DISPONIBILIDAD DE TECNICAS MOLECULARES PARA NIÑOS …

240 Medicina Infantil Vol. XXV N° 3 Septiembre 2018

TRABAJOS ORIGINALES

DISPONIBILIDAD DE TECNICAS MOLECULARES PARA NIÑOS CON TUMORES DE DIFICIL CARACTERIZACION.Un problema en la Oncopatología pediátrica. Aplicación y difusión de técnicas de diagnóstico complementarias en el ámbito público

Lic. Xiomara Carrere, Dras. Jessica López Marti, Valeria Vázquez, Técs. Sandra Camarero, Dora Díaz, Dras. Verónica Solernou, Fabiana Lubieniecki

INTRODUCCIONEl continuo desarrollo en el área de investiga-

ción en diversos campos, especialmente en oncolo-gía pediátrica, aporta nuevos marcadores con valor

Servicio de Patología.Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan.Recibido: 04/07/2018 – Aceptado: 11/07/2018Correspondencia: Xiomara Carrere - [email protected] de Los Pozos 1881. Buenos Aires, Argentina. (CP1245).

RESUMENLa revolución de la biología molecular y el desarrollo de la inves-tigación biomédica básica para el diagnóstico y posterior manejo del cáncer infantil han llevado a la necesidad de organización de grupos interdisciplinarios de profesionales, los cuales se en-cargan de afrontar los nuevos desafíos diagnósticos y terapéu-ticos. Los sarcomas indiferenciados pediátricos constituyen un grupo heterogéneo de neoplasias malignas de aspecto primitivo y polifenotípico. La categorización de gran parte de este tipo de tumores es posible gracias a la aplicación de técnicas molecu-lares complementarias al estudio histopatológico. El objetivo del presente estudio fue recategorizar sarcomas indiferenciados mediante la implementación de una nueva metodología diag-nóstica. Se efectuaron técnicas de inmunohistoquimica (IHQ), FISH de interfase y RT-PCR a partir de tejido fijado en formol e incluido en parafina en 144 casos de sarcomas indiferenciados. Se logró la recategorización del 95.1% de los casos, arribando a 24 diagnósticos diferentes. Sólo un 4.9% permanece aún como sarcoma indiferenciado o inclasificable. Los resultados alcanza-dos por este estudio demuestran la importancia de contar con nuevas herramientas diagnósticas a nivel molecular y recursos humanos especializados que posibiliten su correcta implementa-ción para el diagnóstico de neoplasias de difícil caracterización.

Palabras clave: diagnóstico en cáncer infantil, sarcomas indiferenciados, Inmunohistoquímica, FISH de interfase, RT-PCR.

Medicina Infantil 2018; XXIV: 240 - 247.

ABSTRACTThe revolution of molecular biology and the development of basic medical research for the diagnosis and subsequent man-agement of childhood cancer have led to a need to organize in-terdisciplinary groups of professionals in charge of facing new diagnostic and treatment challenges. Childhood undifferentiated sarcomas are a heterogeneous group of malignant neoplasms that are primitive in appearance and have polyphenotypic fea-tures. Categorization of a large part of this type of tumor has become possible with molecular techniques as a complement to histopathological studies. The aim of this study was to categorize undifferentiated sarcomas using new diagnostic tools. Immuno-histochemistry (IHC), interfase FISH, and RT-PCR techniques were used on formalin-fixed and paraffin-embedded tissues of 144 cases of undifferentiated sarcomas. Overall, 95.1% of the cases could be recategorized resulting in 24 different diagnoses. In only 4.9% the diagnosis of undifferentiated or unclassifiable sarcoma was maintained. These results emphasize the impor-tance of the availability of new diagnostic tools at the molecu-lar level and specialized human resources enabling adequate implementation for the diagnosis of difficult-to-characterize neo-plasms.

Key words: childhood cancer diagnosis, undifferentiated sarco-mas, immunohistochemistry, interfase FISH, RT-PCR.

Medicina Infantil 2018; XXIV: 240 - 247.

TO Tumores set 2018.indd 240 24/09/18 05:59

http://www.medicinainfantil.org.ar

Técnicas moleculares en tumores 241

diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta a terapias dirigidas. Esto tiene especial importancia ya que es tarea de los patólogos y biotecnólogos cono-cer y participar activamente en este avance así como incorporar gradualmente en su práctica diaria aque-llos marcadores que sean validados en el ámbito clí-nico. Esta implementación de nuevos marcadores y tecnologías se debe realizar en condiciones óptimas de calidad técnica e interpretativa y requiere de un equipo multidisciplinario que incluya biotecnólogos/biólogos moleculares, técnicos de laboratorio, pató-logos y oncólogos. El catálogo de técnicas molecu-lares que debe incluir un laboratorio de patología en el área de los tumores pediátricos indiferenciados se basa en la clasificación actual de las neoplasias (Or-ganización mundial de la salud, OMS) y en guías de práctica clínica de consenso elaboradas por comités de expertos1.

Anualmente, unos 1.400 niños son diagnosticados con cáncer en Argentina2, en el mundo la cifra se ele-va a 200.000. El Hospital Garrahan recibe, por año, 420 nuevos pacientes oncológicos, un tercio de los pacientes pediátricos con cáncer del país que tienen sobrevida del 80%, equiparable a los mejores centros de salud del mundo. Por lo tanto, como centro de re-ferencia nacional e internacional, contar con la estra-tegia diagnóstica específica para cada tipo de tumor aporta beneficios no solo a los niños atendidos en el hospital Garrahan sino a pacientes de todo el país y de los países limítrofes.

El Servicio de Patología (SP), como parte de un hospital de alta complejidad, proporciona información diagnóstica fiable en forma cooperativa e interdisci-plinaria3.

El diagnóstico de los tumores sólidos pediátri-cos, especialmente los tumores de partes blandas, es en muchos casos complejo, debido a su escasa diferenciación, lo cual dificulta el uso de marcadores proteicos específicos para su correcta clasificación. Los sarcomas indiferenciados o inclasificables par-ticularmente, constituyen un grupo heterogéneo de neoplasias malignas de células redondas, fusiformes, de aspecto mesenquimático primitivo y polifenotípico o bifásico4-6. A mediados del siglo XX el 50% de los sarcomas de tejidos blandos en niños era considera-do como tumor indiferenciado o sarcoma de histogé-nesis indeterminada7,8. Actualmente la aplicación de técnicas diagnósticas complementarias como inmu-nohistoquímica (IHQ) y estudios genético-molecula-res, permiten una mejor caracterización. Consecuen-temente, este porcentaje disminuyó a menos de un 10%9-12, alcanzando un 4% si se cuenta con material adecuado para una evaluación diagnóstica completa. Por esta razón para la toma de decisiones clínicas se debe considerar el diagnóstico molecular como un parámetro complementario a los criterios clínicos e histopatológicos.

La gran mayoría de los sarcomas pediátricos pre-

senta translocaciones cromosómicas que resultan en la fusión de genes. Estos rearreglos genéticos consti-tuyen marcadores diagnósticos y pudiendo ser identi-ficados tanto a nivel de ADN como de ARN (detección de transcriptos de fusión). La clasificación de los sar-comas mediante la detección de sus características moleculares resulta entonces extremadamente ne-cesaria para definir el diagnóstico, conocer la posi-ble evolución clínica y establecer el tratamiento más adecuado. Adicionalmente, la identificación de estos rearreglos genéticos específicos permite realizar la detección de enfermedad mínimamente diseminada posibilitando la determinación temprana de posibles recaídas y la evaluación de la respuesta al tratamien-to13.

Asimismo, contar con la información molecular ca-racterística de cada caso en particular puede resultar beneficioso en cuanto al desarrollo de nuevas drogas y/o combinaciones que se encuentran en estudios clí-nicos14.

En este contexto se planteó la realización de un estudio diagnóstico retrospectivo de todos aquellos casos inclasificados del historial del Servicio de Pa-tología mediante la formación de un grupo interdis-ciplinario altamente especializado y capacitado para poder incorporar las técnicas emergentes utilizadas a nivel mundial.

OBJETIVOSObjetivo principal

Lograr la recategorización diagnóstica de sarco-mas indiferenciados mediante el desarrollo de una nueva metodología diagnóstica.

Objetivos específicosIdentificar marcadores nóveles que permitan defi-

nir el diagnóstico de sarcomas pediátricos.Aplicar el uso de técnicas de citogenética y biolo-

gía molecular al diagnóstico de sarcomas pediátricos.Desarrollar a nivel interdisciplinario una estrategia

diagnóstica mediante la aplicación de las técnicas de IHQ, FISH de interfase y RT-PCR convencional de manera metodológica para definir los diagnósticos.

MATERIALES Y METODOS

Población. Los casos incorporados corresponden a sarcomas pediátricos indiferenciados diagnostica-dos de acuerdo a sus características morfológicas y el estudio inmunohistoquímico realizado con los anticuerpos disponibles al momento del diagnóstico (1987-2014). Fueron reclutados a partir de la revisión/identificación del historial de diagnósticos del Servicio de Patología del Hospital de Pediatría Juan P. Garra-han, que abarcó desde 1987 hasta julio de 2014 y la consulta posterior de los informes histopatológicos. Criterios de inclusión: 1) disponibilidad de las mues-tras en la tacoteca del SP, 2) tamaño de la muestra (sólo aquellas que evidenciaban suficiente tejido tu-




moral en el taco de parafina, considerándose el área y la profundidad), 3) solución fijadora utilizada (sólo aquellas muestras fijadas en formol buffer al 10%).

Revisión HistológicaLa revisión fue llevada a cabo por dos médicos

patólogos en forma independiente. En los casos más complejos, los mismos fueron consultados a médicos patólogos externos expertos en diagnóstico de sarco-mas pediátricos.

InmunohistoquímicaLas técnicas de IHQ se realizaron como fue pre-

viamente reportado15. Brevemente, secciones de 3

μm de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) montadas en portaobjetos con carga positi-va, fueron desparafinizadas con xileno, bloqueadas en 3% de peróxido de hidrógeno y sometidas a re-cuperación antigénica con citrato de sodio a pH=6. Seguidamente se incubó con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla 1) durante una hora en cáma-ra húmeda. Luego de lavar con buffer Tris pH=7.3 se agregó un anticuerpo secundario conjugado a un polí-mero asociado a peroxidasa (enVision detection Sys-tem, Dako) durante 30 min. a temperatura ambiente y se reveló con diaminobenzidina. Finalmente se reali-zó contratinción con hematoxilina y los preparados se montaron con DPX.

Anticuerpo Clon IgG/IgM M/P Marca Dilución

CD31 JC70A IgG1 M DAKO 1/100

CD34 QBEnd/10 IgG1 M Leica 1/100

CD117 T595 IgG1 M Leica 1/200

S100 No aplica IgG P Dako 1/500

Citoqueratina AE1/AE3 AE1/AE3 IgG1 M Leica 1/50

Citoqueratina 19 RCK108 IgG1 M Dako 1/100

EMA GP1.4 IgG1 M Leica 1/100

BCL2 bcl2/100/D5 IgG1 M Leica 1/100

Vimentina V9 IgG1 M Leica 1/100

Actina Músculo Específica HHF35 IgG1 M DAKO 1/100

Desmina DE-R-1 IgG1 M Leica 1/50

TDT SEN28 IgG2a M Leica 1/50

β-Catenina β-catenin-1 IgG1 M DAKO 1/50

INI-1 MRQ-27 IgG2a M Cellmarque 1/50

Anti-Melanoma HMB45 IgG1 M BioGenex 1/50

MYF-4 LO26 IgG1 M Leica 1/25

MYOD-1 5.8A IgG1 M DAKO 1/50

KI-67 MIB-1 IgG1 M DAKO 1/200

FLI-1 MRQ-1 IgG2b M Cellmarque 1/50

WT1-C No aplica IgG P Santa Cruz Biotech 1/50

DOG-1 1.1 IgG M BioGenex prediluído

ALK ALK-1 IgG3K M Cellmarque 1/25

Melan-A A103 IgG1 M DAKO 1/50

Ap2β No aplica IgG P Santa Cruz Biotech 1/100

CD57 NK-1 IgM M Leica 1/25

Enolasa 22C9 IgG2b M Leica 1/100

GFAP 6F2 IgG1 M DAKO 1/100

Sionapto DAK- SYNAP IgG1 M DAKO 1/100

Cromogranina A 5H7 IgG1 M Leica 1/50

CD99 12E7 IgG1 M DAKO 1/50

TFE3 EPR11591 IgG M ABCAM 1/50

TABLA 1: ANTICUERPOS.

Se detallan los clones, diluciones y marcas de los anticuerpos utilizados en la técnica de inmunohistoquímica. M: monoclonal, P: policlonal.




FISH de InterfaseLa técnica de FISH de interfase se realizó con el kit

Vysis Paraffin Pretreatment Reagent Kit II (Vysis, Inc.) sobre cortes histológicos FFPE de 3 µm de espesor de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Resu-midamente, una vez seleccionada la zona a utilizar se realizó la desparafinización del corte histológico con xileno, luego se realizó un pre-tratamiento del tejido con una solución de tiocianato de guanidinio durante 10 min. a 80° C seguido de digestión enzimática a 37° C por 10 min. Posteriormente se incubó con la son-da correspondiente (Tabla 2) en el hibridador HYBrite (Vysis, Inc.) para la co-desnaturalización (73° C por 5 min.) e hibridación (37° C durante 20 horas). Luego se realizaron lavados posthibridación utilizando buffer SSC 2X con NP40. Finalmente se contracoloreó con DAPI y se montó para su observación en microscopio de fluorescencia (Eclipse 80i, Nikon).

Extracción de ARNSe utilizó el kit RecoverAllTM Total Nucleic Acid

Isolation kit (Ambion Inc.) siguiendo las indicaciones

del fabricante. Suscintamente, se desparafinizaron con xileno secciones de tejido FFPE que fueron luego sometidas a digestión enzimática a 50°C durante 15 min. e inmediatamente incubadas a 80°C por 15 min. Posteriormente, la muestra fue incorporada a una co-lumna de extracción, tratada con DNasa durante 30 min. a temperatura ambiente y finalmente, el ARN fue eluido en 35 μl de agua tratada con DEPC. La con-centración y la calidad del ARN obtenido se calcula-ron con un biofotómetro (Eppendorf, plus) mediante la medición de absorbancia a 260 nm y 280 nm.

RT-PCR y PCR semi-anidadaLa transcripción reversa se llevó a cabo utilizan-

do 1 µg de ARN y hexámeros al azar en un volumen final de 20 μl con el kit SuperScript III First- Strand Synthesis SuperMix (Life Technologies) siguiendo las indicaciones del fabricante.

Para cada reacción de PCR se utilizaron 2.5 U de Taq DNA polimerasa (AmpliTaq Gold, Thermo Fisher Scientific Inc.), 1.5 mmol/L MgCl2, 10X PCR buffer (Thermo Fisher Scientific Inc.), 200 µmol/L de desoxi-

TABLA 2: REARREGLOS CROMOSOMICOS Y TRANSCRIPTOS DE FUSION.

Translocación cromosómica

Tumor Sonda (región cromosómica)

Transcripto de fusión

T.H. PCR (° C)

t (11; 22) Sarcoma de Ewing LSI EWSR1 (22q12) EWS-FLI1 59,0

Adamantinoma

t (21; 22) Sarcoma de Ewing EWS-ERG 59,0

t (7; 22) Sarcoma de Ewing EWS-ETV1 58,7

t (11; 22) Tumor desmoplásico de células redondas pequeñas EWS-WT1 57,3

t (2; 22) Sarcoma fibromixoide pulmonar EWSR1-CREB 1 58,8

Sarcoma de células claras

Fibrohistiocitoma angiomatoide

t (12; 22) Sarcoma de células claras EWSR1- ATF1 58,8

Fibrohistiocitoma angiomatoide

t (X; 18) Sarcoma sinovial LSI SS18 (18q11.2) SYT- SSX1 60,0

SYT- SSX2 60,0

t (2; 13) Rabdomiosarcoma alveolar LSI FKHR (13q14) FKHR- PAX 3 58,0

60,0*

t (1; 13) FKHR- PAX 7 58,0

55,8*

t (12; 15) Fibrosarcoma infantil congénito LSI ETV6 ETV6- NTRK 3 54,4

t (12; 16 ) Liposarcoma mixoide LSI DDIT3 (16q11) CHOP- FUS 58,8

t (7; 16) Fibrosarcoma mixoide de bajo grado LSI DDIT3 (16q11) FUS - CREB3L2 58,8

der (17) t (X; 17)

Sarcoma alveolar de partes blandas ---- TFE3-ASPL 60,0

t (1; 2) Tumor miofibroblástico inflamatorio LSI ALK (2p23) TMP3-ALK ----

del (22) Tumor Rabdoide LSI BCR22 (22q11.2) ---- ----

Se especifican las translocaciones cromosómicas y sus correspondientes transcriptos de fusión asociados a cada tipo de tumor. Se detallan las sondas utilizadas en la técnica de FISH y las temperaturas de hibridación (T. H.) en grados Celsius para la detección por RT-PCR de los distintos transcriptos de fusión. * T. H. para las reacciones de PCR semianidada.




nucleótidos trifosfato (dNTPs), y 0.2 µmol/L de oligo-nucleótidos específicos correspondientes a los distin-tos transcriptos de fusión (Tabla 2). Adicionalmente, se realizó una PCR con oligonucleótidos dirigidos a la secuencia del gen fosfoglícerokinasa (PGK) como control de amplificación y se incluyeron controles ne-gativos para cada par de oligonucleótidos utilizado, como así también, controles positivos para los distin-tos transcriptos de fusión.

Las reacciones de PCR se realizaron en termo-ciclador (Mastercicler nexus, Eppendorf). El ciclado utilizado incluyó una desnaturalización inicial a 95°C por 5 min., seguida de 60 ciclos de amplificación con-sistentes en desnaturalización por 15 seg. a 94°C, 30 seg. de hibridación (Tabla 2) y extensión por 30 seg. a 72°C. La extensión final fue de 7 min. a 72°C.

Para los transcriptos de fusión FKHR-PAX-3 y FKHR-PAX-7, se realizó una segunda ronda de PCR (PCR semi-anidada) con las mismas condiciones uti-lizadas en la primera y 1μl del producto de amplifica-ción de la misma como molde. El número de ciclos en este caso fue de 40.

Los productos de PCR fueron analizados median-te electroforesis en geles de agarosa al 1.5%.

SecuenciaciónArbitrariamente se llevaron a cabo reacciones de

secuenciación de algunos de los casos representati-vos de los transcriptos de fusión estudiados. Primera-mente, se purificaron los productos de amplificación a partir del gel de agarosa utilizando el Kit QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. De forma breve, las secciones de gel se incubaron con buffer QB durante 10 min. a 50°C, lue-go se agregó un volumen de isopropanol (Merk), y posteriormente la muestra se trasvasó a una columna de purificación. Los productos de amplificación puri-ficados se eluyeron con 30 μl de buffer EB. Para las reacciones de secuenciación se utilizó el kit BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing (Aplied Biosys-tems) siguiendo las indicaciones del fabricante. Las muestras fueron procesadas en secuenciador auto-mático Applied Biosystems 3130. El ciclado utilizado en este caso fue: 96°C por 1min. y 25 ciclos de 96°C por 10 seg. seguido de 5 seg. a 50°C y por último 4 min. a 60°C. Las secuencias nucleotídicas obtenidas se analizaron con el programa Finch TV 1.4. Para las búsquedas de homología se consultaron las bases de datos del GeneBank utilizando el programa BLAST16

Figura 1: Recategorización diagnóstica. Resultados obtenidos con la incorporación de nuevas técnicas y/o biomarcadores al diag-nóstico de sarcomas indiferenciados.




a través del servidor National Center for Biotechnolo-gy Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

RESULTADOSDe los 260 casos reclutados se obtuvieron 180 lue-

go de aplicarse los criterios de inclusión. Con la revi-sión histológica se excluyeron 36 casos debido a ex-tensa necrosis y/o hemorragia, atricción celular, mate-rial no representativo del diagnóstico original o escaso material tumoral remanente. De esta manera, se prosi-guió con el estudio de 144 sarcomas indiferenciados.

Se logró la recategorización diagnóstica de 137 casos, lo que representa el 95,1% del total analiza-do (Figura 1). La técnica de IHQ permitió determinar 32 diagnósticos (22,2%), con la técnica de FISH se arribó al diagnóstico de 24 tumores (16,7%), mientras que, con la técnica de RT-PCR se diagnosticaron 81 casos (56,2%).

En 7 casos no fue posible arribar a un diagnóstico. En 4 de ellos no se obtuvieron resultados concluyen-tes con las técnicas empleadas. Los 3 casos restan-tes continúan como inclasificables, debido a que no

presentaron ninguna de las alteraciones genéticas estudiadas.

Dentro de los casos recategorizados, 40 corres-pondieron a sarcoma de Ewing, 24 a sarcoma sino-vial, 24 a rabdomiosarcoma (18 alveolares, 4 embrio-narios, 1 fusocelular/esclerosante y 1 epitelioide), 11 a tumor desmoplásico de células redondas peque-ñas, 8 a fibrosarcoma congénito y 7 a tumor rabdoi-de. El diagnóstico en 3 casos fué tumor maligno de la vaina de nervio periférico, en 3 casos sarcoma mio fibroblástico de bajo grado, en 2 casos sarcoma de células claras, en 3 sarcoma alveolar de partes blan-das y en otros 2 fibrosarcoma mixoide de bajo grado. Sólo se encontró 1 caso de las siguientes patologías: osteosarcoma de células pequeñas, neuroblastoma, carcinoma mioepitelial, miofibromatosis, liposarcoma mixoide, fibrohistiocitoma angiomatoide, miofibrosar-coma, sarcoma fibromixoide pulmonar, adamantino-ma y tumor embrionario NOS. En la Figura 2 se repre-senta un caso ilustrativo con los resultados de todas las técnicas empleadas en la recategorización.

Finalmente, se consolidó un grupo interdisciplinario

Figura 2: Técnicas aplicadas en un caso representativo. Se muestran los resultados de las técnicas utilizadas para un caso represen-tativo. a) Técnica de PAS, b) IHQ, con anticuerpo WT1-C terminal, c) FISH de interfase, sonda LSI EWSR1 (22q12), d) RT- PCR, gel de agarosa de la amplificación del transcripto de fusión EWS-WT1 y del control de amplificación PGK con sus respectivos controles positivos y negativos, junto con un marcador de peso molecular de 100 pb.




de Patología Molecular, que quedó conformado por 2 médicos patólogos (especialistas en biología molecu-lar), 2 histotécnicos y 2 biotecnólogos. En base a la apli-cación sistemática de las técnicas mencionadas el gru-po desarrolló un flujograma de trabajo para el procedi-miento diagnóstico de este tipo de neoplasias. El mismo establece una forma de trabajo ordenada y metódica permitiendo un uso racional de los recursos (Figura 3).

DISCUSIONLos sarcomas indiferenciados constituyen un gru-

po desafiante de neoplasias, ya que se presentan en cualquier edad y localización, con una alta incidencia en el grupo etario pediátrico, y muestran un compor-tamiento maligno. Es por esto que es de suma im-portancia su caracterización temprana17. El propósito del presente estudio consistió en recategorizar los tumores que permanecían inclasificados en nuestra institución mediante la utilización de técnicas mole-culares actualmente disponibles, la incorporación de marcadores nóveles y la consolidación de un grupo de trabajo interdisciplinario.

A nivel inmunohistoquímico, a través de los años han surgido anticuerpos más variados y específicos que hoy en día constituyen marcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos. Respecto a los marcadores diagnósticos, particularmente de tumores de partes blandas, se han definido tres categorías de anticuer-pos novedosos: 1) factores de transcripción linaje-

específicos, 2) proteínas que se correlacionan con al-teraciones moleculares y 3) marcadores diagnósticos identificados por el perfil de expresión génica. En el presente estudio, dentro de la primer categoría conta-mos con los anticuerpos MYF4, MYOD-1 y FLI-1, los que sustentaron el diagnóstico de rabdomiosarcoma y sarcoma de Ewing. En cuanto a la segunda cate-goría se contó con beta-catenina, INI-1, TFE3, ALK y AP2-beta, útiles en el diagnóstico del tumor rabdoi-de extrarrenal (INI-1)18, sarcoma alveolar de partes blandas (TFE3)19 y rabdomiosarcoma alveolar (AP2-beta)20. Dentro de la tercera categoría, la ausencia de expresión del marcador DOG-1 permitió descartar un diagnóstico de tumor del estroma gastrointestinal21.

La búsqueda de rearreglos y otras alteraciones estructurales cromosómicas mediante la técnica de FISH de interfase permitió en 24 casos la detección de translocaciones características en sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma alveolar y sarcoma sino-vial, así como también la deleción del gen INI-1 en el tumor rabdoide extrarrenal. Por lo tanto la aplicación de esta metodología constituye una herramienta diag-nóstica de gran valor ya que posibilita identificar con alta sensibilidad secuencias específicas en cortes his-tológicos de material FFPE de archivo. Adicionalmen-te dirige la búsqueda de transcriptos de fusión para alcanzar un diagnóstico definitivo con otras técnicas.

Resulta importante destacar que dentro de la es-trategia diagnóstica establecida, el 56.2% de la reca-

Figura 3: Proceso diagnóstico. Flujograma de trabajo utilizado para la recategorización y adoptado para el diagnóstico de sarcomas pediátricos.




tegorización fue realizada gracias a la técnica de RT-PCR. Este hecho verifica la importancia de la incorpo-ración de las técnicas moleculares que emergieron en los últimos tiempos al diagnóstico clásico.

Del total de los casos estudiados, un 4.9% per-maneció inclasificable. Dicho valor se compara con el dato bibliográfico del 4%10. Respecto a ellos, 4 de los 7 casos resultaron no evaluables por las técnicas de FISH y RT-PCR. Esto podría deberse a una fijación y/o un procesamiento inadecuado del tejido, como así también a las condiciones de conservación de los ta-cos, especialmente en aquellos con mayor tiempo de archivo. Se sabe que los efectos deletéreos del formol pueden verse aún más agravados si no se respetan las condiciones óptimas de estos procesos, como ser el mínimo volumen de fijador, el tiempo, tanto mínimo como máximo de fijación y de los pasos del procesa-miento posterior y la calidad de las sustancias utiliza-das, entre otros22,23. Al respecto, resulta indispensable incorporar controles de calidad en la etapa pre-analí-tica que posibiliten el estudio molecular en todos los servicios de patología. Cabe destacar que cuando las mencionadas condiciones se cumplen es posible ob-tener resultados evaluables a partir de material fijado muy antiguo. De hecho, en este trabajo en particular se encontraron transcriptos de fusión en muestras provenientes de tacos de parafina con hasta 25 años de antigüedad. Los logros obtenidos, en cuanto a la aplicación de la técnica de RT-PCR en material FFPE, dan cuenta de la especialización que alcanzaron los profesionales para poder obtener resultados con este tipo de material que, como se mencionó, presenta grandes dificultades para su estudio molecular.

El resto de los casos que permanecen sin recla-sificar constituyen un desafío diagnóstico que podría alcanzarse mediante la utilización de técnicas mole-culares avanzadas como la secuenciación de nueva generación. Esto constituye un próximo objetivo a al-canzar para el SP.

La complementariedad entre las técnicas desa-rrolladas aquí permitió la recategorización del 95,1% de los casos estudiados y muestra la importancia de contar con un protocolo establecido, que permita una forma de trabajo interdisciplinaria ordenada y siste-mática a modo de optimizar los recursos disponibles. Esta experiencia permitió diseñar un flujograma de trabajo para el estudio de sarcomas pediátricos, el cual constituirá una herramienta imprescindible para acelerar el proceso diagnóstico de nuevos pacientes.

El presente estudio se realizó con el objeto de incorporar una nueva metodología diagnóstica para lograr impacto en la sobrevida y la calidad de vida de los niños con cáncer, a través del diagnóstico certero y rápido. Esto continúa siendo un desafío que, como centro de referencia nacional, requiere de actualiza-ción bibliográfica y de tecnología diagnóstica emer-gente de manera permanente y, además de su incor-poración, la comunicación y capacitación hacia otros

centros diagnósticos de menores recursos, lo cual constituye un compromiso para nuestra institución.

Conflicto de interesesNinguno de los autores manifiesta tener conflicto

de interés alguno.

REFERENCIAS1. Montes-Moreno S y López-Ríos F. Patología molecular y dianas

terapéuticas. Libro Blanco de la Anatomía Patológica en España 2013: 119-125.

2. Moreno F. Registro Oncopediátrico Hospitalario Argentino: inci-dencia 2000- 2013, tendencia temporal de incidencia 2000-2013 Sobrevida 2000-2009. 1a ed. Ciudad Autónoma de Buenos Aires: Instituto Nacional del Cáncer, 2015.

3. Torchia A. Medicina traslacional: nuevo paradigma y nuevo desafío. Inmanencia 2016; 5(1):134-135.

4. Bourdeaut F, Freneaux P, Thuille B, Bergeron C et al. Extrarrenal non-cerebral rhabdoid tumours. Pediatr Bood Cancer 2008; 54: 363-368.

5. Pawel BR, Hamoudi AB, Asmar L, Newton WA Jr et al. Undiffe-rentiated sarcomas of children: pathology and clinical behavior. An Intergroup Rhabdomyosarcoma Study. Med Pediatr Oncol 1997; 29: 170-180.

6. Somers GR, Gupta AA, Doria AS, Ho M et al. Pediatric undifferen-tiated sarcoma of the soft tissues: a clinicopathologic study. Pediatr Devel Pathol 2006; 9: 132-142.

7. Anderson DH. Tumors of infancy and childhood. I. A survey of those seen in the pathology laboratory of the babies hospital during the years 1935-1950. Cancer 1951; 4: 890-906.

8. Pack GT, Ariel IM. Sarcomas of the soft somatic tissue in infants and children. Surg Ginec Obstet 1954; 98: 675-686.

9. Fletcher CDM, Unni KK, Mertens F. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. World Health Organization Clas-sification of Tumours. Lyon, France: IARC Press, 2002: 120-124.

10. Coffin CM. The new International Rhabdomyosarcoma Classifica-tion, its progenitors, and considerations beyond morphology. Adv Anat Pathol 1997; 4: 1- 16.

11. Harms D. Soft tissue sarcomas in the Kiel Pediatric Tumor Registry. Curr Top Pathol 1995; 89: 31-45.

12. Salloum E, Flamant F, Caillaud JM, Friedman S et al. Diagnostic and therapeutic problems of soft tissue tumors other than rhab-domyosarcoma in infants under 1 year of age: a clinicopathological study of 34 cases treated at the Institut Gustave- Roussy. Med Pediatr Oncol 1990; 18: 37-43.

13. Wagner L, Smolarek T, Sumgi J, Marmer D. Assessment of Minimal Residual Disease in Ewing Sarcoma. Sarcoma 2012; Article ID 780129, 8 páginas. [Consulta: 18 de mayo de 2016]. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1155/2012/780129.

14. Coffin CM, Dehner LP, Alaggio R. Pediatric and Developmental Pathology. Perspect Pediatr Pathol. 2012; 15 Suppl: 291-293.

15. Laurent VE, Otero L, Vazquez V, Camarero S et al. Optimization of molecular detection of GD2 synthase mRNA in retinoblastoma. Mol. Med. Rep. 2010; 3: 253-59.

16. Altschul SF, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new gene-ration of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-402.

17. Andrés A, Ávila A, Luis A, Encinas J, et al. Sarcomas de partes blandas 1991- 2004. Cir Pediatr 2006; 19: 210-216.

18. Hollman TJ, Hornick JL. INI-1 deficient tumors: diagnostic features and molecular genetics. Am J Surg Pathol. 2011; 35: e 47-63.

19. Aegani P, Aulmann S, Illei PB, Netto GJ et al. A distinctive subset of PEComas harbors TFE3 gene fusions. Am J Surg Pathol. 2010; 34:1395-406.

20. Watchel M, Runge T, Leuschner I, Stegmaier S et al. Subtype and prognostic classification of rhabdomyosarcoma by immunohisto-chemistry. J Clin Oncol 2006; 24(5):816-22.

21. Lee CH, Liang CW, Espinosa I. The utility of discovered on gas-trointestinal stromal tumor 1 (DOG1) antibody in surgical pathology- the GIST of it. Adv Anat Pathol. 2010; 17: 222-32.

22. Broeckx V, Peeters L, Moes E, Pringles L et al. Formalin-Fixed paraffin- embedded tissue: The holy grail of clinical proteomics. Proteomics Clin Appl. 2014; 8:735-6.

23. Strand C, Enell J, Hedenfalk I and Ferno M. RNA quality in frozen breast cancer samples and the influence on gene expression analy-sis – a comparison of three evaluation methods using microcapillary electrophoresis traces. BMC Molecular Biology 2007; 8:38.



DISPONIBILIDAD DE TECNICAS MOLECULARES PARA NIÑOS …

Documents

Transcript of DISPONIBILIDAD DE TECNICAS MOLECULARES PARA NIÑOS …