. Và đặc tính để phân biệt với các loài

Corynebacterium khác là vi khuẩn bạch hầu thƣờng sống ở vùng họng miệng và

da.

1.1.2 Độc tố bạch hầu

Năm 1888, Roux và Yersin đã phát hiện: khi lấy dịch lọc trong canh khuẩn

vi khuẩn bạch hầu tiêm cho động vật thì gây bệnh giống nhƣ tiêm vi khuẩn bạch

hầu. Điều này đã chứng minh Corynebacterium diphtheriae gây ra bệnh bạch hầu,

do vi khuẩn này sản sinh ra một ngoại độc tố có độc lực rất cao[2, 5].

Ngoại độc tố bạch hầu là những glycoprotein có trọng lƣợng phân tử

khoảng 63.000 dalton, gồm hai tiểu phần A và B. Tiểu phần B, trọng lƣợng

phân tử 41.000 dalton, chƣa biết về hoạt tính enzym, nhƣng có nhiệm vụ bám

vào màng tế bào cảm thụ giúp tiểu phần A (trọng lƣợng phân tử 22.000 dalton)

chui vào tế bào và ngăn cản giải phóng các ARN vận chuyển, sau khi nó đã

đƣa các acid amin đến các polyribosom trong việc tổng hợp protein nên sự tổng

hợp protein bị ngăn cản và làm tế bào chết. Độc tố bạch hầu chịu đƣợc nhiệt

đun sôi trong 5 phút và khá ổn định trong môi trƣờng acid hoặc kiềm mạnh.

Các chủng vi khuẩn bạch hầu không độc có thể biến đổi thành chủng độc bằng

việc chuyển phage mang gen độc Toxt[2].

Hình 1.2: Cấu truc độc tố bạch hầu

1.1.3 Bệnh sinh

Bạch hầu là một bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm độc do vi khuẩn bạch hầu

5

Corynebacterium diphtheriae gây ra. Trực khuẩn bạch hầu sinh sản tại nơi tổn

thƣơng và sản xuất ra ngoại độc tố. Ngoại độc tố thâm nhập vào cơ thể và gây ra

tổn thƣơng ở nhiều cơ quan. Màng giả ở họng miệng là dấu hiệu đầu tiên của nhiễm

khuẩn bạch hầu có thể thấy ở ngƣời. Biểu hiện chính của bệnh là gây viêm đƣờng

hô hấp trên, thƣờng là ở vùng họng nhƣng đôi khi lan truyền đến mũi, thanh quản

và khí quản. Nguy hiểm hơn là ngoại độc tố của vi khuẩn có thể lan truyền đến các

cơ quan nhƣ cơ tim, hệ thần kinh, thận… khiến ngƣời bệnh có những biến chứng

nguy hiểm nhƣ liệt, biến chứng tim và có thể tử vong[5, 20].

Hình 1.3: ( ) Màng giả ở hầu do độc tố bạch hầu

1.1.4 Dịch tễ học

Ngƣời ta đã ghi nhận rằng, bệnh bạch hầu lây lan bằng những giọt nƣớc bọt

tư bệnh nhân hoặc ngƣời mang trực khuẩn bạch hầu. Nó lây trực tiếp tới những

ngƣời cảm nhiễm. Do đó dịch bệnh bạch hầu có thể xảy ra ở nhiều mức độ khác

nhau: các trƣờng hợp tái phát, các vụ dịch bé hoặc các vụ dịch lớn có tính chất

vùng. Bệnh bạch hầu thƣờng xuất hiện trong những tháng lạnh ở vùng ôn đới. Bệnh

có tính mùa, thƣờng tản phát, có thể phát triển thành dịch, nhất là ở trẻ dƣới 15 tuổi

chƣa có miễn dịch đầy đủ[14].

Bệnh bạch hầu lƣu hành rộng rãi ở mọi nơi trên thế giới và đã gây nên các

vụ dịch nghiêm trọng, nhất là ở trẻ em trong thời kỳ chƣa có vắc xin dự phong.

Năm 1923 vắc xin giải độc tố bạch hầu ra đời và tư đó đến nay tính nghiêm trọng

của bệnh dịch đã thay đổi trên toàn thế giới[2].

6

Bệnh bạch hầu chỉ xảy ra ở những cá thể nhạy cảm (thiếu miễn dịch). Trong

vùng dịch bạch hầu lƣu hành, bệnh bạch hầu xuất hiện ở những ngƣời không tiêm

vắc xin hoặc có tiêm nhƣng không đầy đủ. Tỷ lệ chết cao của bệnh bạch hầu thƣờng

ở vùng kinh tế thấp, phát hiện bệnh chậm và không đƣợc điều trị kịp thời. Sự khó

khăn về kinh tế, xã hội là điều kiện tốt cho các bệnh nhiễm trùng trong đó có bệnh

bạch hầu. Vậy nên trong chiến tranh bạch hầu là bệnh nhiễm trùng phổ biến

nhất[15].

Theo thông báo của nhiều nƣớc, tỷ lệ mắc bạch hầu liên quan chặt chẽ với

việc tiêm vắc xin bạch hầu. Ở Anh và Wales, tư năm 1915-1942, số lƣợng bệnh

nhân bạch hầu hàng năm là 50.000 và số chết khoảng 4000 ngƣời vào những năm

đầu và 2500 ở những năm cuối. Sau đó ngƣời ta thực hiện tiêm chủng toàn dân.

Năm 1950, số lƣợng mắc bạch hầu giảm xuống 962 và tử vong khoảng 49 trƣờng

hợp; đến năm 1965, số mắc là 25 và không có tử vong. Đại chiến thế giới thứ 2 đã

cản trở việc tiêm phong, dẫn đến khoảng 3 triệu ngƣời bị bệnh bạch hầu ở châu Âu

trong thời gian này[5, 25].

Một sự kiện đáng lƣu ý là do những biến động xã hội ở một số nƣớc nhƣ

Nga, Ucraina…đã làm gián đoạn việc tiêm chủng vắc xin bạch hầu cho trẻ em trong

những năm 80 của thế kỷ trƣớc. Do đó bệnh bạch hầu đã phát triển và bùng nổ

thành dịch lớn ở những nƣớc này trong những năm đó. Ví dụ năm 1994, ỏ Nga đã

có hơn 39.000 ngƣời mắc bệnh bạch hầu với 1.100 ngƣời chết và ở Ucraina có hơn

3000 ngƣời mắc. Tuổi mắc bệnh là trên 15 tuổi[12, 26].

Ở khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, hiện nay số mắc bệnh bạch hầu hàng năm

đã giảm rõ rệt do hiệu quả của việc tiêm phong vắc xin bạch hầu cho trẻ em đƣợc

thực hiện có kết quả ở các nƣớc trong khu vực. Những năm đầu thập kỷ 80 của thế

kỷ trƣớc, hàng năm ở đây có trên 13.000 trƣờng hợp bạch hầu, đến năm 1990 giảm

xuống con 1130 trƣờng hợp và năm 1994 chỉ con 614 trƣờng hợp[28].

Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong chƣơng

trình tiêm chủng mở rộng thì bệnh bạch hầu thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết

các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ dân cƣ cao. Bệnh xuất hiện nhiều

7

vào các tháng 8, 9, 10 trong năm. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên

tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần tư 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống

0,14/100.000 dân năm 2000 và 0,009/100.000 dân năm 2009. So với tỷ lệ mắc bệnh

0,14/100.000 dân của ho gà, 6,2/100.000 dân của bệnh sởi (năm 2009), có thể thấy

hiệu quả phong bệnh bạch hầu do tiêm vắc xin này khá cao[4].

Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, tất cả các nƣớc nên ƣu tiên tiêm

phong cho trẻ dƣới một tuổi đủ 3 liều vắc xin DTP, đạt ít nhất 90% và tiêm nhắc lại

để có miễn dịch lâu dài. Lịch tiêm phong đƣợc xem xét cụ thể ở tưng nƣớc, tùy theo

tình hình dịch tễ bệnh.

1.2 VẮC XIN BẠCH HẦU

Vắc xin bạch hầu là vắc xin giải độc tố. Loại vắc xin này đƣợc sản xuất tư

ngoại độc tố của vi khuẩn đã đƣợc làm mất tính độc nhƣng vẫn giữ đƣợc tính kháng

nguyên. Vắc xin giải độc tố kích thích cơ thể sản xuất ra kháng độc tố, loại kháng

thể có khả năng trung hoa ngoại độc tố. Vắc xin này nhằm phong chống các bệnh

nhiễm trùng do vi khuẩn gây bệnh chủ yếu bằng ngoại độc tố.

Năm 1923, Ramon nhận thấy độc tố bạch hầu khi xử lý bằng formalin thì sẽ

mất độc tính nhƣng vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, có khả năng tạo kháng thể

chống lại bệnh, tư đó vắc xin bạch hầu ra đời.

Với những tiến bộ của miễn dịch học và các ngành khoa học khác, việc sản

xuất vắc xin bạch hầu đã đƣợc cải tiến qua nhiều giai đoạn và tập trung vào các vấn

đề sau:

1. Thay đổi phương pháp sản xuất: Tư thủ công (nuôi cấy tĩnh) sang nuôi

cấy theo quy trình công nghệ sinh học (nuôi cấy chìm trong nồi lên men).

2. Thay đổi các phương pháp giải độc: Dùng hóa chất nhƣ ICl3, formalin

hoặc các biện pháp chọn chủng giống đột biến để thu thẳng giải độc tố.

3. Cải tiến khâu tinh chế: Cô đặc bằng phƣơng pháp thủ công đến phƣơng

pháp hiện đại với hệ thống siêu lọc. Ngày nay hệ thống lọc tách nhƣ

Metafilter, TFF đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất các vắc xin vi khuẩn.

8

4. Phối hợp tá dược: Giải độc tố ban đầu dùng gel hấp phụ để tăng và kéo

dài hoạt tính miễn dịch. Thƣờng dùng gel của nhôm hydroxyd Al(OH)3

hoặc Al(PO) 4 để hấp phụ. Hoặc dùng các oligonucleotid chứa CpG

demetyl hóa đƣa vào vắc xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo

hƣớng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào.

5. Phối hợp kháng nguyên: Phối hợp thành vắc xin đa giá để có hiệu quả

kinh tế, tăng hiệu quả tưng thành phần trong kháng nguyên và giảm bớt

số mũi tiêm chủng hoặc làm giảm bớt số lần tổ chức tiêm chủng. Các vắc

xin bạch hầu phối hợp 3 thành phần (Bạch hầu- Ho gà- Uốn ván), 4 thành

phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt), 5 thành phần (Bạch

hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B), 6 thành phần (Bạch

hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B- Hib) đã ra đời[2, 36].

Ở Việt Nam, vắc xin bạch hầu đƣợc nghiên cứu sản xuất tư những năm 60

tại Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội bằng phƣơng pháp nuôi cấy tĩnh, phối hợp với

thành phần uốn ván để tạo vắc xin nhị liên DT (Bạch hầu- Uốn ván).

Năm 1986, Viện Vắc xin (IVAC) chính thức sản xuất phối hợp DTP tinh chế cô

đặc và hấp phụ bằng AlPO4 theo tiêu chuẩn WHO. Vắc xin này đã đƣợc dùng trong

chƣơng trình tiêm chủng mở rộng Quốc gia nên tỷ lệ mắc bệnh bạch hầu ở Việt Nam

đã giảm tư 1187 trƣờng hợp (năm 1984) xuống con 188 trƣờng hợp (năm 1991). Hiện

nay IVAC vẫn đang tiếp tục sản xuất vắc xin này và đang có dự án với Cuba để sản

xuất vắc xin phối hợp 5 thành phần (Bạch hầu- Ho gà - Uốn ván- Bại liệt-Hib)[2, 24].

Ở Việt Nam, vắc xin DTP nằm trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng và

tiêm ba mũi cho trẻ em với phác đồ 3, 4, 5 tháng tuổi. Mũi thứ tƣ tiêm nhắc lại sau

mũi thứ ba là một năm.

Theo khuyên cao cua tô chƣc y tê thê giơi WHO TRS No .980 và Dƣợc điển

Viêt Nam IV, văc xin bach hâu trƣơc khi sƣ dung phai đƣơc kiêm tra cac tiêu chuân

nhƣ: Cảm quan, nhân dang thành ph ần bạch hầu, công hiêu bạch hầu, tính chất vật

lý, an toan chung , an toan đăc hiêu bach hâu , vô khuân và m ột số chỉ tiêu lý hóa

khác[4, 28].

9

1.3 MẪU CHUẨN

Đối với mẫu chuẩn WHO có những khuyến cáo sau:

1.3.1 Về thuật ngữ

Chuẩn quốc ( IS): Mẫu chuẩn quốc tế (International biological measurement

standards, WHO International Standards, IS) là chế phẩm sinh học đƣợc cung cấp

để đảm bảo kết quả của các thử nghiệm sinh học hoặc miễn dịch học đƣợc biểu thị

theo cùng một cách trên toàn thế giới. Giá trị đƣa ra bởi WHO theo đơn vị quốc tế

(IU) hoặc đơn vị phù hợp khác. ISS đƣợc coi là mẫu chuẩn gốc cao nhất (primary)

để chuẩn định mẫu chuẩn quốc gia/mẫu chuẩn thứ cấp khác [35].

Chuẩn chính (Reference standards): Là những chất đƣợc sử dụng nhƣ thƣớc đo

trong các thử nghiệm. Nó cung cấp một đơn vị cơ sở hằng định cho việc xác định

công hiệu hoặc định lƣợng [35].

Chuẩn chính thứ cấp (Secondary reference standards): Là những chất chuẩn

chính đƣợc xây dựng bởi một khu vực hoặc một quốc gia hoặc bởi các tổ chức

khác. Chuẩn này đƣợc xác định dựa vào việc nối tới chuẩn ban đầu của WHO.

Những chất chuẩn này đƣợc sử dụng trong những thử nghiệm kiểm tra công hiệu

hoặc định lƣợng thƣờng quy [35].

1.3.2 Về phƣơng pháp điều chế

Trong sản xuất mẫu chuẩn yếu tố quan trọng hàng đầu là tính đồng nhất ổn

định và sự tƣơng đồng về thành phần với mẫu để thử nghiệm. Mẫu chuẩn có thành

phần càng tƣơng đồng với mẫu thử thì độ chính xác càng cao. Merthiolate là chất

thƣờng đƣợc sử dụng làm chất bảo quản vì nó không ảnh hƣởng đến chế phẩm

hoặc không bị thăng hoa khi làm khô chế phẩm. Những tá dƣợc khác lựa chọn

theo tiêu chí không làm giảm và không ảnh hƣởng đến hoạt tính cũng nhƣ độ ổn

định của sản phẩm.

Quá trình đông khô:

Mẫu chuẩn có thể đƣợc sản xuất dƣới dạng lỏng hoặc đông khô. Mẫu dạng

đông khô cho thấy độ ổn định và tuổi thọ cao hơn rất nhiều so với dạng nƣớc,

thông thƣờng khoảng hơn 10 năm trong khi dạng nƣớc chỉ tính theo tháng hoặc

10

vài năm. Dạng đông khô dễ vận chuyển hơn dạng nƣớc do yêu cầu về dây truyền

lạnh đơn giản hơn. Chính vậy hiện nay các nhà sản xuất đều ƣu tiên sản xuất

mẫu chuẩn ở dạng đông khô.

Nguyên lý: Sự thăng hoa phần nƣớc ở trạng thái rắn sang hơi hầu nhƣ không

gây hại cho sự sống cũng nhƣ các hệ thống enzym và tế bào khi quá trình xảy ra

nhanh ở nhiệt độ thấp và chân không. Tá dƣợc có tác dụng nhũ hóa và đông lạnh

không làm vỡ tế bào đồng thời ở điều kiện chân không đã loại gần hết oxy nên

chủng giống hoặc tế bào vi sinh vật không bị biến tính trong thời gian dài bảo quản

sau đó.

Cơ chế: Lạnh đông. Giai đoạn làm đông là cho phản ứng hóa học bị ức chế

không xảy ra, đồng thời làm ngƣng hẳn các hoạt động xúc tác của enzyme. Kỹ

thuật làm đông không chỉ tạo thể rắn cho sinh phẩm mà quan trọng hơn là hình

thành một trạng thái kết tinh tối ƣu có thể tránh đƣợc sự hủy hoại sinh phẩm trong

giai đoạn chuyển tư trạng thái lỏng sang trạng thái rắn.

Khi các tinh thể nƣớc đƣợc tạo nên sẽ loại các phân tử khác (NaCl,

đƣờng, protein…) và lớn dần lên cho tới khi đông cứng toàn bộ. Thời điểm đó là

điểm đông băng. Bằng máy hút chân không tinh thể sẽ chuyển sang dạng hơi

thoát ra ngoài đọng lại trong khoang condenser. Đốt nóng ở 300C ở áp lực chân

không trong ít nhất 1 giờ.

Sản phẩm sau đông khô dễ hút ẩm và hấp thụ oxy trở lại do đó cần hút chân

không hoặc dùng khí trơ lấp đầy khoang ống và hàn kín.

Hàn và đóng ống

Sản phẩm sau khi đông khô xong đƣợc nạp bằng khí trơ (nitơ) vô khuẩn vào

ống. Hàn sản phẩm dƣới ngọn đèn gas có nhiệt độ cao.

Quá trình đóng ống phải đảm bảo tính đồng nhất của mẫu do vậy các ống

nên đƣợc đóng tư một lọ đồng nhất và trong điều kiện thao tác nhƣ nhau. Nhiệt độ

và tốc độ khuấy trong khi đóng ống phải ổn định.Tránh nhiễm vi sinh vật, hóa chất

hoặc các tiểu phân trong không khí. Do đó, quá trình này phải đƣợc thực hiện trong

phong vô trùng. Có thể sử dụng dạng ống hoặc lọ thủy tinh có nút cao su và hàn kín

11

bên ngoài bằng nắp nhôm để sản xuất mẫu chuẩn . Hiện nay các đơn vị thƣờng

dùng dạng ống để sản xuất do độ hàn kín của ống tốt hơn giúp cho viêc bảo quản

sản phẩm đƣợc lâu hơn. Tuy nhiên, khi chọn dạng ống cần lƣu ý hình dạng, kích

thƣớc ống sao cho dễ bảo quản, dễ mở, dễ lấy hết sản phẩm [2, 21, 27].

Dán nhãn: Nhãn ghi đầy đủ các thông tin sau:

Tên đơn vị sản xuất: Nếu là mẫu chuẩn Quốc tế thì sẽ là WHO.

Tên mẫu chuẩn.

Năm thiết lập.

Mã số.

Số đơn vị Quốc tế

Điều kiện bảo quản.

Tên và địa chỉ nơi cấp phát.

Phải ghi “Không được dùng cho người”.

Ví dụ, nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế nhƣ sau:

Hình 1.4: Nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tƣ.

1.3.3 Tiêu chuẩn chất lƣợng

Mẫu chuẩn cần đạt đƣợc các yêu cầu về tính đồng nhất, tính đặc trƣng và

tính ổn định.

Đồng nhất là sự giống nhau giữa các ống mẫu chuẩn. Tính đồng nhất cao

cho thấy quy trình sản xuất ổn định, chất lƣợng giữa các ống mẫu nhƣ nhau làm

Tên đơn vị sản xuất

Mã số

Số đơn vị Quốc tế

Điều kiện bảo quản

Năm thiết lập

xuNămất

Tên mẫu chuẩn

12

giảm thiểu sai số khi làm thử nghiệm đồng thời các mẫu lấy để kiểm tra cũng có

tính đại diện tốt, phản ánh đƣợc chất lƣợng của cả lô vắc xin. Với vắc xin đông

khô, tính đồng nhất thể hiện ở hai chỉ tiêu: độ đồng đều về trọng lƣợng khô và công

hiệu.Trọng lƣợng khô thể hiện sự phân liều có đồng đều hay không. Công hiệu thể

hiện quá trình pha vắc xin lỏng có đồng đều hay không.

Tính đặc trƣng cho thấyloại thử nghiệm mà mẫu chuẩn đƣợc sử dụng, tư đó

cho thấy các đặc tính cần quan tâm của mẫu chuẩn. Ví dụ: Mẫu chuẩn cho thử

nghiệm công hiệu thì đặc tính cần quan tâm hàng đầu là giá trị công hiệu. Vắc xin

mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu đƣợc sử dụng trong kiểm định công hiệu của thành

phần bạch hầu nên kiểm tra tính đặc trƣng của mẫu chuẩn chính là kiểm tra chỉ tiêu

công hiệu [32, 35].

Tính ổn định: Vắc xin mẫu chuẩn là thƣớc đo cho vắc xin mẫu thử nên phải

ổn định trong một khoảng thời gian nhất định (tối thiểu là 5 năm). Để vắc xin đƣợc

ổn định, sản phẩm phải đạt yêu cầu về độ ẩm tồn dƣ, cảm quan, vô khuẩn và độ

chân không.Sự ổn định công hiệu của vắc xin cũng cần đƣợc kiểm tra trong quá trình sử

dụng.

Đáp ứng các tiêu chí trên cần kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ đồng đều

khối lƣợng, nhận dạng, vô khuẩn, độ ẩm tồn dƣ, độ chân không và công hiệu.

Trong đó:

Công hiệu (potency):Công hiệu là thử nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ của

vắc xin. Công hiệu đƣợc thể hiện bằng đơn vị miễn dịch hay hàm lƣợng các chất

tạo miễn dịch trong một đơn vị đo lƣờng. Công hiệu cần đƣợc kiểm tra bằng

phƣơng pháp phù hợp. Nên sử dụng các phƣơng pháp đã đƣợc khuyến cáo bởi

WHO hoặc các Dƣợc điển. Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia cần đƣợc nối với chuẩn

quốc tế của WHO (chuẩn gốc cao nhất) [8],[10]. Phƣơng pháp xác định giống nhƣ

phƣơng pháp sử dụng cho mẫu chuẩn Quốc tế. Trong trƣờng hợp sử dụng phƣơng pháp

khác cần có sự chuyển đổi đơn vị phù hợp.

Độ chân không, cảm quan:Đây là chỉ tiêu quan trọng cần đƣợc kiểm tra vì bất

kỳ sự nứt, vỡ dù rất nhỏ của ống đông khô sẽ khiến độ ẩm tồn dƣ trong ống tăng lên.

13

Độ ẩm tồn dư: Với mẫu chuẩn đông khô, độ ẩm tồn dƣ đƣợc coi là thông số

then chốt bậc nhất giúp cho sản phẩm ổn định lâu dài, đặc biệt là với vắc xin bạch

hầu. Vắc xin bạch hầu sản xuất tư giải độc tố bạch hầu (một loại protein). Phản ứng

giáng hóa protein xảy ra với xúc tác là nƣớc. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết

tụ và những phản ứng có hại khác đối với protein có liên quan đến hàm lƣợng nƣớc

tồn dƣ cao trong ống. Tiêu chuẩn cho chỉ tiêu này đối với vắc xin mẫu chuẩn Quốc

gia là dƣới 3% [17, 22].

Tính vô khuẩn: sản phẩm không bị nhiễm vi sinh vật sẽ có tính ổn định lâu dài.

Tính ổn định:Công hiệu cần đƣợc kiểm tra nhiều lần, ở nhiều thời điểm và nhiệt

độ bảo quản khác nhau. Qua đó ƣớc tính đƣợc thời gian sử dụng của sản phẩm, lƣu trữ

và phân phối đến các phong thí nghiệm. Sản xuất mẫu chuẩn là công việc tốn nhiều thời

gian, công sức nên mẫu chuẩn sản xuất phải có hạn dùng lâu dài (ít nhất 10 năm). Phải

sản xuất với số lƣợng đủ lớn để phục vụ cho sử dụng cũng nhƣ nghiên cứu trong nhiều

năm.[8].

Sự khác biệt lớn nhất giữa mẫu chuẩn Quốc tế với mẫu chuẩn Quốc gia là:

Với mẫu chuẩn Quốc tế cần có sự hợp tác giữa nhiều phong thí nghiệm trên thế giới

trong việc sản xuất cũng nhƣ trong kiểm định chất lƣợng. Con với mẫu chuẩn Quốc

gia thì có thể chấp nhận việc hợp tác ở phạm vi trong một Quốc gia.[8].

1.3.4 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế

Vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ nhất sản xuất năm 1955 ở

dạng hấp phụ với gel nhôm hydroxit, đạt 132 IU/ống. Năm 1978, Vắc xin Bạch hầu

mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ hai đƣợc sản xuất bởi Viện SSI dƣới dạng ống đông

khô. Mỗi ống chứa 100 Lf giải độc tố, 1 mg Al+++

, 26mg Haemacel khô, đạt 132

IU/ống. Cả hai mẫu chuẩn này đều đƣợc xác định công hiệu bằng phƣơng pháp thử

thách trên chuột lang. Sau đó, Yenny và cộng sự đã sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu

chuẩn ở dạng nƣớc và xác định công hiệu trên tế bào Vero thay thế cho phƣơng

pháp thử thách trên chuột lang. Mẫu chuẩn này đạt 173IU/ml. Tuy nhiên mẫu này

sau đó giảm công hiệu khá nhanh nên không đƣợc sử dụng làm mẫu chuẩn Quốc tế

[10]. Mẫu chuẩn lần thứ ba do Sanofi (Pháp) sản xuất năm 1999 với công thức :

14

70 Lf giải độc tố bạch hầu, 1 mg Al+++

, 10 mg trehalose trên một ống, đạt công hiệu

160 IU/ống. Mẫu chuẩn này đƣợc mã hóa 98/560.[8].

Vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu Quốc tế lần thứ tƣ (4th

WHO International

Standard for Diphtheria Toxoid, Adsorbed) đƣợc tuyển chọn tư hai vắc xin dự

tuyển do công ty Sanofi Pasteur (Pháp) và công ty Biken (Nhật Bản) sản xuất.Mẫu

chuẩn này đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu nhƣ: Cảm quan, độ ẩm tồn dƣ, độ vô trùng,

chân không, trọng lƣợng khô, công hiệu. Riêng với thử nghiệm công hiệu, NIBSC

đã tiến hành hợp tác với 30 phong thí nghiệm của 20 quốc gia trên thế giới kiểm

tra. Kết quả vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển của Biken với mã số 07/216, công hiệu đạt

213 IU/ống (theo phƣơng pháp thử thách trên chuột lang) đã đƣợc lựa chọn. Năm

2014, WHO đã công bố đây là giá trị công hiệu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp

thử thách trên chuột lang và mẫu chuẩn Quốc gia khi nối chuẩn phải sử dụng

phƣơng pháp này. Mẫu chuẩn này hiện chƣa có đơn vị Quốc tế trên phƣơng pháp

miễn dịch ở chuột nhắt[8]. Đây là khó khăn rất lớn cho các Quốc gia khi cần chuẩn

định mẫu chuẩn Quốc gia vì phƣơng pháp thử thách trên chuột lang đoi hỏi lƣợng

chuột lang khá lớn (ít nhất 72 chuột/ lần). Không phải phong thí nghiệm nào cũng

có thể có đƣợc lƣợng chuột lang nhiều nhƣ vậy trong một thời điểm. Hơn nữa chuột

lang giá cũng rất đắt khiến giá thành của phƣơng pháp này rất cao.

1.3.5 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia

Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia (Việt Nam) là loại chuẩn chính thứ

cấp (Secondary reference standards), đƣợc sử dụng làm chất chuẩn chính trong thử

nghiệm công hiệu bạch hầu tại NICVB và tại các nhà sản xuất trong nƣớc.

Năm 1991, viện Vắc xin (IVAC) đã phối hợp cùng Cencobi tiến hành sản

xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia. Vắc xin mẫu chuẩn khi đó đƣợc sản

xuất dƣới dạng lỏng, cho công hiệu trên 300 IU/ml nhƣng đã bị giảm công hiệu rất

nhanh. Chỉ sau ba năm công hiệu đã giảm gần nhƣ về không.

Năm 1999, GS.Nguyễn Thị Kê cùng cộng sự đã sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu

chuẩn Quốc gia theo công thức:

Trong 1 ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu:

15

- 60 Lf giải độc tố bạch hầu.

- AlPO4 6mg

- NaCl: 0.09 g

- Merthiolate: 100 µg.

- Dung dịch Dextran 3% (cho dạng đông khô).

Kết quả: Mẫu chuẩn đông khô mã số RD4 đạt công hiệu 172 IU/ống (đơn vị

trên chuột nhắt) và 340 IU/ống (đơn vị trên chuột lang). Mẫu chuẩn dạng nƣớc mã

số RD5 đạt công hiệu 173 IU/ml [3].

Tuy nhiên, mẫu chuẩn dạng nƣớc cũng giảm công hiệu rất nhanh sau đó, con

dƣới 30 IU/ml và không đƣợc sử dụng. Mẫu chuẩn đông khô có công hiệu chƣa cao

nên cần dùng tới bốn ống mẫu chuẩn cho một lần kiểm định dẫn đến kết quả chƣa

đầy hai năm đã hết.

Năm 2006, NICVB phối hợp với IVAC tiếp tục sản xuất vắc xin bạch hầu

mẫu chuẩn Quốc gia theo công thức:

Trong 1 ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu:

- 50 Lf giải độc tố bạch hầu.

- AlPO4: 3 mg

- NaCl: 9 mg

- Merthiolate: 100 µg.

Mẫu chuẩn này đạt công hiệu rất thấp, chỉ 35,3 IU/ống nên không đạt yêu

cầu sử dụng làm mẫu chuẩn.

Đứng trƣớc nhu cầu cần có mẫu chuẩn để phục vụ kiểm định thƣờng quy mẫu

vắc xin bạch hầu trong nƣớc và ngoài nƣớc của NICVB, của nhà sản xuất, chúng tôi

phối hợp với IVAC tiếp tục sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia.

Mục tiêu sản xuất mẫu chuẩn bạch hầu có công hiệu cao (trên 500 IU/ml) để

chỉ dùng một ống mẫu chuẩn cho một lần kiểm định. Mẫu chuẩn này phải có sự ổn

định công hiệu đáp ứng nhu cầu sử dụng trong thời gian dài (ít nhất năm năm) và

có đáp ứng trên chuột nhắt để có thể chuyển đổi sang đơn vị chuột nhắt.

16

Vắc xin bạch hầu là vắc xin giải độc tố nên giá trị công hiệu thu đƣợc phụ

thuộcvào hàm lƣợng kháng nguyên và tá chất đƣa vào. Thành phần ho gà trong vắc

xin DTP phối hợp giúp tăng công hiệu của bạch hầu và uốn ván.Do đó, vi khuẩn ho

gà đƣợc thêm vào mẫu chuẩn RD6 nhƣ là một tá chất và tăng hoạt tính so với các

nghiên cứu trƣớc đó. Ngoài ra, hàm lƣợng kháng nguyên bạch hầu trong mẫu RD6

cũng tăng lên là 90 Lf/ml. Số lƣợng mẫu sản xuất là 2370 ống vắc xin bạch hầu

đông khô.Nhiệt độ bảo quản: -200C.

1.4 YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA

Việc kiểm định thực hiện bắt đầu tư nguyên liệu đầu nhƣ: chủng gốc, chủng

sản xuất, nƣớc, hóa chất pha môi trƣờng, lọ, nắp nhãn… Trong quá trình sản xuất

việc giám sát và kiểm định chất lƣợng phải thực hiện thƣờng xuyên, theo đúng

SOP. Trong phong thí nghiệm, việc kiểm định chất lƣợng vắc xin này dựa trên các

tiêu chí chính sau đây:

Cảm quan:

Kiểm tra chân không

Tính đồng nhất trọng lƣợng khô

Vô khuẩn

Nhận dạng

Độ ẩm tồn dƣ

Công hiệu bạch hầu.

Nghiên cứu trƣớc đây của GS. Kê và cộng sự trong việc chuẩn định Mẫu

chuẩn bạch hầu Quốc gia RD4 có kiểm tra các thử nghiệm trên, nhƣng chƣa có

kết quả của các phong thí nghiệm khác nhau nên trong nghiên cứu này chúng

tôi sử dụng hai phong thí nghiệm là khoa KĐVX Vi khuẩn (NICVB) và phong

QC(IVAC) làm các thử nghiệm song song. Điều này cũng phù hợp với khuyến

cáo mới nhất của WHO là có sử dụng kết quả của các phong thí nghiệm khác

nhau trong việc chuẩn định Mẫu chuẩn Quốc gia [3].

17

1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU

Chuột nhắt và chuột lang là loài động vật đƣợc dùng phổ biến nhất trong

nghiên cứu y sinh học trong đó có sản xuất và kiểm định vắc xin. Đặc biệt, trong

kiểm định chất lƣợng vắc xin DTP hai loài này đƣợc sử dụng trong các thử nghiệm

quan trọng là an toàn, công hiệu.Trong phép thử xác định công hiệu của vắc xin,

phƣơng pháp thử thách trên động vật thí nghiệm thƣờng cho kết quả chính xác nhất.

Phƣơng pháp thử thách trên động vật chính là gây miễn dịch cho động vật bằng kháng

nguyên, sử dụng độc tố gây bệnh của vi sinh vật gây bệnh cho động vật đã miễn dịch.

Xem đáp ứng của động vật theo tỷ lệ sống/ chết hoặc mức độ liệt để đánh giá.

Chuột lang có nguồn gốc tư núi Andes ở Nam Mỹ, tư Colombia và

Venezuela xuống Brazil và Argentina. Lần đầu tiên chuột lang đƣợc sử dụng nhƣ

động vật thí nghiệm là vào đầu thế kỷ 19. Chuột lang thuộc bộ Rodentia, tiểu bộ

Hystricomorpha, họ Caviidae. Chuột lang có ba loại lông ngắn: English, lông xù xì

với các đốm hình hồng: Abyssian và lông dài: Peruvian. Chuột lang lông ngắn hầu

hết đƣợc dùng trong nghiên cứu y sinh học và chiếm 2-3% tất cả các động vật thí

nghiệm đã sử dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chuột English, do

IVAC cung cấp. Chuột lang là loài động vật phổ biến thứ tƣ (sau chuột nhắt, chuột

Na Uy và thỏ). Mặc dù theo xu hƣớng chung là giảm số lƣợng động vật trong

nghiên cứu trong những năm gần đây nhƣng chuột lang vẫn là một động vật thí

nghiệm quan trọng vì những đặc điểm độc đáo không tìm thấy ở các loài gặm nhấm

khác. Chuột lang là loài động vật thí nghiệm gặm nhấm ít hung hãn nhất, có thể vì

lịch sử thuần hóa lâu đời của nó. Nên các nghiên cứu sinh hóa, miễn dịch học, sinh

lý học và dƣợc học thƣờng đƣợc tiến hành trên đối tƣợng này. Chúng đƣợc sử dụng

chủ yếu cho sản xuất và kiểm soát huyết thanh, kiểm định chất lƣợng vắc xin và các

chế phẩm sinh học. Chuột lang dễ gây mẫn cảm, bằng cách tiêm nhắc lại trong một

phản ứng quá mẫn. Điều này đƣợc thực hiện để nghiên cứu phản ứng quá mẫn

chậm nhƣ đáp ứng miễn dịch tƣơng tự nhƣ đáp ứng miễn dịch ở ngƣời. Ngoài ra,

chuột lang là một vật chủ phù hợp cho một số bệnh do các vi khuẩn gây ra, chúng

rất nhạy cảm với một số các bệnh lây nhiễm nhƣ lao, bạch hầu…Đặc biệt chuột

18

lang rất nhạy cảm với độc tố bạch hầu. Đây là đặc tính quan trọng giúp cho chuột

lang là loài động vật đƣợc nhiều phong thí nghiệm có uy tín ƣu tiên sử dụng cho

thử nghiệm xác định công hiệu bạch hầu vì phƣơng pháp thử thách trên chuột lang

cho kết quả chính xác nhất. Tuy nhiên, chuột lang chỉ đẻ 2-5 con trong một lần sinh

và một năm đẻ khoảng 3,7 lần, lại có trọng lƣợng lớn (chuột trƣởng thành khoảng

800g – 1200g)nên so với chuột nhắt thì chuột lang có giá thành đắt hơn rất nhiều và

cũng cần diện tích lớn hơn trong việc nuôi dƣỡng cũng nhƣ khi làm thí nghiệm.

Đây cũng là khó khăn rất lớn cho các nƣớc đang phát triển khi làm thử nghiệm

công hiêu bạch hầu trên chuột lang, vì số lƣợng chuột này cho một lần làm thử

nghiệm ít nhất là 72 chuột. Không phải phong thí nghiệm nào cũng có khả năng có

và nuôi đƣợc số lƣợng lớn chuột này cho một thử nghiệm. Ở Việt Nam hiện chỉ có

Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) là có thể cung cấp đƣợc số lƣợng chuột

lang đáp ứng đƣợc nhu cầu trên [13].

Chuột nhắt là loài động vật đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu y

sinh. Nó thuộc bộ Rodentia, họ Muridae, loài Mus[8]. Ít nhất khoảng 1000 chủng

chuột nhắt khác nhau đƣợc sử dụng trong phong thí nghiệm. Chuột nhắt có hai loại

chuột thuần chủng (in-bred) : chuột BALBc và không thuần chủng (out-bred). Dù sử

dụng chuột thuần chủng cho kết quả đồng nhất hơn, tuy nhiên đa dạng di truyền của

chúng có giới hạn, và đôi khi chúng lại nhạy cảm với ảnh hƣởng của môi trƣờng hơn.

Bên cạnh đó, phép ngoại suy với con ngƣời cũng dễ hơn nếu thử nghiệm sử dụng

chuột không thuần chủng. Thêm vào đó, chuột thuần chủng có giá thành đắt hơn chuột

không thuần chủng khá nhiều. Nên hầu hết chủng chuột sử dụng cho kiểm định vắc xin

là chuột không thuần chủng [33]. Trong đó chuột Swiss là loài đƣợc sử dụng tƣơng đối

rộng rãi. Chuột Swiss trắng (Lynch 1969) có nguồn gốc tư một nhóm chuột nhỏ (02

đực và 07 cái)đƣợc đƣa tư Trung tâm Anticancéreux Romand de Lausance

(Switzerland) đến Viện Rockerfeller, New York vào năm 1962. Sau đó Viện này đã

nhân đàn và cung cấp rộng rãi ra toàn thế giới [8, 11]. NICVB và IVAC cũng đang duy

trì chuột này phục vụ cho làm thí nghiệm tại Viện. Tuy nhiên, chuột nhắt lại không

nhạy cảm với độc tố bạch hầu nên thử nghiệm công hiệu bạch hầu bằng phƣơng pháp

19

thử thách không áp dụng đƣợc. Thay vào đó, năm 1974, Miyamura K và cộng sự đã

tiến hành phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin bạch hầu

thông qua việc sử dụng tế bào Vero. Tế bào Vero là dong tế bào nhạy cảm nhất với độc

tố bạch hầu, do nó có khả năng chiếm đƣợc số lƣợng rất lớn các receptor của độc tố

này. So với chuột lang, chuột nhắt có kích thƣớc nhỏ hơn (< 50g/chuột), số lƣợng con

trong một lần đẻ cũng cao hơn (4-12 chuột/ lứa), số lần đẻ trong năm cũng cao hơn

(khoảng 8 lứa/ năm) nên phƣơng pháp này cho giá thành rẻ hơn và tính khả thi cao

hơn so với phƣơng pháp dùng chuột lang, nhất là với những nƣớc đang phát triển nhƣ

Việt Nam.

Nhìn chung, với thử nghiệm trên động vật,đáp ứng có thể quan sát và định

lƣợng đƣợc dựa trên biểu hiện “dƣơng tính’ hay “âm tính”, hoặc “sống” hay

“chết”. Một số đáp ứng sinh lý đặc biệt có thể xác định đƣợc nhƣ thay đổi nhiệt

độ, mức độ sản xuất kháng thể, tăng giảm trọng lƣợng. Khác với các thử nghiệm

hóa lý, thƣờng có độ chính xác cao, các thử nghiệm sinh học trên động vật thí

nghiệm có thể xác định hoạt tính sinh học với tính đặc hiệu và độ nhạy cao

nhƣng lại cho kết quả với độ chính xác thấp và độ biến thiên lớn tức là độ tái lặp

thấp. Đặc biệt với thử nghiệm công hiệu, độ dao động của 95% khoảng tin cậy

phụ thuộc vào độ dao động trong đáp ứng giữa động vật với động vật và phạm vi

này có độ dao động rất lớn. Theo thống kê, ở Châu Âu có khoảng 37% thử

nghiệm công hiệu bạch hầu phải tiến hành lại do kết quả không đáp ứng đƣợc

các tiêu chuẩn của thử nghiệm có giá trị [34]. Nhƣ vậy để thấy rằng thử nghiệm

trên động vật thí nghiệm gặp khá nhiều khó khăn.

1.6 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU

WHO TRS cũng nhƣ Dƣợc điển châu Âu, Dƣợc điển Việt Nam khuyến

cáo công hiệu bạch hầu cần đƣợc kiểm tra trên tất cả các lô vắc xin sản xuất.

Công hiệu vắc xin của nhà sản xuất đƣợc kiểm định bằng việc so sánh với vắc

xin mẫu chuẩn Quốc gia (secondary reference standards) và đƣợc tính theo

đơn vị IU.Có hai phƣơng pháp kiểm tra công hiệu bạch hầu đang đƣợc sử dụng

phổ biến đó là phƣơng pháp thử thách trên chuột lang (sau đây xin được gọi là

20

phương pháp trên chuột lang và đơn vị công hiệu thu được từ phương pháp này gọi

là đơn vị chuột lang) và phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt trên tế bào

Vero (sau đây xin được gọi là phương pháp trên chuột nhắt và đơn vị công hiệu thu

được từ phương pháp này gọi là đơn vị chuột nhắt).

Theo khuyến cáo mới nhất của WHO, do vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn

quốc tế đƣợc xác định công hiệu bằng phƣơng pháp thử thách trên chuột lang

nên khi chuẩn định mẫu chuẩn Quốc gia cũng phải sử dụng phƣơng pháp này

cho thử nghiệm công hiệu[30, 35].Sau đó các phong thí nghiệm có thể tiến hành

chuyển đổi sang đơn vị chuột nhắt để sử dụng trong các thử nghiệm thƣờng quy

(nếu phù hợp).

1.6.1 Phƣơng pháp thử thách trên chuột lang

Mối liên hệ giữa phƣơng pháp này với sự đáp ứng nồng độ kháng thể trên

ngƣời đã đƣợc nghiên cứubởi Greenberg tư năm 1953. Theo đó, lƣợng giải độc tố

đƣa vào tỷ lệ thuận với sự đáp ứng nồng độ kháng thể ở trẻ nhỏ. Do chuột lang có

độ nhạy cao với độc tố bạch hầu nên đây là phƣơng pháp đƣợc coi là tiêu chuẩn

vàng trong kiểm tra công hiệu bạch hầu [9].

Nguyên lý: Đƣa giải độc tố bạch hầu (protein) vào cơ thể chuột lang

(kháng nguyên). Cơ quan miễn dịch của chuột lang sẽ sinh kháng thể, kháng

thể này có khả năng trung hoà độc tố bạch hầu đƣa vào sau đó. Mức độ trung

hoa tỷ lệ thuận (đến một giới hạn nhất định không quá ngƣỡng của sự tê liệt

miễn dịch) với lƣợng giải độc tố đƣa vào. Đánh giá mức độ trung hoa bằng đáp

ứng trên chuột theo các cấp độ nhiễm độc tư nhẹ đến nặng nhƣ: mất thăng

bằng, liệt, chết. Tỷ lệ sống/ chết là thƣớc đo công hiệu của vắc xin.

Kỹ thuật: Chuột lang đƣợc tiêm miễn dịch (chứa giải độc tố bạch hầu) với mẫu

vắc xin chuẩn (đã biết công hiệu) và mẫu vắc xin thử (chƣa biết công hiệu) ở các khoảng

nồng độ khác nhau. Sau khoảng thời gian tuần thứ 4-6 sau khi tiêm miễn dịch, toàn bộ

chuột đƣợc tiêm thử thách với khoảng 50 liều LD50 độc tố bạch hầu. Theo dõi động

vật trong 5-7 ngày và ghi lại tỷ lệ sống chết ở mỗi độ pha[28][13].

21

Tính kết quả và biện luận:Kết quả đƣợc tính theo chƣơng trình Probit

analysis. Đây là chƣơng trình tính kết quả cho những phép thử định lƣợng (xác định

công hiệu) của vắc xin theo phƣơng pháp tiêm thử thách bằng đƣờng tiêm dƣới da.

Dữ liệu đƣa vào tính kết quả là tỷ lệ sống/chết của động vật ở các độ pha loãng của

mẫu chuẩn và mẫu thử. Trong phép tính toán này, liều biến đổi theo hàm logarit của

liều, và tỷ lệ đáp ứng quan sát đƣợc sẽ biến đổi theo mô hình probit. So sánh tƣơng

quan giữa mẫu chuẩn và mẫu thử để tính kết quả công hiệu của mẫu thử theo mẫu

chuẩn[28].

Theo đó để thử nghiệm có giá trị thì phải đáp ứng các tiêu chuẩn sau:

ED50 của mỗi loạt văc xin ph ải nằm giữa liều miễn dịch nhỏ nhất và lớn

nhất.Đáp ứng của chuột ở các độ pha loãng phải đạt đƣợc tính tuyến tính theo hàm

logarit và probit.

Ƣu điểm của phƣơng pháp thử thách trên chuột lang là cho kết quả có độ chính

xác cao. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng để xác định công hiệu của Mẫu chuẩn bạch

hầu Quốc tế lần thứ tƣ[19, 29]. Nhƣ trên đã đề cập, nhƣợc điểm của phƣơng pháp là sử

dụng nhiều chuột lang, tốn kém.

1.6.2 Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt

Hàm lƣợng kháng độc tố trong huyết thanh của những động vật (chuột nhắt

hoặc chuột lang) đã đƣợc miễn dịch bằng vắc xin đƣợc chuẩn độ bằng phản ứng

Schick (phản ứng trung hoa trong da) hoặc trên nuôi cấy tế bào Vero, hoặc bằng

phản ứng ngƣng kết thụ động.

Nguyên lý của phƣơng pháp: Do chuột nhắt không nhạy cảm với độc tố bạch

hầu nên không thể sử dụng phƣơng pháp thử thách trên chuột nhắt với thử nghiệm

công hiệu bạch hầu. Tế bào Vero là dong tế bào nhạy cảm nhất với độc tố bạch hầu,

do nó có khả năng chiếm đƣợc số lƣợng rất lớn các receptor của độc tố này.

Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt để đánh giá khả năng trung hoa độc tố

của kháng thể đƣợc tạo ra ở chuột sau khi tiêm miễn dịch thông qua tế bào Vero. Tế

bào đƣợc cấy vào phiến 96 giếng cùng với độc tố bạch hầu và huyết thanh chuột

chứa kháng thể kháng bạch hầu ở những nồng độ khác nhau. Kháng thể kháng độc

22

tố bạch hầu sẽ trung hoa độc tố. Nếu lƣợng kháng thể không đủ trung hoa thì độc

tố con dƣ lại sẽ gây độc cho tế bào Vero và làm chết tế bào. Dựa vào tỷ lệ chết của

tế bào, so sánh tƣơng quan giữa vắc xin mẫu chuẩn (đã biết công hiệu) và vắc xin

mẫu thử theo parallel line để tính công hiệu vắc xin theo đơn vị IU [23].

Trong thử nghiệm này hiệu giá kháng thể đƣợc tính theo điểm kết thúc là

điểm mà giếng cuối cùng vẫn con tế bào mọc. Khi tế bào sống, việc trao đổi chất

của chúng sẽ làm acid hóa môi trƣờng dẫn đến sự chuyển màu của chỉ thị đỏ phenol

khiến môi trƣờng chuyển màu tư đỏ sang vàng. Nhƣ vậy sau 4-6 ngày nuôi cấy,

môi trƣờng chuyển màu vàng chứng tỏ tế bào sống, môi trƣờng màu đỏ chứng tỏ tế

bào chết. Hiện nay, có ba cách đọc điểm kết thúc này: đọc bằng mắt thƣờng

(phương pháp Kreeltenberg), đo quang phổ (phương pháp Aggerbeck) hoặc thêm

dung dịch nhuộm màu xanh thiazolyl (phương pháp Sesardic) [7]

Kỹ thuật:Tiêm vắc xin mẫu chuẩn và mẫu thử ở các độ pha loãng khác nhau

cho chuột nhắt. Sau 35 ngày, lấy máu và tách huyết thanh riêng rẽ tưng

chuột.Chuẩn độ kháng thể chuột với tế bào Vero. Tỷ lệ chết của tế bào Vero ở các

độ pha loãng khác nhau của kháng thể chuột phản ánh nồng độ kháng thể[29].

Tính kết quả và biện luận: Kết quả công hiệu theo phƣơng pháp này đƣợc tính

theo chƣơng trình Parallel line. Chƣơng trình này đƣợc sử dụng để ƣớc lƣợng công

hiệu tƣơng quan của vắc xin tư những dữ liệu đƣa ra của các thử nghiệm định

lƣợng. Trong thuật toán phân tích này, giá trị log2 trong chuẩn độ của tưng tuýp

huyết thanh riêng lẻ phải đáp ứng hồi quy tuyến tính theo các liều bậc 10. Sự khác

biệt giữa giá trị trung bình của các độ pha phải không có ý nghĩa thống kê. Vì sự

khác biệt này quá lớn sẽ làm giảm tính đúng của giá trị công hiệu ƣớc lƣợng. Độ

lệch chuẩn bình phƣơng trung bình tư tính chất song song và tính tuyến tính phải có

ý nghĩa thống kê. Một trong hai tính chất này không đáp ứng chứng tỏ thử nghiệm

tiến hành không có giá trị vì có những sai số trong thiết kế hoặc trong tiến hành thử

nghiệm nên kết quả công hiệu không đủ độ tin cậy [29].

So với phƣơng pháp thử thách trên chuột lang, phƣơng pháp này có ƣu điểm là

dễ thực hiện hơn do việc cung cấp chuột nhắt là khả thi hơn cho các phong thí nghiệm

23

và giá thành cũng tƣơng đối rẻ hơn do đó nó đƣợc sử dụng ở nhiều nƣớc và cũng đã

đƣợc WHO khuyến cáo sử dụng cho thử nghiệm công hiệu bạch hầu [6, 18].

1.7 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN

1.7.1 Đánh giá độ ổn định dài hạn (Long- term Stability Studies)

Thử độ ổn định dài hạn là phƣơng pháp đánh giá bằng những thí nghiệm

hóa, lý, sinh học, vi sinh học của sản phẩm trong điều kiện bảo quản.

Khi nghiên cứu thử độ ổn định dài hạn, tần số thử nghiệm phải đủ để thiết lập

hình ảnh về độ ổn định của sản phẩm. Tần số thử nghiệm ở điều kiện bảo quản dài hạn

thông thƣờng 3 tháng một lần trong năm đầu tiên, 6 tháng một lần trong năm thứ hai, và

một năm một lần cho các năm sau đó cho đến hết tuổi thọ dự kiến [1, 16].

1.7.2 Đánh giá độ ổn định theo phƣơng pháp thuc đẩy nhiệt (Accelerated

Stability Testing)

Là những nghiên cứu đƣợc bố trí để làm tăng tốc độ phân hủy của sản phẩm

ở điều kiện khắc nghiệt (nhiệt độ và độ ẩm) và tư đó đƣa ra dự kiến tuổi thọ của sản

phẩm ở điều kiện bình thƣờng.

Nghiên cứu thử độ ổn định ở điều kiện bảo quản cấp tốc tối thiểu là 3 thời

điểm, gồm thời điểm đầu, giữa và thời điểm kết thúc (có nghĩa là 0, 3, và 6 tháng)

đối với thời gian thử nghiệm là 6 tháng.

Các kết quả nghiên cứu cấp tốc phản ánh gần đúng với sự biến đổi đáng kể

của nguyên liệu ở điều kiện bảo quản mà nhà nghiên cứu dự định [1, 16].

1.7.2.1 Điều kiện tiến hành phương pháp cấp tốc

- Buồng vi khí hậu có thể duy trì đƣợc nhiệt độ 1,00C và độ ẩm tƣơng đối

5,0%.

- Thời gian bắt đầu thực nghiệm là thời gian cho mẫu chuẩn vào thiết bị thử

nghiệm.

- Thời gian kết thúc thực nghiệm là thời gian mà công hiệu vắc xin không

đạt giới hạn cho phép.

1.7.3 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff

Theo nguyên lý Vant-Hoff, tốc độ phản ứng hoá học tăng 2-4 lần khi nhiệt độ

tăng 100C. Khi đó, tuổi thọ C ở điều kiện nhiệt độ bảo quản bình thƣờng tbt tƣơng

24

quan với tuổi thọ thực nghiệm Ctn ở nhiệt độ cao ttn đƣợc tính theo phƣơng trình sau:

C = K.Ctn (1)

Trong đó: 1010

ttt

AAKbttn

= 1010

ttt

AAKbttn

(2)

Thay giá trị K vào phƣơng trình (1) ta có:

10.

t

tn ACC

(3)

ttn: Nhiệt độ tiến hành thử nghiệm cấp tốc (0C)

A: Hệ số nhiệt độ của tốc độ phản ứng hoá học khi nhiệt độ tăng

lên 100C (A = 2).

Khi cần tính nhiệt độ bảo quản thích hợp tx cho phép bảo đảm tuổi thọ mong

muốn Cmm (tính bằng ngày) tư tuổi thọ ở điều kiện bình thƣờng C đƣợc tính theo

công thức:

xt = btt +mmC

CLg

LgA.

10 (4)

Nếu khoảng thời gian C0 kể tư ngày xuất xƣởng đến khi bắt đầu thực nghiệm

lớn hơn 30 ngày và mẫu đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 300C thì lúc này tuổi

thọ của thuốc đƣợc tính:

C= K.Ctn + C0 (5)[1, 16]

25

Tài Liệu Tham Khảo

Tiếng Việt

1. Trần Tử An (2005), Kiểm nghiệm dƣợc phẩm, Nhà xuất bản Y học, Phần 7,

tr81-86.

2. Lê Văn Hiệp (2006), Vắc xin học những vấn đề cơ bản, Nhà xuất bản Y học,

phần 6, tr.123-128.

3. Nguyễn Thị Kê và cộng sự (1999), Nghiên cứu sản xuất vaccine mẫu chuẩn

Quốc gia Bạch hầu- uốn ván - ho gà, tr. 44,54,59.

4. Dƣợc điển Việt Nam IV, (2009), Vắc xin bạch hầu hấp phụ, tr 653, 654,

334-336.

5. Lê Văn Phủng và cộng sự (2009), Vi khuân Y hoc , Nhà xuất bản giáo dục

Viêt Nam. Phần 4, tr.106-108.

Tiếng Anh

6. Aggerbeck H, Heron I (1991), " Improvement of a Vero cell assay to

determine diphtheria antitoxin content in sera.", Biologicals,pp. 19,71 - 76.

7. Aggerbeck H, Norgaaed –Pedersen, Heron I (1996), "Simultaneous

quantitation of diphtheria and tetanus antibodies by single antigen, time-

resolve flosurescense immunoassay", Journal of Immunological Methods.

190, pp. 170-183.

8. Bryan Howard et al(2007), "The COST Manual of Laboratory Animal Care

and Use, categories of animal model and their characteristis", pp. 45-46.

9. Kreeftenberg JG et al(1986), "A mouse model to estimate the potency of the

diphtheria component in combined vaccines", Development of biological

standardization. 64, pp. 21-24.

10. Yenny et al (1993), "Standardizing the potency of Diphtheria in-house

reference toxoid using serologycal method by neutralization test in Vero cell

culture", p. 10.

11. Euroean Commision (2009), "Alternative testing strategies-progress report

2009, Replacing, reducing and rifining use of animal in research genomics

26

&biotechnology for health. Luxenbourg: office for official Publication of the

European Communities", EUR 23886.

12. Edmunds WJ, Pebody RG, Aggerback H, Baron S, Berbers G, Conyn-

van 4)Spaendonck MA, Hallander HO, Olander R, Maple PA, Melker

HE, Olin P, Fievret-Groyne F, Rota C, Salmaso S, Tischer A, von-

Hunolstein C and Miller E (2000), "The sero-epidemiology of diphtheria in

Western Europe. ESEN Project. European Sero-Epidemiology Network.",

Epidemiology and Infection. 125 (1), pp. 113 - 125.

13. RIVM National Institute of public Health and the environment, (2000),

Laboratory animal Husbandry in Vaccin Quality Control, 68-70.

14. Galazka, AM (1993), "The Immunological Basis for Immunization

Series, Module 2: Diphtheria.", World Health Organization.

15. Hardy I, Dittman S and Sutter R (1996), "Current situation and control

strategies for resurgence of diphtheria in newly independent states of

the former Soviet Union", The Lancet. 347, pp. 1739 - 1744.

16. Immunization, WHO Department of (2006), "Temperature sensitivity of

vaccines", Vaccines andBiologicals.

17. JF Carpenter , JH Crowe, T Arakawa (1990), "Comparison of solute-induced

proteinstabilisation in aqueous solution and in frozen and freeze-dried state",

J DairySci. 73, pp. 3627-36.

18. Kreeftenberg JG, van der Gun JW, Marsman FR, Sekhius VM, Bhandari SR

and Maheswari SC (1985), "An investigation of a mouse model to estimate

the potency of the diphtheria component in combined vaccines", Journal of

Biological Standardization. 13 (3), pp. 229 - 234.

19. Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and Pertussis vaccines

(2013), pp. 147-155.

20. Maple PA, Efstratiou A, George RC, Andrews NJ and Sesardic D

(1995), "Diphtheria immunity in UK blood donors", The Lancet 345, pp. 963

- 965.

27

21. Matejtschuk P, Rafiq , Johnes S, Gaines Das R (2005), "A comparison of

vialswith ampoules for the storage of biological reference materials",

Biologicals. 33, pp. 63-70.

22. Pikal, MJ (1990), " Freeze drying of proteins. Part II Formulation selection",

Biopharm. 3(9), pp. 26-30.

23. R. Winsnes, D. Sesardic, A. Daas, M-E. Behr-Gross (2006), "Collaborative

study for thevalidation of serological methods for potency testing of

diphtheria toxoid vaccine(part 2)", Pharmeuropa Bio. 1, p. 73.

24. Redhead K, Gaines Das R (1991), "A collaborative assay of the proposed

Third British reference preparation for Pertussis vaccine and the relative

potencies of the second International Standard and the second British

Reference Preparation for Pertussis Vaccine ", Biologicals. 19, pp. 107 -

111.

25. Sesardic D, Prior C, Daas A and Buchheit KH (2003), "Collaborative

study for establishment of the European Pharmacopoeia BRP Batch 1 for

Diphtheria Toxin.", Pharmeuropa Bio. 1, pp. 7 - 21.

26. Sesardic D, Winsnes R, Rigsby P and Gaines-Das, R (2001), "Calibration of

replacement International Standard and European Pharmacopoeia

Biological Reference Preparation for Diphtheria Toxoid, Adsorbed",

Biologicals 29, pp. 107 - 122.

27. Wang, W (2000), "Lyophilization and development of solid protein

pharmaceuticals", Int J Pharm. 203, pp. 1-60.

28. WHO (1990), "Annex 2: requirements for Diphtheria, Tetanus, Pertussis and

combined vaccines". No.800, p. p13.

29. WHO (1995), "Manual of laboratory methods for potency testing of vaccines

used in the WHO Expanded programme on Immunization", pp. 198-206.

30. WHO (1998), "Requirements for yellow fever vaccine (Requirments for

Biological Substances No 3, revised 1995)", WHO Technical Report

872, pp. 30-68.

28

31. WHO (2003), "Recommendation for Diphtheria, Tetanus, Pertussis and

Combined Vaccines annex 5", p. 5.

32. WHO (2006), "Annex 2: Recommendation for the preparation,

characterzation and establishment of international and other Biological

reference standards Part A". No. 932.

33. WHO (2013), Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and

Pertussis vaccines 12-14.

34. WHO (2013), Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and

Pertussis vaccines 15.

35. WHO (2013), Manual for the establishment of national and other secondary

standards for vaccines, Vol. Vii,Viii WHO/IBV/11.03.

36. Xing D , Gaines Das R, Newland M, Corbel (2001), "Third International

Standard for pertussis vaccine:International Confirmation Study of

activity of British Standard for pertussis vaccine,coded 66/303",

Biologicals 29, pp. 133 – 136.