TECNICAS MOLECULARES EN EL ESTUDIO DE HLA (SSO – SSP)

Lic. T.M. Arturo ArzapaloHNERM

SERVICIO DE BANCO DE ORGANOS

Y LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD

POLIMORFISMO DE HLA

SISTEMA HLA PRESENTA ALTO

GRADO DE POLIMORISMO(PRESENCIA DE MULTIPLES ALELOS

EN UN LOCUS)

TIPIFICACION DE HLA MOLECULAR

HLA SEROLOGICOESTUDIO FENOTIPICO

HLA MOLECULARESTUDIO GENOTIPICO

MICROLINFOCITOTOXICIDAD MEDIADA POR COMPLEMENTO

PCR- SSOPCR- SSPPCR- SBT

A DIFERENCIA DE LOS METODOS SEROLOGICOS LOS METODOS MOLECULARES PERMITEN ESTUDIAR LAS MULTIPLES

DIFERENCIAS ALELICAS DEL HLA

SEROLOGIA

MOLECULAR

POLIMORFISMOSEROLOGICO

POLIMORFISMOGENETICO

NOMENCLATURA – HLA MOLECULAR

ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED EICH – GVHD

• COMPLICACION DE MAYOR IMPORTANCIA EN EL TRASPLANTE ALOGENICO DE CELULAS MADRE: (LEUCEMIAS, LINFOMAS, APLASIA..)

• UNA AFECCIÓN EN LA CUAL LAS CÉLULAS DEL DONANTE ATACAN A LOS TEJIDOS DEL RECEPTOR

• LOS ANTIGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD (HLA) ESTAN INVOLUCRADOS EN EL RECHAZO DEL INJERTO CONTRA EL HUESPED

• ES NECESARIO ENCONTRAR UN DONANTE COMPATIBLE “HLA

IDENTICOS”

Exon 2

1 2

Exon 4

3

Exon 1

Leader

Exon 3

POLIMORFISMO – HLA A

POLIMORFISMO – HLA B

POLIMORFISMO – HLA C

Exon 2

1 2

Exon 1

Leader

Exon 3

POLIMORFISMO – HLA DR

TIPIFICACION POR PCR-SSO

• SSO (Oligonucleotido de Sequencia Especifica)– Son SONDAS complementarias al ADN objetivo

– ADN amplificado por PCR se hibridiza con SONDAS de SSO.

– Pueden llegar a resolucion generica o intermedia.

– De Alto rendimiento.

GARANTIZAN LA DISCRIMINACION ENTRE LA SECUENCIA DEL ADN OBJETIVO (ALELO) Y OTRO ESTRECHAMENTE

RELACIONADO.

SECUENCIA DEL PCR - SSO

EXTRACCION DE ADN

AMPLIFICACIONGENERICA DEL LOCUS A, B Y DR

DESNATURALIZACIONDEL MOLDE DE ADN EN CADENAS SIMPLES

HIBRIDIZACION CON SONDAS ESPECIFICAS PARA LOS ALELOS POLIMORFICOS DE HLA

IDENTIFICACIONUSANDO UN CONJUGADO UNIDO A UNA ENZIMA O FLUOROCROMO

PRIMER GENERICOS

SONDAS

3’ 5’

SONDA

SOPORTE

SE ENCUENTRAN UNIDOS A UN SOPORTE Y SON ESPECIFICOS PARA UN ALELO DE HLA

SOPORTE SOLIDO:

- PERLAS DE LUMINEX

- MEMBRANA DE NYLON

- TIRAS DE NITROCELULOSA

- PLACAS DE

MICROTITULACION

- MICROCHIPS

PERLAS DE LUMINEX

ESPECIFICIDAD DE LAS SONDAS

LAS SONDAS PERMITEN LA DETECCION DE ALELOS ESPECIFICOS POR HIBRIDIZACION

DETECCION DE SECUENCIAS ESPECIFICOS POR HIBRIDIZACION CON SONDAS

SONDA

AMPLIFICACION

SE REALIZA LA PCR USANDO PRIMERSGENÉRICOS PARA LOCUS A, B, DR

LOCUS A y B EXON 2 y 3

LOCUS DR EXON 2

LOS PRIMERS ESTAN MARCADOS CON BIOTINA

EXON

B

BPRIMER

GEN HLA (ADN)

5’ 3’

ADN amplificado

BiotinaB

DESNATURALIZACION - HIBRIDIZACION

EL ADN SE DESNATURALIZA PARA OBTENER CADENAS SIMPLES DE ADN

CADA SONDA ES ESPECÍFICA DE UNA SECUENCIA POLIMORFICA (ALELO)

PERO ESTA SECUENCIA PUEDE SER COMPARTIDA POR DIFERENTES ALELOS

LAS SONDAS SE UNEN A LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA DEL ADN

3’ 5’

5’ 3’

ADN amplificado

SONDA

BiotinaB

5’ 3’

B

DETECCION

SE USA CONJUGADO ESTREPTAVIDINA MARCADO CON:

FLUOROCROMO: FLUORESCENCIA

ENZIMA + SUSTRATO: COLORIMETRIA

3’ 5’

5’ 3’

DNA amplificado

SONDA

Biotina

Estreptavidina

Fluorocromo

B

TECNOLOGIA LUMINEX

PERLAS + SONDAS

TIPIFICACION POR SSP

• PCR-SSP :ES UN METODO QUE USA PRIMERS DE SECUENCIA ESPECIFICA QUE PERMITIRA AMPLIFICAR SOLO ALELOS ESPECIFICOS

• INVOLUCRA DISEÑO CUIDADOSO DE PRIMER, DONDE EL EXTREMO 3’ DEL PRIMER COINCIDA SOBRE EL NUCLEOTIDO DE LA SECUENCIA POLIMORFICA A SER ANALIZADO (ALELO)

• ES UNA PRUEBA RAPIDA

• DE BAJO RENDIMIENTO

FUNDAMENTOLA AMPLIFICACION OCURRIRA SOLO SI EL EXTREMO 3’ DEL PRIMER COINCIDA PERFECTAMENTE AL ALELO POLIMORFICO

EL PRIMER DE SECUENCIA ESPECIFICA (SSP) QUE TERMINA EN AGTACT AMPLIFICARA SOLO AL MOLDE QUE PRESENTA LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA

LOS RESULTADOS SON DETERMINADOS DIRECTAMENTE POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

X

SECUENCIA DEL PCR - SSP

EXTRACCION DE ADN

AMPLIFICACION DE ADN EN UNA PLACA DE 96 POZOS

LOS AMPLICONES SON ANALIZADOS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

ANALISIS DE DATOS:

LAS MUESTRAS PRODUCIRAN 2 PRODUCTOS DE PCR (CONTROL Y ALELO ESPECIFICO) SOLO EN AQUELLOS POZOS Q CONTINEN EL PRIMER COMPLEMENTARIO AL ALELO DE HLA EN LA MUESTRA

ANALISIS DE DATOS:

POZOS QUE NO POSEEN ALELOS COMPLEMENTARIOS DEL PACIENTE TENDRAN UNA SOLO BANDA DE CONTROL DE AMPLIFICACION

CADA POZO DE REACCION CONTIENE

UNA MEZCLA DE PRIMERS DE SECUENCIA ESPECIFICA Y UN

PRIMER CONTROL DE AMPLIFICACION

ELECTROFORESIS

SIEMPRE VISIBLE UNA BANDA DE CONTROL INTERNO COMO CONTROL DE UNA AMPLIFICACION SATISFACTORIA

LA AUSENCIA DE AMPLIFICACION DE CUALQUIER POCILLO PUEDE ANULAR LOS RESULTADOS DE LA PRUEBA

UNA REACCION POSITIVA: SI HAY AMPLIFICACION DE UN ALELO DE HLA ESPECIFICO

SE USA BROMURO DE ETIDIO O SYBER GREEN

ANALISIS DE DATOSCONTROL NEGATIVO

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

ANALISIS DE DATOS

HLA MOLECULAR

A*02XX

XX: 020101020102….

???¿¿¿¿¿

SSO - SSP

SSO SSP

TECNOLOGIA BASADA EN LA AMPLIFICACION DE PCR CON

HIBRIDIZACION CON SONDASESPECIFICAS

UTILIZA PRIMER ALELO ESPECIFICOSSON ESPECIFICO PARA UN DETERMIANDO ALELO POLIMORFICO

USA SOFTWARE PARA SU INTERPRESTACION SE REALIZA EN 10 HORAS (DOS DIAS)

ANALISIS SENCILLO Y RAPIDO USANDO ELECTROFORESIS PARA LA OBSERVACION (2 HORAS)

BAJA E INTERMEDIO RESOLUCION BAJA Y ALTA RESOLUCION

NECESITA 20 ng de ADN NECESITA 100 ng DE ADN

SE TRABAJA VARIAS MUESTRAS A LA VEZ SE TRABAJA POR MUESTRAS INDIVIDUALES

GRACIAS