Bases moleculares de la pérdida

de expresión

de moléculas

HLA de clase I en tumores

de colon

Carmen M. Cabrera Morales

Servicio de Análisis Clínicos e Inmunología, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada

Incidencia global del cáncer en los países desarrollados y en vías de desarrollo

Miles de nuevos casos diagnosticados en el año 2010

Pulmón

Mama

Colon

Estómago

Hígado

Próstata

Cérvix

Esófago

Vejiga

Linfoma no-hodgkin

Cavidad oral

Leucemia

Páncreas

Paísesdesarrollados

Países en vías dedesarrollo

S Epitelio

T. conjuntivo

(1)

(2)

(3)Epitelio

T. conjuntivo

Modelo de tumorogénesis

S, célula stem epitelial

Intestino normal

Poliposis adenomatosafamilial

APC+/-

Tumores de colonesporádicos

Pólipo adenomatoso Carcinoma

Pérdida de APCen células epiteliales

Transformación maligna

Progresión adenoma-carcinoma:

inactivación

bialelica de APC

NormalAdenomatemprano

Adenomatardío

Carcinoma

APC/b-Catenina COX-2 K-Ras p53 18q LOH

Genes MMR(hMSH2, hMLH1)

TGFbRII, BAX,

IGF-IIR, E2F4,

TCF-4

A

B

APC/b-Catenina

Inestabilidad cromosómica (A) e inestabilidad demicrosatélites (B) en tumores de colon

Inestabilidad genética/ heterogeneidad tumoral

Selección inmune

a) b) c)

Cáncer inmunoediting: generación de variantes

tumorales inmunorresistentes

Antígenotumoral

Proteasoma

Péptidos

RE

TAP

b2m

Aparato deGolgi

Superficiecelular

Complejotrimérico

Ruta biosintética de moléculas HLA de clase I

FENOTIPOS HLA CLASE I EN TUMORES

FENOTIPO HLA CLASE I NORMAL

A2

A29

B44

Cw1

Cw4

FENOTIPO IVPérdida de alelo

A29

Cw1

A2

Cw4

FENOTIPO IIIPérdida de Locus

FENOTIPO IPérdida Total

A2 A29

B44

B8Cw1

Cw4

FENOTIPO IIPérdida de Haplotipo

A29

Cw1

B44

OBJETIVOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL

1. Conocer los mecanismos implicados en la pérdida total de moléculas HLA de clase I (Fenotipo I).

95 tumores de colonestudiados por inmunohistología (Abms W6/32, HC10)

Expresión de cadena pesadaHLA de clase I

Estudio de defectos estructuralesy de expresión en b2m

Expresión de genes de la maquinariade procesamiento y presentación

antigénica (TAP1/TAP2, LMP2/LMP7)

14 tumores con pérdida total de expresión de moléculas HLA de clase I

Inestabilidad de microsatélites (MSI)

2. Dada la elevada frecuencia de pérdida selectiva de HLA-B44 (Fenotipo IV) encontrada en tumores de colon por técnicas inmunohistológicas, determinar los mecanismos responsables.

Tumores de colon con ausencia de expresión

de HLA-B44 (Abms 116-5-28, 66HA)

13 tumores con pérdida de

HLA-B44

Estudio de pérdida

de heterozigosidad

en 6p21.3

Expresión y defectos

estructurales en

HLA-B

3. Determinar la frecuencia de pérdida de haplotipo HLA-I

MICRODISECCIÓN DE SECCIONES DE COLONCRIOPRESERVADAS

Extracción de DNA y mRNA

Microdisección manual

Pipeta Aguja

A

B

Patrones inmunohistológicos en tumores de colon con Fenotipo I

Proteína RNAm

Tumor HC/b2m b2m HC HLA b2m

CO5 - - - + +

CO6 - - - + +

CO14 - - - + +

CO18 - - - + +

CO19 - - - + +

CO22 - - - + +

CO26 - - - + +

CO85 - - - + +

CO86 - - + + -

CO108 - - - + +

CO117 - - + + -

CO128 - - - + +

CO132 - - + + -

CO135 - - + + -

HC, cadena pesada HLA de clase I

SECUENCIA LÍDER EXÓN 2

5‘-ATG CTCTCTCT

37 44

CCCCC TAA-3‘AAAAAAAAAA

200 204 272 276 281 285 360

Mutaciones de b2m encontradas en secuencias de repetición de mononucleótidos en tumores gastrointestinales

con fenotipo mutador

Inserciones y deleciones

Mutaciones missense

Análisis de inestabilidad de microsatélitesen tumores HLA de clase I negativos

Patrón de inestabilidad de BAT26y TGFbRII

Tumor BAT

26

BAT

40

BAT-

RII

BAX TNM Grado

histológico

*CO86 + + - - T4N2M1 MD

*CO117 + ND ND + ND ND

*CO132 + + + + T4N3M0 MD

CO135 + + + - T4N2M0 PD

Presencia (+) o ausencia (-) de MMP; MD, moderadamente diferenciado; PD, pobremente diferenciado; ND, no

determinado; *Tumores HNPCC (Criterios de Amsterdam)

Mutaciones de b2m en tumores de colon MSI (inestabilidadde microsatélites) positivos

*Deleción no descrita en la literatura.

Tumor ExonHomocigoto/

heterocigotoMutación

Posición del

codon stop

CO86

CO117

CO132

CO135

Exon 2

Exon 2

Exon 2

Exon 2

Secuencia líder

Secuencia líder

Heterocigoto

Heterocigoto

Heterocigoto

Heterocigoto

Homocigoto

Homocigoto

*deleción CA, codón 25

deleción A, codón 67

deleción C, codón 91

*deleción CCGTG,

codones 101-102

deleción CT, codones 13-

15

deleción CT, codones

13-15

56

102

102

114

56

56

CO86 CO132

CT

A

Estroma

Tumor

Estroma

Tumor

Del. A (A5)Del. CT (CT4)

Cromosoma 15

15q21

D15S126

15qter

D15S209

Centrómero

Telómero

b2m

15pter-15qter 15q21(próximoa b2m)

Pérdida de heterozigosidad (LOH) en b2m (15q.22)

Tumor D15S126 D15S209

CO5

CO6

CO14

CO18

CO19

CO22

CO26

CO85

CO86

CO108

CO117

CO128

CO132

CO135

LOH

MSI

MSI

ROH

H

ROH

H

ROH

MSI

ROH

MSI

ROH

MSI

MSI

ROH

MSI

MSI

ROH

LOH

ROH

H

H

ROH

ROH

MSI

ROH

MSI

MSI

LOH, pérdida de heterozigosidad;

ROH, retenciónde heterozigosidad;

H, homocigoto;

MSI, inestabilidad de microsatélites.

Análisis de la expresión de genes APM en tumores de colon microdisectados MSI negativos

β2m

HLA

TAP1

TAP2

LMP2

LMP7

LMP2M*

- 424 pb

- 308 pb

- 273 pb

- 298 pb

- 449 pb

- 542 pb

PM 5 6 14 18 19 22 26 85 108 128 C+ C-

LMP7M*

- 614 pb

- 449 pb

- 542 pb

Actina

Fenotipo I;

15%

Pérdida de

B44; 14%

Resto de

tumores; 71%

PÉRDIDAS HLA DE CLASE I

EN TUMORES DE COLON

0

5

10

15

20

25

30

35

B7 B15 B27 B38 B41 B50 B56 B60

B44 (24%)

Frecuencia de HLA-B44 en la población caucásica

6p21.3

Centrómero

Telómero

Cromosoma 6

Clase II III Clase I

TAP1 TAP2 HLA-B HLA-C HLA-A

D6S291 D6S273 D6S265C125C12C D6S276D6S105

Microsatélites

PÉRDIDA DE HETEROZIGOSIDAD EN 6p21.3

Tumor Tipaje HLA STR Haplotipo

perdido

(SSO)D6S311 D6S291 D6S273 C12C C125 D6S265 D6S105 D6S276

CO32 A29, -; B44, 62 N L H L L H H L ND

CO67 A2, 29; B44, 51 L L H L L H L H A29/B44

CO69 A24, -;B44, 35 L L L L L H H L A24/B44

CO101 A2, 29; B44, 7 L L L L L L H L A29/B44

STR, microsatélite; N, normal; L, LOH; H, homocigoto; ND, no determinado

Tumores con tinción inmunohistológica negativa de B44 y

pérdida de haplotipo HLA-I

Tumor Tinción con los Abms

116-5-28/66-HA

Tipaje HLA-B

(SBT)

CO46

CO49

CO53

CO57

CO61

CO74

CO81

CO99

CO100

-

-

-

-

-

-

-

-

-

B*4402/51011

B*4403/1402

B*4403/0702

B*4403/4005

B*4403/3534

B*4403/4501

B*4402/40011

B*4403/4501

B*4405/4501

Tumores de colon con expresión negativa de HLA-B44

SBT (Sequence Based Typing),secuenciación en alta resolución

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

B*4402 B*4403 B*4405

Tumor

Control

Frecuencia de los diferentes subtipos de HLA-B44 en los tumores de

estudio y en la población control

p <0.05

EX1 EX2 EX3 EX4 EX5 6 7 8

Región 3‘ no traducida

HLA-5UT BSACG3

EF4 BNSA HLA-3UTB

(1388 pb)

Estrategia de secuenciación del locus HLA-B

cDNA

Asp114Asp114

Imagen especular de HLA-B4402/4403/4405

Péptidosubóptimo

Calnexina

BiP

HC

ERp57 b2m

Crt

Complejo de carga peptídico

Tpn

TAP1 TAP2

Péptido óptimo

RE

Citosol

Proteina ubiquitinada Proteasoma

ATP ATP

HC, cadena pesada HLA de clase I

Crt, calreticulina; Tpn, tapasina

Tapasina y el complejo de carga peptídicoHLA de clase I

- 424 pb

- 281 pb

- 281 pb

b2m

Tapasina

Tapasina*

46 49 53 57 61 74 81 99 100 C+ C-

TAP1

TAP2

- 273 pb

- 298 pb

Expresión de tapasina, TAP1/TAP2 en tumores de coloncon ausencia de expresión en superficie de B44

Tapasina*, expresión en mucosa autóloga

Tumores de colon HLA-B44 positivos

C- C+ VE10 CL87 CL86 CL54

- 424 pb

- 281 pb

b2m

Tapasina

B

- 281 pbTapasina

A

62 67 94 101 106 C+ C-

Pérdida de haplotipo HLA-I asociado apérdida de heterozigosidad en 6p21.3

D6S105D6S265C.1.2.5C.1.2.CD6S273Ds291

Estroma

Tumor

Tumor CO15

Electroferogramas de microsatélites que mapean 6p21.3

Fenotipo I; 14%

Pérdida

selectiva de

B44; 15%

Fenotipo II;

40%

Tumores sin

alteración

HLA-I; 31%

FI

FIV

FII

Resto

69% de los tumores de colon presentan alteración HLA-I

1. Fenotipo I MSI positivos

- Inactivación bialelica de b2m (4casos).

MSI negativos

-Alteración del componente del proteasomaLMP7; y defecto de expresión de TAP2 (4 casos).

- En un único caso no se ha podido determinar el mecanismo responsable (CO5).

2. Expresión negativa en superficie de B44

- Tumores con pérdida de haplotipo B44 (4 casos).

-Tumores con defecto de expresión en la chaperona tapasina, componente del complejo de carga peptídico de clase I (9 casos).

3. Pérdida dehaplotipoHLA-I

-El 40% de los tumores de colon presentanLOH en la región 6p21.3

Alteraciones HLA-I en los tumores de colon presentados

Estadio

Dukes TNM Numérico DescripciónPatológica

Tasa de supervivencia a los

5 años (%)

A T1N0M0 I Cáncer limitado a la mucosa y submucosa

>90

B1 T2N0M0 II Cáncer extendido en lamuscular

85

B2 T3N0M0 II Cáncer extendido en laserosa

70-80

C TxN1M0 III Invasión de los ganglios linfáticos regionales

35-65

D TxNxM1 IV Metástasis distantes (hígado, pulmón, etc)

5

Estadios y pronóstico en el cáncer

de colon