如何选择并顺利应用合适的制备柱？ · 2017-09-15 · ©2017 Waters Corporation...

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如何选择并顺利

应用合适的制备柱？

沃特世消耗品部门

吴柳柳 [email protected]

2017年9月12日


提要

使用合适的色谱柱提高分离纯化效率及案例分享

预筛查法提高纯化实验室通量

资料工具


提要


碱性化合物/生物碱

高极性/极性化合物（譬如：中药TCM极性跨度大）

常规化合物—更通用、耐用、成本

肽

如何延长制备柱的使用寿命？


资料工具


分离选择影响

Effect of N, k,

Initial

Increase

Increase k'

Increase N

( ) Rs = N 4 ( -1

) k'

k'+1 Retentivity Selectivity Efficiency


选择性之不同色谱柱的差异

相同类型的柱子差别就很大，更何况不同的键合相。。


提要



高极性/极性化合物（譬如：中药TCM极性跨度大）


肽



资料工具


充分利用pH条件

pH

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2 4 6 8 10 12

保留因子

(k)

有机酸

有机碱

中性化合物

中性化合物的保留与pH无关

碱的高保留区酸的高保留区

硅胶柱的pH应用范围

杂化颗粒柱的pH应用范围

酸的低保留区碱的低保留区

通过调控流动相的pH值可以显著改变可离子化的化合物的反相保留

U.D. Neue et al., American

Laboratory, November

1999, 31 (22), p.36-39 拓宽的pH应用范围意味着获得最佳分离的机率倍增！

pH


不同pH条件下对酸碱性化合物的载量对比

碱性化合物酸性化合物

对酸性化合物使用低pH条件可获得好的峰形与最大载量

对碱性化合物使用高pH条件可获得好的峰形与最大载量


某碱性化合物反相纯化应用实例 ——低pH条件时

50 mL

1mg/peak

500 mL

10mg/peak

1000 mL

20mg/peak

5.00 10.00 Time

100

%

100

%

100

%

50 mL

1mg/peak

500 mL

10mg/peak

1000 mL

20mg/peak


某碱性化合物反相纯化应用实例 ——高pH条件时

5.00 Time

100

%

100

%

100

%

50 mL

1mg/peak

500 mL

10mg/peak

1000 mL

20mg/peak

50 mL

1mg/peak

500 mL

10mg/peak

1000 mL

20mg/peak


【应用案例】雷尼替丁强降解物的制备


【应用案例】弱酸条件下的碱性化合物—质谱引导

使用通用C18色谱柱对比了使用TFA和甲酸流动相的影响

苯海拉明(峰1)和特非那定(峰2)

CSH 分析柱到制备柱！！均在甲酸的体系下


提要



高极性/极性化合物（譬如：中药TCM极性跨度大）方案：反相模式、亲水模式


肽



资料工具


【应用案例】极性化合物的分离保留

Minutes

0 2 4 6 8

AU

0.0

1.0

1.5

2.0

2.5

AU

0.0

1.0

1.5

2.0

2.5

0.5

0.5

12

3

V0 = 0.6 min

V0 = 0.5 min

1

2

3

Atlantis® Prep T3 OBD™ 5 µm, 19 x 50 mm

Traditional Prep C18 5 µm, 19 x 50 mm

Compounds 1.Pyridoxine 5 mg/mL in H2O 2.Acetaminophen 10 mg/mL in H2O 3.Caffeine 20 mg/mL in H2O

梯度始于100%水相

Pyridoxine 维生素B6 典型的极性分子


【应用案例】 Beta受体阻断剂，从分析到制备的放大


“平衡柱”：同时测定水溶性和脂溶性维生素 ——适用于极性范围跨度大项目

极性保留增强

强疏水性保留减弱


极性保留反相专用柱

用于极性分子保留的业内标杆产品

特别设计用于反相保留极性化合物

很好的增强了对极性化合物的保留能力

与100%水相完美兼容

增强了在高水相条件下对低pH条件的耐受力

LC-MS兼容

[Atlantis] 有完全一致的制备柱可供放大


【应用案例】花茎甘蓝种子中萝卜苷的质谱引导的纯化

720002699ZH


如何根据项目选择色谱柱

XBridgeTM HILIC (pH 1-9)

Atlantis® HILIC Silica (pH 1-5)

XBridgeTM Amide (pH 2-11) 时间顺序

纯硅胶：对碱性分析物保留较强保留能力较杂化颗粒稍高

未键合杂化颗粒：化学稳定性高，耐受性强；对碱性分析物保留较强

杂化颗粒键合酰胺基：化学稳定性高，耐受性最强；对中性与酸性分析物保留强


提要





肽



资料工具


更为通用、更为耐用的柱子


【应用案例】银杏叶黄酮类化合物提取

槲皮素、山柰酚和异鼠李素的化学结构

720004839ZH


筛选中药活性成分

肉桂提取物

五味子提取物

SunFire Prep C18 OBD 5μm 19 x 100 mm


SunFire：在中低pH条件下的高载量尤其在甲酸体系中峰形优势突出

Zorbax® SB C18

4 8 12 Time (min)

色谱条件: 4.6 x 100 mm, 5 µm A = 0.1 % Formic Acid in ACN B = 0.1 % Formic Acid in H2O 梯度 20 to 50 % B in 10 min, 柱流速1.4 mL/min。 1. Doxepin 2. Desipramine 3. Trimipramine 总载荷 = 90 µg

1 2 3 SunFire™ C18

340 m2/g

3.2 µmol/m2

Kromasil® C18 340 m2/g

3.2 µmol/m2

180 m2/g

2.0 µmol/m2

在低离子强度体系中（0.1%甲酸），大多数填料对碱性化合物的峰形不佳严重影响载量、纯度与回收率


【应用案例】尼莫地平与杂质的分离


【应用案例】生物体液中药物代谢物的测定

咖啡因代谢物


提要





肽



资料工具


肽的特点：

Peptide

TFA

TFA


【应用案例】肽的制备

对于肽样品，其载量主要取决于目标肽序列以及肽样品的溶解性，建议按所列值的5-20%预估！


分析肽温度考察

Scale to HPLC; 20-60°C

0-50% B; TFA 4.6 x 50mm 214 nm 20°C

0-50% B; TFA 4.6 x 50 mm 214 nm 40°C

0-50% B; TFA 4.6 x 50 mm 214 nm 60°C

Elevated temperature useful for elution of peptide as sharp peak.

*

*

*


Column and Pre-heater Loop

Immersed in Water Bath at 60°


有些质谱引导的，必须用弱酸时。。


【应用案例】合成肽

720005450EN


OBD制备柱固定相品种 —应对纯化制备的普遍需求与特定应用

XBridge™

—— 宽pH范围、耐受性最强的色谱柱，最广泛适用

—— 高pH条件下，大大增强对碱性杂质的保留与载量！

SunFire™

——分辨率高、容量大，低-中pH条件下最为适用

Atlantis®

—极性化合物保留的专用硅胶C18色谱柱

XSelect CSH

—— 甲酸/氨水体系切换，柱平衡快！

—— 甲酸体系下，碱性药物的峰形与载量极优


制备柱选择图表


提要





肽



资料工具


保护柱

使用制备柱保护柱芯产品

– 保护制备柱免受化学合成样品污染

– 对于较苛刻流动相条件，预饱和流动相以减少流动相对制备柱填料的侵蚀

– 便于更换或清洗，不再需要耗费大量时间和溶剂清洗制备柱

– 有效延长制备柱使用寿命，减少制备柱使用成本

关于沃特世制备柱保护柱芯产品

– 自2012年11月起，每根沃特世制备柱保护柱芯都经过液相色谱柱效测试

– 配合沃特世制备柱保护柱套使用


如何使用 1 – 柱芯与柱套的安装方向

注意安装与使用方向

– 保护柱套有方向，标记于保护柱套进口端面

– 保护柱芯也有方向，标记于柱身侧面

INLET 入口端

FLOW 流向


如何使用 2 – 新柱芯启用：活化

新柱芯启用建议

– 新柱芯处于干燥状态，需要使用纯有机溶剂进行活化

活化方式一：

– 1. 将新柱芯浸泡于纯甲醇中过夜（甲醇将充分浸润柱芯填料）

– 2. 取出柱芯，按正确方向装入保护柱套

– 3. 使用100%乙腈，执行5分钟内从流速0.1->20mL/min的流速梯度

活化方式二：

– 1. 将干燥的新柱芯直接按正确方向装入保护柱套，注意：此时，保护柱套后端应与系统检测器断开！

– 2. 使用100%乙腈，执行5分钟内从流速0.1->20mL/min的流速梯度，此时，可以看到不断流出气泡（如未断开，气泡将进入系统检测器流通池）

– 3. 重复步骤2，此时气泡几乎不再出现

– 4. 将保护柱套后端接到系统检测器上进行柱效测试


如何使用 3 – 新柱芯启用：柱效测试

新柱芯测试建议

– 在使用前，测试柱芯以了解其性能情况；仅测试柱芯，可节省大量时间与溶剂。

测试方式一：

– 1. 测试样品：纯甲苯按1:20-30的比例稀释于乙腈，进样体积5uL

– 2. 流动相：乙腈：水 50：50；检测器：UV254nm，采样频率2点/秒

– 3. 柱平衡：流动相条件如上，执行5分钟内从流速0.1->16mL/min的流速梯度

– 4. 柱测试：流动相条件如上，流速16mL/min，1.5分钟。

测试方式二：

– 1. 测试样品：二氢苊溶液1.2mg/mL，进样体积10-20uL

– 2. 流动相：乙腈：水 60:40；检测器：UV254nm，采样频率2点/秒

– 3. 柱平衡：流动相条件如上，执行5分钟内从流速0.1->16mL/min的流速梯度

– 4. 柱测试：流动相条件如上，流速16mL/min，1.5分钟。


如何使用 4 – 其它建议

状态不明的旧保护柱芯：在使用前，使用同样的方法进行活化与测试。

保护柱芯使用过程中的注意事项：

– 柱芯与制备柱的填料应保持一致

– 柱芯测试合格后，及时在保护柱套上标记该保护柱芯的填料名称，以免混淆

– 每次纯化样品，梯度末端使用100%乙腈清洗柱；柱使用后应保存于100%乙腈中

– 保护柱芯不用时，最好能放在保护柱套中，用柱堵头封堵，可有效确保湿润状态；否则，如放置较长时间柱芯半干燥，使用前应再次进行活化处理。

– 随制备柱使用的过程中，如压力骤升或峰形突然恶化时，立刻拆除保护柱进样标准品进行排查；如确认为保护柱芯污染所致，更换保护柱芯。

– 不建议对保护柱芯超声，剧烈超声可能导致填料破碎，填料碎屑可能堵塞筛板造成压力升高。

相关耗材：

– 制备保护柱套19x10mm：货号186000709（可长期使用，损耗率低）

– 密封O型圈替换件19x10mm：货号700001020（发生溶剂泄漏时，替换）


确保制备柱的高效、高寿命的使用之道

启用保护柱芯之前——活化与测试：如柱芯处于全干燥或半干燥状态，

– 1. 将柱芯置于纯甲醇中浸泡过夜；

或：1. 仅接保护柱，不接检测器，100%乙腈，流速梯度5分钟内0.1->20mL/min，重复2次。

– 2. 乙腈：水 50：50，流速梯度5分钟内0.1->16mL/min，对柱芯进行预平衡

– 3. 进样甲苯乙腈溶液（约1：30比例）5uL，乙腈：水50：50，16mL/min，1.5分钟

– 4. UV254nm，采样频率2Hz：获得峰形较为对称的单峰，基线稳定，背压低于60psi

使用过程中——总是配合使用保护柱芯：

– 5. 保护柱芯与制备柱填料一致

– 6. 每次纯化梯度末端设置为100%乙腈

– 7. 将制备柱与保护柱芯从仪器上取下存放前，确保用100%乙腈清洗3-5倍柱体积

– 8. 压力骤升或峰形恶化时，更换保护柱芯，并排查是否需要调整样品溶解方式和/或进行粗纯。旧柱芯，可置于有利于溶解样品的合适溶剂中，浸泡过夜再上机冲洗（断开检测器，冲洗后测试检查压力与峰形）。


分离选择影响

Effect of N, k,

Initial

Increase

Increase k'

Increase N

( ) Rs = N 4 ( -1

) k'

k'+1 Retentivity Selectivity Efficiency


改善柱效之更小的孔径

dpN

1

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

Minutes

5 µm

10 µm


Pack Remove/Decompress Cut Flush Cap Run a b c d e

Void

传统制备柱装填的问题：


Bed Expansion After Packing Used Column With Void

看下实际在传统制备柱装填中。。。


OBD （Optimum Bed density）技术的特点

Pack Remove/Decompress Cut Flush Cap Compress

Compress

Launched in 2003 US Patent No. 7,399,410 / UK Patent No. GB 2 408 469


OBD获得均一稳定的柱床

US Patent Application: 2005/0224414 A1


提要



资料工具


传统的纯化流程

Sample: Reaction Mixture

Pilot screening

Evaluate purity & recovery

Optimize

Mass Loading

& Scale-up

Run Purification Collect fraction(s)

Confirm purity

Yes

No


完美的纯化流程

Sample: Reaction Mixture

Pilot screening

Run Purification Collect fraction(s)

Confirm purity

UPLC

UPLC

Prep

Focused gradient

• Same chemistry, different particle size

• Focused gradient calculator


推荐：分析到制备转化计算器（www.waters.com）

从分析到制备梯度条件放大

管路背压与分流管路计算

从UPLC筛查条件梯度聚焦放大至Prep条件

柱背压与样品上载量预估


System: ACQUITY UPLC (Binary)

UV Detection: TUV (210 and 254nm)

MS Detection: ToF-MS scanning 100-1000 amu

Column Size: 2.1 x 30mm, 1.7 µm

Flow Rate: 0.9 ml/min

Run Time: 3 min

Column Temp: 30ºC

Mobile Phases: A1: 0.1% formic acid in water, B1: 0.1% formic acid in ACN

A2: 0.1%NH4OH in water, B2: 0.1% NH4OH in ACN

Column: ACQUITY UPLC CSH C18, 2.1 x 30 mm, 1.7 µm

Time %B

0.0 2.0

0.2 2.0

2.0 98.0

2.5 98.0

2.6 2.0

3.0 2.0

UPLC Gradient

UPLC 筛选条件的设置


Inlet method well 2:1

28-Oct-2008 11:35:41Purple LC/MS TraceLNB Ref Tm backwards FName Tony W Cook

Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00

AU

0.0

2.5e+1

5.0e+1

7.5e+1

1.0e+2

1.25e+2

1.5e+2

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00

AU

0.0

2.5e+1

5.0e+1

7.5e+1

1.0e+2

1.25e+2

1.5e+2

JSB11380-1 3: Diode Array Range: 1.931e+20.94

0.38

0.17

1.031.49

1.79

JSB11379-2 3: Diode Array Range: 1.891e+20.93

0.38

0.17

1.02

0.96

1.481.78

0.1% Formic Acid Column Previously Exposed to High pH Note:

Increased RT & Peak Shape Loss for Amitriptyline

Inlet method well 2:1

24-Sep-2008 15:04:58Purple LC/MS TraceLNB Ref QC1386Name Purple

Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00

AU

0.0

2.0e+1

4.0e+1

6.0e+1

8.0e+1

1.0e+2

1.2e+2

1.4e+2

1.6e+2

1.8e+2

QC1386 3: Diode Array Range: 2.117e+20.94

0.39

0.180.82

1.491.04

1.79

0.1% Formic Acid New Column

Am

itri

pty

lin

e

Am

itri

pty

lin

e

3. Low pH

1. Low pH

低pH高pH低pH的方法开发过程：

CSH柱表现稳定无忧


乙酰化反应例子:氨基水杨酸

举例:

Rxn Starting compound mw starting material rxn products (mg)

1 flurbiprofen 244 100 mg 94

2 procatechuic acid 154 100 mg 151

3 aminosalicylic acid 153 100 mg 145

4 5-hydroxyindole acetic acid 191 100 mg 130

5 enalapril maleate 377 100 mg 117

6 epinepherine 183 100 mg 204

7 probenecid 285 100 mg 90

8 ephedrine 165 100 mg 165

9 labetalol 328 100 mg 162

10 nadolol 309 100 mg 173

11 anthranilic acid 137 100 mg 93

12 lomefloxacin 351 100 mg 104

13 guaifenesin 198 100 mg 134

14 loperamide 477 100 mg 116

15 indomethacin 358 100 mg 99

16 lovastatin 405 100 mg 112

17 5-bromoindole acetic acid 240 100 mg 110

18 mycophenolic acid 320 100 mg 114

19 genistein 270 100 mg 137


Time 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

AU

0.0

2.0

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

AU

0.0

2.0

0.82

0.74 0.14 0.92

0.21

0.82

aminosalicylic acid

Best result from screening: CSH C18 with 0.1% formic acid Target peak: 0.82 min, m/z 196 amu Target peak ID: mono-acetylated product

0.1% formic acid

Time 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

AU

0.0

1.0

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

AU

0.0

5.0e-1

1.06

0.89

0.81 0.65 0.47 0.13

1.27

1.06 0.51

0.67 0.78 1.27

0.1% formic acid

Sample 3

Sample 4

0.1% ammonium hydroxide

0.1% ammonium hydroxide

5-hydroxyindoleacetic acid

Best result from screening: CSH C18 with 0.1% Ammonium Hydroxide Target peak: 1.06 min, m/z 216 amu Target peak ID: mono-acetylated product

UPLC 筛选举例

http://en.wikipedia.org/wiki/File:P-Aminosalicylic_acid.svg

http://en.wikipedia.org/wiki/File:5-Hydroxyindolessigs%C3%A4ure_(5-HIAA).svg


Screening Results for All Compounds

Optimum Column/Mobile phase

Rxn Starting compound Column Modifier

1 flurbiprofen CSH C18 low pH

2 procatechuic acid CSH C18 high pH

3 aminosalicylic acid CSH C18 low pH

4 5-hydroxyindole acetic acid CSH C18 high pH

6 epinepherine CSH C18 low pH

8 ephedrine CSH C18 high pH

9 labetalol CSH C18 low pH

10 nadolol CSH C18 low pH

11 anthranilic acid CSH C18 high pH

14 loperamide CSH C18 low pH

15 indomethacin CSH C18 low pH

18 mycophenolic acid CSH C18 low pH

HOW DO WE TRANSLATE UPLC SCREENING DATA INTO PURIFICATION RUN CONDITIONS?


不同的梯度条件

time

% organic Linear Gradient

Example: 2 to 98 % organic

time

% organic

Narrow Linear Gradient

Examples:

• 5 to 25% organic



time

% organic

Focused Gradient

• Steep rise in beginning, shallow gradient (1% per CV), steep rise for wash and regeneration


UPLC to Prep制备的目标峰收集

Time 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00

AU

0.0

1.0

2.0

3.0

4.15

3.28

2.00

0.70 1.30

11.55 m/z=519.0

UPLC Screen

ACQUITY UPLC CSH C18 2.1 x 30 mm, 1.7 µm Modifier: 0.1% formic acid 2% to 98% fast gradient 3 min run time Time

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

AU

0.0

2.5e-1

5.0e-1

7.5e-1

1.12

1.05

0.73 0.47 0.11

2.72

m/z 519

Preparative HPLC XSelect CSH C18 19 x 100 mm, 5µm Modifier: 0.1% formic acid 33.7% to 43.7% focused gradient 15 min run time

target: m/z 519 peak at 1.12 min Calculate focused gradient

Sample 14: loperamide acetylation products

15.00


提要



资料工具


耗材手册工具书


制备柱选择图表


制备柱小册子


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如何选择并顺利应用合适的制备柱？ · 2017-09-15 · ©2017 Waters Corporation...

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