Aminoácidos, péptidos e...
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Aminoácidos, péptidos e proteínas
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Aminoácidos, péptidos e proteínas
Algumas funções de proteínas:
Luciferina e luciferase Hemoglobina Queratina
Funções das proteínas
1.Catálise enzimática
2.Transporte e armazenamento
3.Movimento coordenado
4.Suporte mecânico
5.Protecção imune
6.Geração e transmissão de impulsos nervosos
7.Controlo do crescimento e diferenciação
Estrutura geral de um aminoácido como ião dipolar
Convenção: Código de 3 letras : as três primeiras letras do nome Código com uma letra: Margaret Dayhoff (1925 – 1983) diminuir o tamanho dos ficheiros. CHIMSV – 6 aa – a 1ª letra do nome (é única) ex. cisteína, histidina AGLPT – 5 aa – a 1ª letra (não é única) dos aa mais comuns . Ex.leucina é mais comum que lisina.
RFYW – 4 aa – sugerido fonéticamente Ex. aRginine, tYrosine DNEQ -4 aa – letras sugeridas pelos nomes Ex. asparDic, asparagiNe K – lisina - sobravam poucas letras e era a letra mais perto do L
As proteínas são constituídas apenas por L-aminoácidos
Relação estérea dos estereoisómeros da alanina com a configuração absoluta do L- e D- gliceraldeído
Os aminoácidos podem ser classificados com base nas propriedades do grupo R
Grupos R alifáticos, não polares
Glicina Alanina Prolina Valina
Leucina Isoleucina Metionina
Grupos R aromáticos
Fenilalanina
Tirosina
Triptofano
Grupos R sem carga, polares
Serina Treonina Cisteína
Asparagina Glutamina
Cisteína
Cisteína
Cistina
Grupos R carregados positivamente
Lisina
Arginina Histidina
Grupos R carregados negativamente
Aspartato
Glutamato
Aminoácidos não comuns também têm papéis importantes
Paredes celulares de plantas Colagéneo
4 - Hidroxiprolina
Colagéneo
5 - Hidroxilisina
Miosina – proteína contráctil do músculo
6 – N - Metillisina
Protrombina – proteína envolvida na coagulação do sangue Outras proteínas que se ligam ao Ca
γ - Carboxiglutamato
Alguns resíduos de aa podem ser modificados transientemente (adição de grupos fosforil, metil, acetil, etc) – modificações regulatórias Ornitina e citrulina – aa envolvidos na biossíntese de arginina e no ciclo da ureia.
O estado de ionização de um aminoácido depende do pH Os aminoácidos podem funcionar como ácidos ou bases fracos
Forma não iónica Forma zwiteriónica
Titulação de um
aminoácido
Efeito do ambiente químico sobre o pka
Curva de titulação do glutamato
Curva de titulação da histidina
Sumário: •Os 20 aa têm um grupo α-carboxílico e um grupo α-amino. O C α é assimétrico. Nas proteínas apenas há L- aa.
• Outros aa menos comuns, existem quer nas proteínas (após modificação) ou como metabolitos livres
•Os aa são classificados em 5 grupos com base na sua polaridade e carga (a pH 7) do seu grupo R.
•Os aa variam nas suas propriedades ácido-base e têm curvas de titulação características.
Péptidos e Proteínas
A ligação peptídica
Ligação peptídica
Ligação peptídica
dipéptido
dipéptido
tripéptido
tetrapéptido
pentapéptido
...
oligopéptido...polipéptido
MM‹10 000 Da
Um pentapéptido
Terminal N ou amina
Terminal C ou
carboxilo
Ser–Gly–Tyr–Ala–Leu serilgliciltirosilalanileucine
SGYAL
Estrutura predominante do tetrapéptido alanilglutamilglicillisina a pH7 Carga global 0 pI = 7 Ponto isoelétrico de uma proteína – pH ao qual a carga global é zero
Péptidos com importância biológica
L-aspartil-L-fenilalanina metiléster
adoçante
Piroglutamato
Histidina
Prolilamida
piroGlu-His-Pro-NH2
TRH - hormona de libertação da
tirotropina
hormona
Piroglutamato
Histidina
Prolilamida
piroGlu-His-Pro-NH2
TRH - hormona de libertação da
tirotropina
hormona
forma-se no hipotálamo a partir de
Glu-His-Pro
Oxitocina (9 res) – pituitária; estimula as contracções uterinas Bradicinina (9 res) – inibição da inflamação de tecidos Vasopressina – aumento a tensão arterial Insulina (2 cadeias com 30 res) – reduz a glucose no sangue promovendo a sua entrada nas células.
Outras hormonas que são péptidos
Amanitina
Venenos
Antibióticos
Amanitin is
the most
powerful
poison ...
gramicidinas, polimixinas, bacitracinas, glicopéptidos, etc
Massa Molecular de algumas proteínas
MM nº res nºcadeias
Nº aproximado de aa de uma proteína = MM/110
Proteínas constituídas por uma cadeia polipeptídica Proteínas multiméricas – dois
ou mais polipéptidos iguais ou diferentes, associados não covalentemente. As subunidades idênticas chamam-se protómeros. Ex. hemoglobina
Algumas proteínas têm duas cadeias polipeptídicas ligadas covalentemente Ex.insulina bovina
Composição em aminoácidos de duas proteínas
Cálculo do nº de aminoácidos de uma proteína
Massa molecular média dos aminoácidos = 138
Média ponderada dos aminoácidos mais frequentes = 128
Eliminação de uma molécula de água por ligação peptídica 128 – 18 = 110
Massa molecular média de um resíduo de aa numa proteína
110
Massa molecular da proteína / 110 = nº de aa de uma proteína
Proteínas
“Simples”
Conjugadas
Grupo prostético
Lipoproteína Lípido Β1-lipoproteína sangue
Glicoproteína glúcido Imunoglobulina G
Fosfoproteína fosfato Caseína do leite
Hemoproteína Hemo (Fe
porfirinico) Hemoglobina
Metaloproteína Fe Ferritina
“ Zn Alcooldesidrogenase
“ Ca Calmodulina
“ Mo Dinitrogenase
Flavoproteína FAD Succinato desidrogenase
Proteína conjugada g.prostético exemplo
Proteínas em solução
Interacções electrostáticas
entre macroiões
Variação da solubilidade de proteínas com o pH e força
iónica
I = ½ ∑ MiZi 2
Salting in – Aumentando a concentração de sal, a
solubilidade de uma proteína aumenta.
Salting out – A concentrações salinas muito elevadas, a
solubilidade das proteínas diminui.
Células e tecidos usados em estudos bioquímicos E.coli, S.cerevisiae, chlamydomonas, folha de espinafre, fígado de rato, músculo esquelético Fonte homogénea e grande quantidade: culturas de microrganismos, tecidos, mutantes genéticos. Alguns materiais são ricos num componente específico: Músculo esquelético – actina e miosina Células do pâncreas – RER Células espermáticas – DNA Células do fígado – enzimas das vias biosintéticas Folhas de espinafre, eritrócitos, vírus, …
As proteínas podem ser separadas e purificadas
Tecido ou células ↓ lise
Extracto bruto ↓Fraccionamento subcelular
Extracto ↓ Fraccionamento de proteínas ↓ Proteína em estudo
As proteínas podem ser separadas e purificadas Solubilidade – “Salting out” Tamanho – Diálise, cromatografia de exclusão molecular Carga – Cromatografia de troca iónica Afinidade – Cromatografia de afinidade
Diálise
proteínas
reservatório
Fase móvel (amostra
de proteínas)
Fase estacionária
(matriz porosa)
suporte
poroso
efluente
Cromatografia em coluna
Carga + +
Carga +
Carga-
Carga- -
Partículas poliméricas
com grupos funcionais
negativos
As proteínas movem-se através da
coluna a velocidades dependentes da
carga e do pH usado
Cromatografia de troca
iónica (catiónica)
Explora
diferenças de
sinal e
intensidade
de carga
eléctrica de
proteínas a
um
determinado
pH
Questão:
Um biólogo pretende separar dois péptidos por cromatografia de troca iónica. Ao pH da fase móvel a usar na coluna, um péptido (A) tem uma carga global de -3, devido à presença de mais resíduos Glu e Asp do que Arg, Lys e His. O péptido B tem uma carga global de +1. • Qual dos péptidos seria primeiro eluído de uma resina de troca catiónica?
• Qual seria eluído primeiro de uma resina de troca aniónica?
Partículas
poliméricas
porosas
As moléculas de
proteína separam-se por
tamanho; as maiores
saiem (eluem) primeiro
Cromatografia por
exclusão ou filtração
gel
Proteína X
ligando
Amostra inicial
(mistura de
proteínas)
Mistura de proteínas é adicionada
à coluna contendo um polímero
com um ligando específico para a
proteína X
Proteínas diferentes de X são
retiradas por lavagem da
coluna
Proteina X é eluida
por solução de
ligando
Solução
do ligando
Cromatografia de
afinidade
Exemplo de tabela de purificação do enzima X
Vol. Prot. Activ.
Passo fracção(ml) total(mg) Activ. espec.
1. extracto cru
1 400 10 000 100 000 10
2. prec. c/ sulf. am. 280 3000 96 000 32
3. crom. troca ion. 90 400 80 000 200
4. filtração gel 80 100 60 000 600
5. crom. afinidade 6 3 45 000 15 000
Actividade vs actividade específica
Os dois copos contêm a mesma actividade da proteína. O segundo tem uma actividade específica mais elevada
electroforese
poço
direcção
da
migração
Amostras
diferentes
em cada
poço
Gel de
poliacrilamida
1 2 3 4 5 6
Purificação de RNA polimerase
de E.coli
Determinação do peso molecular de uma proteína
Isoelectrofocagem: separa proteínas conforme o pI
Pontos isoeléctricos de algumas
proteínas
Electroforese a duas dimensões: combinação de isoelectrofocagem e electroforese em acrilamida
Níveis de estrutura na proteína
primário
secundário
terciário
quaternário
Estrutura covalente das proteínas A purificação de uma proteína é o principio…
A função de uma proteína depende da sua sequência de aminoácidos • Proteínas com diferentes funções têm diferentes composições em aa.
• Doenças genéticas humanas envolvendo alterações em aa, têm na origem proteínas com funções alteradas.
• Proteínas com funções semelhantes em espécies diferentes, têm sequências de aa semelhantes (ex. a ubiquitina). Polimorfismo.
A sequência de aminoácidos de uma proteína é invariante?
20-30% das proteínas no homem são polimórficas (variantes) Como determinar a sequência ?
Sequência de aminoácidos da insulina bovina – a 1ª proteína a ser sequenciada
Determinação da sequência em aminoácidos de uma proteína
(estrutura primária)
1.Determinação da composição em aminoácidos:
Proteína completamente hidrolisada (110 0 C, 24h em HCl 6N). Aa separados e quantificados por cromatografia de troca iónica
2. Identificação do aminoácido N – terminal Método de Sanger (FDNB) Degradação de Edman (fenilisotiocianato)
polipéptido
Reagente
de Sanger
2,4-
dinitrofenil
deriv. do
polipép.
2,4-dinitrofenil
deriv. do res N
terminal
Mistura dos restantes aa
(inutil para prosseguir)
Sequenciação de um
polipéptido polipéptido
Reagente
de Sanger
2,4-
dinitrofenil
deriv. do
polipép.
2,4-dinitrofenil
deriv. do res N
terminal
Mistura dos restantes aa
(inutil para prosseguir)
Apenas permite identificar aa do terminal
N
Sequenciação de um
polipéptido polipéptido
Reagente
de Sanger
2,4-
dinitrofenil
deriv. do
polipép.
2,4-dinitrofenil
deriv. do res N
terminal
Mistura dos restantes aa
(inutil para prosseguir)
PTIC
feniltio
isocia
nato
Reagente
de Edman
aducto
PTC
Polipéptido com n-1
resíduos que reage
de novo com PTIC
Identificação do aa
N terminal
cloreto de dabsilo
cloreto de dansilo
3. Cisão das pontes dissulfureto As ligações dissulfureto interferem com o procedimento de sequenciação. Oxidação pelo ácido perfórmico Redução pelo ditiotreitol(DTT) ou β-mercaptoetanol
lig.persulfureto
Ditiotreitol
(DTT)
2 res. ácido
cisteico
oxidação ac.
perfórmico Redução por
DTT
acetilação por
iodoacetato
cisteínas
acetiladas
4. Fragmentação dos péptidos A cadeia polipéptica é fragmentada em segmentos mais pequenos que são depois separados por métodos cromatográficos ou electroforéticos
Especificidade de alguns métodos comuns de fragmentação de cadeias
polipeptídicas
reagente (fonte) ponto de clivagem
Tripsina (pâncreas bovino)
Submaxillarus protease (glândula submaxilar)
Quimotripsina (pâncreas bovino)
Protease V8 (Staphylococcus aureus)
Asp-N- protease (Psedomonas fragi)
Pepsina (estômago de porco)
Endoprotease Lys C (Lysobacter enzymogenes)
CNBr
5. Sequenciação dos péptidos Cada péptido é sequenciado pelo procedimento de Edman. 6. Ordenamento dos fragmentos do polipéptido inicial Utilizam-se outros enzimas ou químicos para reconstruir a sequência da proteína original
Sequenciação de uma proteína
7. Localização das ligações dissulfureto A proteína é hidrolisada com um enzima (ou químico) mas sem antes se terem cindido as ligações dissulfureto. Os péptidos são separados por electroforese e comparados com o conjunto de péptidos gerados pelo mesmo enzima (químico). Por cada ligação dissulfureto não aparecerão dois péptidos e será visível um péptido maior.
A sequência de aminoácidos pode ser deduzida por outros métodos
A sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína fornece informações sobre: • Estrutura tridimensional
•Função
•Localização celular
•Evolução
Níveis de estrutura na proteína
primário
secundário
terciário
quaternário
