AMINOÁCIDOS

PÉPTIDOS Y

PROTEINAS

M. EN C. ISRAEL VELÁZQUEZ MARTÍNEZ

1

AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS. Los aminoácidos, como su nombre lo indica, son bifuncionales. Contienen un grupo amino básico y un grupo carboxílico ácido.

O

NH

OHH

O

OH

NH2

R

Un α-aminoácido primario L-Prolina Un α-aminoácido secundario

Con fines de clasificación, las cadenas con menos de 50 aminoácidos se llaman polipéptidos, mientras que el término proteína se reserva a cadenas mas largas.

O

NH2

CH3OH

O

NH2OH

+

O

NH2

CH3NH

O

OH

Alanina Glicina un dipéptido (un enlace amida)

Un polipéptido (muchos enlaces amida).

Estructura de los aminoácidos.

Como los aminoácidos contienen un grupo ácido y un grupo básico, experimentan una reacción ácido-base intramolecular y se encuentran principalmente en la forma de un ión dipolar, o Zwitterion (del alemán zwitter, híbrido):

O

OH

NH2

CH3

H

O

O-

NH3+

CH3

H Alanina (sin carga) (zwitterion)

2

Los iones dipolo (zwitterions) de los aminoácidos son sales internas y por ello tienen muchas de las propiedades físicas asociadas con las sales. Poseen momentos dipolares grandes, son solubles en agua e insolubles en hidrocarburos, y son sustancias cristalinas con puntos de fusión altos. Además los aminoácidos son Anfóteros: pueden reaccionar como ácidos o como bases, dependiendo de las circunstancias.

En solución ácida En solución básica

En la siguiente tabla se representan las estructuras de los 20 aminoácidos que se que encuentran en las proteínas. Todos son α-aminoácidos. Diecinueve de los 20 aminoácidos son aminas primarias, RNH2, y sólo difieren en la naturaleza del sustitúyete unido al carbono α, llamado Cadena lateral.

Un α-aminoácido primario Prolina, Un α-aminoácido secundario

Cadena lateral Además de los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas, hay otros aminoácidos que no son proteínas y que tienen importancia biológica.

O

O-

NH3+

O

NH3+

SHO-

O

I

I

I

I

OHNH3

+

O O-

Ácido γ-aminobutírico Homocísteina Tiroxina

3

ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS.

Nombre Abreviaturas PM Estructura pKa pKa pKa PI Sol. P.f. COOH NH3+ cad. lat. H2O, g/dL a 25°C Aminoácidos Neutros.

Alanina Ala (A) 89

O

NH2

CH3OH

2.34 9.69 --- 6.01 17 297 d

Asparagina Asn (N) 132

O

O

NH2

NH2

OH

2.02 8.80 --- 5.41 2.4 236

Cisteína Cys (C) 121

O

NH2

SH OH

1.96 10.28 8.18 5.07 Muy --- Soluble

Glutamina Gln (Q) 146

O

O

NH2

NH2

OH

2.17 9.13 --- 5.65 3.6 186

Glicina Gly (G) 75

O

NH2OH 2.34 9.60 --- 5.97 25 233 d

Isoleucina Ile (I) 131

O

NH2

CH3

CH3OH

2.36 9.60 --- 6.02 4 284

Leucina Leu (L) 131

O

NH2

CH3OH

CH3 2.36 9.60 --- 5.98 2 337

Metionina Met (M) 149

O

NH2

SCH3 OH

2.28 9.21 --- 5.74 3 283

4

Nombre Abreviaturas PM Estructura pKa pKa pKa PI Sol. P.f. COOH NH3+ cad. lat. H2O, g/dL a 25°C Aminoácidos Neutros cont…

Fenilalanina Phe (F) 165

O

NH2

OH

1.83 9.13 --- 5.48 3 283

Prolina Pro (P) 115

O

NH

OH

1.99 10.60 --- 6.30 162 220

Serina Ser (S) 105

O

NH2

OH OH

2.21 9.15 --- 5.88 5 228

Treonina Thr (T) 119

O

NH2

OH

CH3

OH

2.09 9.10 --- 5.60 Muy 257 Soluble O

NHNH

2

OH Triptofano Trp (W) 204 2.83 9.39 --- 5.89 1 289 O

NH2OH

OH Tirosina Tyr (Y) 181 2.20 9.11 10.07 5.66 0.04 344

Valina Val (V) 117

O

NH2

CH3

CH3 OH

2.32 9.62 --- 5.96 9 315 5

Nombre Abreviaturas PM Estructura pKa pKa pKa PI Sol. P.f. COOH NH3+ cad. lat. H2O, g/dL a 25°C Aminoácidos ácidos.

NH2O

O

OOH

HÁcido aspártico Asp (D) 133 1.88 9.60 3.65 2.77 0.4 269 O O

OHOH

NH2

Ácido glutámico Glu (E) 147 2.19 9.67 4.25 3.22 0.7 247

NH

O

NH

NH2

NH2

OHAminoácidos básicos. Arginina Arg (R) 174 2.17 9.04 12.48 10.76 15 230 d

Histidina His (H) 155

O

NH2

NH

N

OH

1.82 9.17 6.00 7.59 0.4 287 O

NH2

NH2OH

Lisina Lis (K) 146 2.18 8.95 10.53 9.74 Muy 255 Soluble Problema 1. ¿Cuántos de los aminoácidos que se muestran en la tabla contienen anillos aromáticos? ¿Cuántos contienen azufre? ¿Cuántos contienen alcoholes? ¿Cuántos contienen cadenas laterales hidrocarbonadas? Con excepción de la glicina, los carbonos de los α-aminoácidos son centros quirales. Por lo tanto, son posibles dos formas enantioméricas, pero la naturaleza sólo utiliza una para la construcción de las proteínas. En las proyecciones de Fischer, los aminoácidos que se encuentran en forma natural se representan colocando el grupo COOH en la parte superior y la cadena lateral abajo, como se dibuja un carbohidrato, y luego se coloca el grupo –NH2 a la izquierda. Debido a la similitud estereoquímica con los azúcares L, llamamos a los α-aminoácidos que se encuentran en forma natural como aminoácidos L.

6

CHO

CH2OH

H OH

COOH

R

H NH2

CHO

CH2OH

OH H

COOH

R

NH2 H

D-gliceraldehído D-aminoácido L-gliceraldehído L-aminoácido Problema 2. Dieciocho de los 19 L-aminoácidos tienen configuración S en el carbono α. La císteina es el único L-aminoácido con una configuración R. Explique la razón. Problema 3. El aminoácido Treonina, ácido (2S, 3R)-2-amino-3-hidroxibutanoico tiene dos centros quirales. Dibuje una proyección de Fischer para la Treonina. ¿Cuántos estereoisómeros podrían existir? Dibuje las proyecciones de Fischer e identifique los centros quirales como R o S. Problema 4. Dibuje formulas con enlaces de cuña (tetraédricas) y proyecciones de fischer que representen la configuración de los átomos de carbono de la L-valina, L-leucina y L-isoleucina. Aminoácidos esenciales. Son aminoácidos que el organismo no puede sintetizar. Reacción de transaminación.

COOH

R

NH2 H

COOH

R1

O+ +Enzimas transaminasas

(muchos pasos)

COOH

R

O

COOH

R1

NH2 H

Aminoácido cetoácido cetoácido aminoácido Antiguo antiguo nuevo nuevo Fenilcetonuria.

Enzimas

O

NH2

OH

O

NH2OH

OH

7

REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN. Un interesante el papel de las iminas como intermediarios es el de la reacción de transaminación, de importancia biológica. La transaminación es un proceso por el cual se transfiere un grupo amino de una molécula a otra. En los sistemas biológicos el grupo amino de un aminoácido se transfiere al grupo carbonilo de otra molécula. La secuencia, es promovida por una enzima, la transaminasa, es un método de formación de nuevos aminoácidos.

O

OH

NH2

CH3

O

OH

O

O

OHglutamato

transaminasa

O

OH

O

CH3

OO

OH

NH2

OH

+

+

Alanina Ácido-α-cetoglutárico.

Ácido pirúvico Ácido glutámico

Todas las transaminasas importantes parecen compartir la misma coenzima, el fosfato de piridoxal. Las coenzimas son pequeños constituyentes no proteínicos de las enzimas, con frecuencia indispensables para la actividad enzimática.

N

O

OOH

CH3

H

PO

OH

OH

Fosfato de piridoxal. La transaminación biológica no es la simple transferencia de un grupo amino de una molécula a otra. El grupo carbonilo de la coenzima piridoxal forma primero una imina con el grupo amino del aminoácido “donador”. La reacción subsiguiente de este aducto con el compuesto carbonílico “receptor” conduce a la formación de un nuevo aminoácido, regenerándose el fragmento de piridoxal. El piridoxal es el transportador del grupo amino de un reactivo a otro. La secuencia, de numerosos pasos, supone una serie de adiciones e isomerizaciones reversibles.

8

Mecanismo general de una reacción de transaminación.

O

PRP H O

OH

NH2

R PRP

HO OH

N R

OH2

PRP

HO OH

N RPRP

HO OH

N R

H

PRP

HO OH

N R

H OH2

PRP

H

NH2

H O

OH

R

O

O

OH

R1

OPRP

H

NH2

H

PRP

H

N

H

O OH

R1OH2

PRP

H

N

H

O OH

R1PRP N

HO OH

R1

PRP N

HO OH

R1

OH2

NH2

O O

R1

H

PRP O

H

+ +

+ +

+ +

+ +

PRP = fosfato de piridoxal.

9

Reacción de transaminación catalizada por la Aspartato aminotransferasa.

CH3 CH3

N

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

O-O-

NH2O

OH

NH+

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

O-O-

O

OH

CH3 CH3

B:

NH+

NH

OHO

CH3

PO

O-

O-

O-O-

O

O

NH+

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

O-O-

O

O

NH3+

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

O

O-O-

O

O

paso lento

CH3 CH3

B+

H

OH2

aldimina

quinoide

NH3+

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

O

O-

CH3

O

NH+

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

O-

O

CH3

H

CH3 CH3

B:

NH+

NH

OHO

CH3

PO

O-

O-

O-

O

CH3

NH+

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

O-

O

CH3

NH+

NH

+

OHO

CH3

PO

O-

O-

CH3 CH3

NH3+

O-

O

CH3

CH3 CH3

B+

H

CH3 CH3

NH2

10

ACIDEZ, BASICIDAD Y pKa.

Lewis. Ácido: acepta electrones. Base: cede electrones. Brosnted-Lowry. Ácido: cede protones Base: recibe protones.

H-A + H2O H3O+ + A- Ácido Base ácido base

conjugado conjugada

Keq = [H3O+][A-] [HA][H2O]

La concentración del agua permanece casi constante. [H2O]= 55.6 M a 25°C.

Ka = Keq [H2O] = [H3O+][A-]

[HA]

log Ka = log [H3O+][A-] [HA]

log Ka = log [H3O+] + log [A-]

[HA]

- log Ka = - log [H3O+] - log [A-] [HA]

pKa = pH – log [A-]

[HA]

pH – pKa = log [A-] [HA]

pH = pKa + log [A-] [HA]

Ecuación de Henderson – Hasselbalch.

11

Un ácido más fuerte (de mayor Ka) tiene pKa menor. Un ácido más débil (de menor Ka) tiene mayor pKa.

Compuesto en una solución de pH por debajo del pKa se encuentra protonado (ionizado). Compuesto en una solución de pH por encima del pKa se encuentre no protonado (no ionizado).

Factores que afectan el pKa:

Efecto resonante. Efecto inductivo y electrostático. Efecto estérico. Puentes de hidrógeno intramoleculares. Hibridación.

Efecto inductivo.

O

OHCH3

O

OHO2N

O

OH

Cl

O

OH

Cl

Cl

O

OH

Cl

ClCl

O

OHF3C

pKa: 4.5 1.68 2.8 1.3 0.9 0

Efecto resonante

O

OHCH3

CH3

OH OR

O O

R1 O

R

O

R1

NH3+

N+

O- O

NH3+

NO2

NH3+

pKa: 4.5 16 11 19.20 1.11 2.5 4.60

Efecto estérico

O

OHCH3

O

OH

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3CH3

CH3

pKa: 4.5 7.0

12

Puentes de hidrógeno.

O

OH

OH

O

OH

OH pKa: 4.5 3.0 pKa: 9.3 13.4

Hibridación.

NH +

CH3 CH3

CH3

NH

+

C NH+CH3

pKa: 9.8 5.2 - 10

AMINOÁCIDOS. INFLUENCIA DE LA CADENA LATERAL.

O

NH

OH

O

NH2

NH

N

OH

O

NH2NH

OH

pKa: 1.99 pKa: 2.83 pKa: 1.82 pKa: 10.60 pKa: 9.39 pKa: 9.17 pKa: - - - pKa: 6.00

OHOH

NH2O

O

NH

O

NH

NH2

NH2

OH

pKa: 1.88 pKa: 2.17 pKa: 9.60 pKa: 9.04 pKa: 3.65 pKa: 12.48

13

Problema 5. Pronostique los productos de reacción de: (a) prolina, (b) tirosina, (c) arginina y (d) triptofano con un exceso de HCl; y con un exceso de NaOH. Problema 6. Escriba las formulas estructurales para las siguientes ecuaciones:

(a) fenilalanina con un equivalente de NaOH. (b) Producto de (a) con un equivalente de HCl. (c) Producto de (a) con dos equivalentes de HCl.

PUNTO ISOELÉCTRICO.

pH bajo (protonado)

pH alto (desprotonado)

Punto Isoeléctrico PI = pKa1 + pKa2

2 Zwitterion neutro.

El punto isoeléctrico (PI) de un aminoácido depende de su estructura; y es el promedio de las dos constantes de disociación ácida que incluyen el zwitterion neutro. En cuanto a los aminoácidos con una cadena lateral que sea un ácido fuerte o un ácido débil, el PI es el promedio de los dos valores de pKa más bajos. En el caso de los aminoácidos con una cadena lateral básica, el PI es el promedio de los dos valores de pKa más altos.

Aminoácido neutro Alanina

Aminoácido básico Lisina

Aminoácido ácido Ácido aspártico.

14

Así como los aminoácidos tienen sus PI, las proteínas también tienen un PI global debido a los numerosos residuos ácidos o básicos que pueden contener. Aprovechamos la ventaja de las diferencias de puntos isoeléctricos para separar una mezcla de aminoácidos (o una mezcla de proteínas) en sus constituyentes puros mediante la técnica de la Electroforesis.

Tira de papel a pH = 6.02 Cuando se aplica un potencial eléctrico, los aminoácidos con cargas negativas (los que se han desprotonado a causa de que el pH del buffer es más alto que sus PI) migra lentamente hacia el electrodo positivo. Al mismo tiempo que los aminoácidos con cagas positivas (los que se han protonado porque el pH del buffer es menor que su PI) migran hacia el electrodo negativo. Los diferentes aminoácidos migran a diferentes velocidades, lo que depende de sus puntos isoeléctricos y del pH del buffer acuoso. Así es posible separar una mezcla de diversos aminoácidos. Problema 7. Para las siguientes mezclas de aminoácidos, prediga usted la dirección y la velocidad relativa de migración de cada componente:

(a) valina, ácido glutámico e histidina a pH= 7.6 (b) glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.7 (c) glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.5 (d) glicina, fenilalanina y serina a pH= 6.0

Problema 8. La glicina, al igual que la alanina tiene un punto isoeléctrico de 6.0. Trace estructuras de las formas predominantes de la glicina a pH= 2.0, 6.0 y 10.0. Problema 9. ¿Cómo podría explicar el hecho de que el triptofano tenga menor punto isoeléctrico que la histidina, pese a que ambos tienen átomos de nitrógeno en el anillo de cinco miembros? ¿Cual nitrógeno del anillo de cinco miembros de la histidina es más básico?

15

Un aminoácido reacciona con dos equivalentes del hidrato de ninhidrina, para dar el púrpura de Ruhemann, un producto azul-violeta. Esta reacción se emplea como ensayo para detectar la presencia de aminoácidos en una muestra desconocida.

O

O

OH

OH

O

O

O

OH2

O

O-

NH3+

R

+

O

R

H

CO2 OH2

O

O

N

O-

O

+ + +

ninhidrina

púrpura de Ruhemann. Si se conocen los valores exactos de pKa para los sitios ácidos de un aminoácido, se puede calcular los porcentajes de las formas protonadas, neutra y desprotonadas en una solución a un pH dado utilizando la estuación de Henderson-Hasselbalch:

pH – pKa = log [A-]

[HA]

pH = pKa + log [A-] [HA]

Para ver como se utiliza la ecuación de Henderson-Hasselbalch, encontremos las especies que están presentes en una solución 1M de alanina a pH= 9.00. de acuerdo a los valores antes mencionados, la alanina protonada tiene un pKa1 de 2.34, y la alanina neutra tiene un pKa2 de 9.69:

16

CH3 O-CH3OH

ONH3+ ONH3

+

+OH2 OH3

O

O-

NH3

CH3

+O

O-

NH2

CH3

OH2OH3

+

+ + pKa1= 2.34

+ + pKa2= 9.69

Como el pH de nuestra solución está mucho más cerca del pKa2 que del pKa1, necesitamos usar pKa2 para nuestros cálculos. De acuerdo a la ecuación de Henderson-Hasselbalch, tenemos:

log [A-] = pH – pKa = 9.0 – 9.69 = - 0.69 [HA] De tal modo que [A-] = antilog (-0.69) = 0.20 [HA] Además, sabemos que: [A-] + [HA] = 100% (1.0 M) [HA]= 83% y [A-] = 17% Se pueden efectuar cálculos similares a otro pH, con lo que se llega a la curva de titulación siguiente:

Problema 10. La Treonina tiene un pKa1 = 2.1 y un pKa2 = 9.1. Utilice la ecuación de Henderson-Hasselbalch para calcular la proporción de formas protonadas y desprotonadas a pH= 1.5 y pH = 10.0.

17

SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS.

1. Síntesis de Strecker.

aldehído α-aminonitrilo α-aminoácido

O

H NH2

O

OH

NH2

C N

NH4Cl / KCN

H2O

H3O+

Fenilacetaldehído α-aminonitrilo (R,S)-fenilalanina (53%) Problema 11. El aminoácido poco común conocido como L-Dopa (3,4-dihidroxifenilalanina) es un fármaco útil contra el mal de Parkinson. Indique cómo podría sintetizarse a partir de 3,4-dihidroxifenilacetaldehído. 2. Aminación de ácidos α-halogenados. Uno de los métodos más antiguos comienza con la α-bromación de un ácido carboxílico por tratamiento con Br2 y PBr3 (La reacción de Hell-Volhard-Zelinsky). La sustitución del α-bromo ácido con amoniaco produce un α-aminoácido.

(R,S)-leucina 45%

Ácido 2-bromo-4-metilpentanóico

Ácido 4-metilpentanóico

Problema 12. Indique como podrían obtenerse los siguientes aminoácidos a partir de los ácidos carboxílicos apropiados:

(a) Valina (b) Fenilalanina (c) Alanina (d) Serina

18

3. Síntesis de Gabriel. Glicina

Cloroacetato de etilo Ftalimida potásica

Ácido ftálico Glicina (85%)

Fenilalanina

O

O O

O

CH3

CH3

Br Br

CCl4

O

O O

O

CH3

CH3

Br

N-

O

O

K+

N

O

O

CH

CO2C2H5

CO2C2H5

N

O

O

C

(CO2C2H5)2

1) NaOEt / EtOH

2) C6H5CH2Cl

H3O+

calor

malonato de dietilo

DMF

N

O

O

CH

O

OH

KOH / H2O

o NH2NH2

O

NH2

OH

Fenilalanina Ácido Glutámico

19

N

O

O

CH

CO2C2H5

CO2C2H5

N

O

O

C

(CO2C2H5)2

CH2CH2CO2C2H51) NaOEt / EtOH

2) CH2=CHCO2C2H5

H3O+

calor

N

O

O

CH

CH2CH2CO2C2H5

O

OH

KOH / H2O

o NH2NH2

OO

OH

NH2

OH

4. Síntesis del amidomalonato

3 EtOH + CO2 + CH3COOH

Ácido (R,S)-aspártico (55%)

Acetamidomalonato de dietilo

Problema 13. Indique los halogenuros de alquilo necesarios para producir los siguientes α-aminoácidos por el método de síntesis amidomalónica. (a) leucina (b) Histidina (c) Triptofano (d) Metionina Problema 14. La serina puede sintetizarse por una simple variación del método amidomalónico utilizando formaldehído en vez de halogenuro de alquilo. ¿Cómo podría lograrse esto? 5. Aminación reductiva de α-cetoácidos: Biosíntesis.

O

OH

O

O

OHL-glutamato

deshidrogenasa

OO

OH

NH2

OH+

Ácido-α-cetoglutárico.Ácido glutámico

NH3

NADH

CH3

O

OH

O O

OHNH2

CH3NH3

NaBH4 20

Ácido pirúvico (R,S)-Alanina Problema 15. Proponga una síntesis para cada uno de los siguientes aminoácidos partiendo del malonato de dietilo: Valina, Metionina y ácido aspártico. Problema 16. La prolina puede prepararse por una secuencia que utiliza ftalimida, malonato de dietilo y 1,3-dibromopropano. Indique los pasos de esta síntesis.

Síntesis Enantioselectiva de aminoácidos. La síntesis de α-aminoácidos a partir de un precursor aquiral por cualquiera de los métodos descritos produce una mezcla racémica (una mezcla racémica en partes iguales de enantiómeros R y S). Existen dos métodos para obtener aminoácidos enantoméricamente puros. Una manera consiste en resolver la mezcla racémica en sus enantiómeros puros. Sin embargo un método mejor consiste en usar una síntesis enantioselectiva para preparar directamente sólo el enantiómero S deseado. Resolución de aminoácidos R, S. La resolución puede hacerse al convertir el aminoácido en su amida y permitiendo que el aminoácido racémico intervenga en una reacción ácido-base con un solo enantiómero de una amina quiral. Se forman dos sales diasteroméricas que luego se separan y se vuelven a convertir en el aminoácido por hidrólisis del grupo amida.

Mezcla de sales diasteroméricas

Mezcla de enantiómeros de

aminoácidos

Mezcla de enantiómeros de

aminoácidos

Las enzimas catalizan selectivamente la hidrólisis de amidas formadas de L-aminoácidos (S).

21

Aminoácido RAminoácido SMezcla de

enantiómeros de aminoácidos

Mezcla de enantiómeros de

aminoácidos

Se utiliza una aminoacilasa obtenida de riñon de cerdo. Síntesis enantioselectiva de aminoácidos. Se utiliza un catalizador en una reacción quiral que contenga temporalmente una molécula de sustrato en un ambiente asimétrico. Mientras se encuentra en este ambiente, el sustrato puede estar más abierto a reaccionar de un lado que en el otro, lo que lleva a un exceso del producto enantiomérico sobre el otro. William Knowles descubrió hace algunos años que los α-aminoácidos pueden prepararse enantioselectivamente mediante la hidrogenación de un ácido Z enamido con un catalizador de hidrogenación quiral. Ácido Z enamido S-fenilalanina 98.7% El catalizador más efectivo para la síntesis enantioselectiva son los complejos de coordinación de Rodio (I) con ciclooctadieno (COD) y una difosfina quiral como el (R,R)-1,2-bis(o-anisilfenilfosfonio)etano, el llamado ligando DiPAMP.

22

PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS. Las proteínas y los péptidos son polímeros de aminoácidos en los cuales las unidades individuales de aminoácidos, llamados residuos, están unidas mediante enlaces amida, o uniones peptídicas.

Alanina (Ala)

Alanilserina (Ala-Ser) Serina (Ser)

Aminoácido N terminal Aminoácido C terminal La larga secuencia repetida de enlaces peptídicos forman una cadena, la estructura primaria o esqueleto de las proteínas. Por convencion siempre se escriben los péptidos con el aminoácido N-terminal a la izquierda y el aminoácido C-terminal a la derecha. El nombre del péptido se indica utilizando las abreviaturas para cada aminoácido.

23

Bradiquinina

H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH

R-P-P-G-F-S-P-F-R Problema 17. Nombre los seis posibles tripéptidos isoméricos con valina, tirosina y glicina. Utilice la notación corta de tres letras para cada aminoácido. Problema 18. Trace la estructura completa de H-Met-Pro-Val-Gli-His-OH

ENLACE COVALENTE EN LOS PÉPTIDOS. Consecuencias de la resonancia:

• Estabilidad del enlace • Menor basicidad del átomo de nitrógeno • Rotación restringida del enlace C-N (carácter de doble enlace)

Configuración Trans.

24

En los péptidos se encuentra un segundo tipo de uniones covalentes cuando se forma un enlace disulfuro RS-SR entre dos redisuos de Cisterna. El enlace disulfuro se forma con facilidad por medio de la oxidación suave de los tioles RSH y se rompen con facilidad mediante una reducción suave.

Císteina

Oxidación moderada

Cistina Oxidación moderada de tioles con Bromo.

R SHOH -

OH2

R S- Br Br R SBr

RS-

RS

SR

Los enlaces disulfuro contribuyen a la forma (estructura) de un polipéptido.

Oxitocina

25

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LOS PÉPTIDO: ANÁLISIS DE LOS AMINOÁCIDOS

¿Cuáles aminoácidos están presentes? ¿Cuántos hay de cada uno? ¿Cuál es la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica? Las respuestas a las dos primeras preguntas se obtienen con un Analizador de aminoácidos. William Stein y Standford Moore.

Mezcla equimolecular Estándar de 17 α-

aminoácidos.

26

DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE UN PÉPTIDO. 1.- Hidrólisis de los enlaces disulfuro RS-SR con ácido perfórmico. 2.- Hidrólisis del péptido con HCl 6M por 24 horas. 3.- Analizador de aminoácidos.

2-mercaptoetanol Ácido iodoacético

27

Ácido cisteico

Ácido cisteico

DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS EN PÉPTIDOS:

DETERMINACIÓN DE RESIDUOS N-TERMINALES.

DEGRADACIÓN DE EDMAN. Isocianato de fenilo Reactivo de Edman

péptido sin el amino ácido N-terminal original

derivado de tiazolinona

28

La transposición de la anilinotiazolinona en medio ácido acuoso produce el derivado final N-feniltiohidantoina (PTH). PTH se identifica por

cromatografía Los péptidos de cadena acortada se vuelven a someter en forma automática a otro ciclo de la Degradación de Edman. La determinación de la secuencia completa de proteínas por este método es poco práctica a causa de la formación de subproductos indeseables que limita el método a un máximo de 50 ciclos.

MÉTODO DE SANGER

N-aminoácidos

2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB)

polipéptido

Polipéptido marcado

29

Mezcla de resto de

aminoácidos Aminoácido N-terminal

marcado. Separado e identificado

El método de Sanger no es tan utilizado como el de Edman. Dadas las limitaciones de los métodos de Edman y Sanger; primero se rompe una cadena peptídica larga por medio de una hidrólisis parcial en varios fragmentos más pequeños, se determina la secuencia de cada fragmento y éstos se ajustan haciendo coincidir los extremos que se traslapan.

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICAS. Enzima Especificidad Tripsina hidrólisis carboxilo de aminoácidos básicos: Arginina y Lisina. Quimiotripsina hidrólisis carboxilo de aminoácidos arilo: Fenilalanina, Tirosina y Triptofano. Elastasa hidrólisis carboxilo de aminoácidos pequeños: Glicina y alanina. Carboxipeptidasa A Remueve el aminoácido C-terminal Carboxipeptidasa B Remueve los aminoácidos C-terminal Arginina y Lisina solamente.

Val – Phe – Leu – Met – Tyr – Pro – Gly – Trp – Cys – Glu – Asp – Ile – Lys – Ser – Arg – His

Quimiotripsina rompe estos enlaces Tripsina rompe estos enlaces.

HIDRÓLISIS PARCIAL 1. Un análisis de los aminoácidos de la angiotensina II revelaría la presencia de ocho aminoácidos

diferentes: Arg, Asp, His, Ile, Fen, Pro, Tir y Val en cantidades equimoleculares. 2. Un análisis de extremos N-terminales por el método de Edman indicaría que la angiotensina II

tiene un residuo de ácido aspártico en el extremo N-terminal. 3. La hidrólisis parcial de la angiotensina II con ácido clorhídrico diluido produciría los siguientes

fragmentos, cuya secuencia puede ser determinada por Degradación de Edman:

a. H-Asp-Arg-Val-OH b. H-Ile-His-Pro-OH c. H-Arg-Val-Tir-OH d. H-Pro-Fen-OH e. H-Val-Tir-Ile-OH

30

4. Traslapando las regiones que se superponen de los fragmentos se obtiene la secuencia completa de

aminoácidos en la angiotensina II:

a. H-Asp-Arg-Val-OH c. H-Arg-Val-Tir-OH e. H-Val-Tir-Ile-OH b. H-Ile-His-Pro-OH d. H-Pro-Fen-OH

H-Asp-Arg-Val-Tir-Ile-His-Pro-Fen-OH Problema 19. ¿Cual es la estructura de un pentapéptido que da los siguientes tripéptidos cuando se hidroliza parcialmente?

Gli-glu-arg, glu-arg-gli, arg-gli-fen Problema 20. ¿Qué fragmentos resultarían si se rompiera la Angiotensina II con tripsina en un caso, y con quimiotripsina en otro?. Problema 21. Dibuje la estructura del derivado PTH que se puede formar por la degradación de Edman de la Angiotensina II. Problema 22. Indique la secuencia de los hexapéptidos que producen los siguientes fragmentos por hidrólisis parcial con ácido:

(a) Arg,Gli,Ile,Leu,Pro,Val forman H-Pro-Leu-Gli-OH, H-Arg-Pro-OH, H-Gli-Ile-Val-OH (b) Asp,Leu,Met,Trp, Val2 forman H-Val-Leu-OH, H-Val-Met-Trp-OH, H-Trp-Asp-Val-OH

DETERMINACIÓN DE RESIDUOS C-TERMINALES.

carboxipeptidasa

31

Problema 23. Se encuentra que un hexapéptido con la composición Arg, Gli, Leu, Pro tiene prolina en los extremos C y N. La hidrólisis parcial produce los siguientes fragmentos:

H-Gli-Pro-Arg-OH H-Arg-Pro-OH H-Pro-Leu-Gli-OH

roblema 2 eu, la, y Fen p

l bromuro de cianógeno hidroliza el enlace peptídico de la Metionina.

H – Ala – Lys – Phe – Asp – Met – Val – Arg – Trp – OH

Mecanismo de la hidrólisis del enlace

¿Cuál es la estructura del hexapéptido? P 4. Proponga dos estructuras para un tripéptido que por hidrólisis se descompone en L

ero que no reacciona con carboxipeptidasa ni con fenilisotiocianato. A E

BrCN rompe este enlace.

peptídico por bromuro de cianógeno.

32

SÍNTESIS DE PÉPTIDOS. Aunque las amidas simples suelen formarse por la reacción entre aminas y cloruros de ácidos, la síntesis de los péptidos es más difícil porque se deben de formar muchos enlaces amida diferentes en orden específico y no aleatoriamente. 2 sitios de unión + 2 sitios de unión = 4 productos distintos.

La solución al problema de la especificidad es la protección.

33

Protección

NH2

1. Formación de la amida 2. Desprotección

Alanina

Protección

COOH

O

OR

O

OCl

OCH3

R

O CH3 CH3 OCH3

CH3CH3

O CH3 CH3

3O O O

CH

OCH3

CNR

O CH3

OCH3

CNCl

O CH3

O O

Leucina

GRUPOS PROTECTORES EN L ÍNTESIS DE PÉPTIDOS. Nombre Abreviatura Reactivo Eliminación Grupos Protectores de aminas.

enciloxicarbonilo Z- , CBZ- H2 / Pd-C HBr, HF, HCl

rt-Butoxicarbonilo Boc- CF COOH H gas

BF3 / Et2O / THF

iano-t-butoxicarbonilo Cyoc- NaOH / THF

A S

Estructura

B te 3

Cl C

34

9

S

O

R

O

CH3 S

O

O

CH3Cl

-Fluorenilmetoxicarbonil Fmoc- Piperidina

-Toluensulfonilo Tos- Na / NH3

rupos protectores de ácid

X H3O

reparación de Carbamatos para protección del grupo amino.

p G os carboxílicos. Ester RO- ROH / H+ H2O / NaOH

+ - + R3O P

carbamato

O

+

O

OO

O

NH

O

O

CH3

O

NH2

OH

NHO

OCl

O

OO

OH

NHOH

NH2- HCl

O+

el Cl2C=O y C6H5CH2OH Glicina Glicina-CBZ d

OO

OCl CH3

ZBC OHNH

O

+ - HClZBC

O

ONH

O

CH3

grupo éster activado

Glicina protegida Cloroformiato de etilo

35

fenilalanina

Gly-Phe con el grupo amino protegido

liminación del grupo protector carbamato

E

O

OO

NH

NH

O

OHH2, Pd / C CH3

CO2O

NH

NH2

O

OH

r-butoxicarbonilamida (BOC)

Fluorenilmetoxcarbonilamida

te Alanina dicarbonato de di-ter-butilo BOC-Ala

cloroformiato de

9-fluorenilmetilo aminoácido. (cadena lateral protegida si es necesario)

aminoácido- FMoc protegido (estable en ácidos)

36

(Grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo)

Desprotección. (ruptura del grupo FMoc)

producto

secundario piperidina

aminoácido libre Protección del grupo carboxilo de un aminoácido por formación de un éster.

FORMACIÓN DEL ENLAC PEPTÍDICO.

Leucinato de metilo

Leucina Leucina

Leucinato de bencilo

Cloroformiato de bencilo

37

Anhídrido mixto de Ala-CBZ

L COOH).

) Carbonildiimidazol (CDI)

EL USO DE AGENTES ACOPLANTES (ACTIVANTES DE a

O

OH

NH-protegido

R

++

calor

N N NN

O CO2

N NH

O

O

NH2

R1

CH3

O

NH

NH-protegido

R O

O

R1

CH3 b) Diciclohexilcarbodiimida (DCC)

+ +calor

N C NNH

CNH

O

O

O

NH2

R1

CH3

O

OH

NH-protegido

O

NH

NH-protegido

R O

O

R1

R

CH3

38

c) N-(3-dimetilaminopropil)-N´-etilcarbodiimida. (EDCI ó EDAC)

++calor

N

N C

CH3

N

CH3

CH3

N NHC

CH3

NHCH3

CH3

O

O

OH

NH-protegido

R

O

O

NH2

R1

CH3

O

NH

NH-protegido

R O

O

R1

CH3

d) Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-oxi)tripirrolidinfosfonio. (PyBOP)

O

OH

R

NHprotegido

+

calor

N

N

N

O

P+

N

NN

P-

F

FF

FF

F

O

O

R

NH2CH3

O

NHR

NHprotegido

O

O

R

CH3

Resumen de 5 pasos para la síntesis de H-Ala-Leu-OH

. Proteger el grupo amino de la leucina como su derivado BOC

OC-Ala-OH

2. Proteger el grupo carbonilo de la leucina como su éster metílico

1

H-Ala-OH + bicarbonato de di-tert-butilo B

39

40

H-Leu-OH + CH3OH H-Leu-OCH3 3. Acoplar los dos aminoácidos protegidos usando DCC

BOC-Ala-OH + H-Leu-OCH3 BOC-Ala-Leu-OCH3 4. Retirar el grupo protector BOC por tratamiento ácido

BOC-Ala-Leu-OCH3 + CF3COOH H-Ala-Leu-OCH3 5. Retirar el éster metílico por hidrólisis básica:

H-Ala-Leu-OCH3 + NaOH / H2O H-Ala-Leu-OH

roblema 25. Indique el mecanismo de la formación de un derivado BOC para la reacción de Tirosina

Problema de lanina y leucina.

roblema 27. ¿Cómo podrían prepararse los siguientes tripéptidos?

(a) H-Leu-Ala-Gli-OH

(c) H-Ala-Gli-Leu-OH

Pcon bicarbonato de di-ter-butilo.

26. Escriba los cinco pasos que se requieren para la síntesis de H-Leu-Ala-OH a partir a

P

(b) H-Gli-Leu-Ala-OH

cadena A 21 aminoácidos

cadena B 30 aminoácidos

insulina

La ina r dos cadenas que suman un total de 51 aminoácidos unidos pos dos puentes disulfuro. Frederick Sanger determinó su estructura y recibió el premio Nobel en Química en

958 por su trabajo.

SÍNTESIS DE PÉPTIDOS AUTOMATIZADA: TÉCNICA DE FASE SÓLIDA DE MERREFIELD.

La síntesis de péptidos se efectúa sobre esferas sólidas de poliestireno, preparado de un modo tal que por cada 100 anillos de benceno uno lleve un grupo clorometilo:

insul esta compuesta po

1

CH

CH3

CH3

CH2 HC CH2 CH CH2 CH CH2 CH

CH3

CH3

Cl Cl

Síntesis de un tripéptido utilizando la Fase sólida de Merrifield.

Aminoácido N-protegido

41

2 Aminoácido N-protegido 2 Aminoácido N-protegido y COOH activado

Dipéptido

protegido

Dipéptido-Resina

3 Aminoácido

N-protegido y COOH

activado

3 Aminoácido N-protegido

Tripéptido protegido

42

Tripéptido-Resina

Tripéptido libre polímero

Problerande. La preparación de un decapéptido puede implicar de 30 a 40 reacciones químicas. Suponiendo ue cada paso pueda realizar to del 90%, calcule el rendimiento global de una cuencia de 40 pasos.

PROTEÍNAS.

Estructura primaria y secundaria Estructura terciari Clasificación y funciones de proteínas Enzimas Desnaturalización de proteínas

ESTRUCTURA PRIMARIA.

e refiere a la secuencia en la que están unidos los aminoácidos.

ma 28. La importancia del rendimiento en cada paso de la síntesis de un péptido es muy gq se con un rendimiense

a y cuaternaria

S

43

Estructura primaria de la bradiquinina:

ly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH

OXITOCINA

VASOPRESINA

H-Arg-Pro-Pro-G

44

ESTRUCTRURA SECUNDARIA.

s la orientación relativa de los átomos del esqueleto” (backbone): átomos que forman en nlace peptídico.

epende de: La región planar en cada enlace peptídico. La formación de puentes de hidrógeno. Separación adecuada de grupos R (cadenas

laterales de los aminoácidos)

HELICE ALFA α

ada oxígeno está unido con un puente de hidrógeno al amino ácido del siguiente giro de la hélice. (Prolina rompe las hélices alfa)

E“e D•••

C

45

Vista lateral vista superior

ada carbonilo en un enlace peptídico está unido con un puente de hidrógeno al grupo H-N de un mino ácido de una cadena adyacente.

HOJA PLEGADA (LÁMINA) BETA β

Ca

46

Dos o más cadenas peptídicas pueden alinearse formando la lámina

rientación de los puentes de hidrógeno en las láminas Beta β

O

47

Tipos de Laminas Beta β

ESTRUCTURA TERCIARIA.

48

Describe el enrollamiento de toda la proteína en una forma tridimensional (3D).

Factores que determinan la estructura terciaria:

• Interacciones hidrófobos de las cadenas laterales. • Puentes disulfuro. • Puentes de hidrógeno. • Grupos prostéticos.

Puede haber combinaciones de Hélices α y láminas β.

ESTRUCTURA CUATERNARIA.

49

Describe como se unen las moléculas de proteínas diferentes en grandes estructuras agregadas.

CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS (COMPOSICIÓN) • Proteínas simples

– Constituidas únicamente por amino ácidos • Proteínas conjugadas

Constituidas por amino ácidos y otros compuestos. – Glicoproteínas (carbohidratos) – Lipopoproteínas (grasas) – Nucleoproteínas (ácido ribonucleico) – Fosfoproteínas (ésteres de fosfato) – Metaloproteínas (hierro)

PROTEÍNAS CONJUGADAS:

• Globulina (glicoproteína) • Interferón (glicoproteína) • Caseína (fosfoproteína) • Ferritina (metaloproteína) • Hemoglobina (metaloproteína)

CLASES CONFORMACIONALES DE PROTÉINAS.

50

• Proteínas fibrosas (insolubles)

– Colágeno: tejido conectivo, tendones – Queratina: cabello, uñas, piel – Elastina: tejido conectivo elástico

• Proteínas globulares (solubles) – Insulina: hormona reguladora del metabolismo de la glucosa – Mioglobina: transporte de oxígeno – Ribonucleasa: controla la síntesis del RNA

ALGUNAS FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LAS PROTEÍNAS.

• Enzimas (catalizadores biológicos) • Hormonas (insulina) • Proteínas protectoras (anticuerpos) • Proteínas de almacenamiento (caseína) • Proteínas estructurales (queratina, elastina) • Proteínas de transporte (hemoglobina)

ENZIMAS.

• Casi todas son globulares • Algunas son conjugadas:

– La parte no proteica se llama cofactor – La parte proteica se llama apoenzima – Cofactor + apoenzima = holoenzima

• Son específicas

Posible mecanismo de acción de la quimiotripsina.

51

Posible mecanismo de acción de la tripsina.

52

DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS.

53

Es la alteración de la estructura terciaria. La estructura primaria no se altera.

ESTRUCTURAS DE PROTEÍNAS EN INTERNET.

Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/

54

Problema 29. se cree que la descarboxilación de los α-cetoácidos catalizada por tiamina se inicia con la eliminación de un átomo de hidrógeno ácido del anillo de tiazol de la tiamina.

N+

S

CH3

H

CH3

CH3

N+

C- S

CH3CH3

CH3

H++

a. ¿Por qué es ácido este hidrógeno?

N+

S

CH3CH3

CH3

CCH3

OHH

b. Proponga un mecanismo para la descarboxilación del ácido pirúvico (CH3COCO2H) mediante tiamina. Se sabe que el intermedio final es la especie A.

A = La vitamina ácido lipoico es una coenzima en la conversión de A y CoA en acetil coenzima A. indique de que manera el intermedio A puede justificar la formación de acetil coenzima A a partir del piruvato inicial.

S

S

(CH2)4 CO2H

55