Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados ...diferentes secuencias peptídicas....

Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de

Dermaseptina con actividad antileishmanial

CARLOS ANDRÉS RODRÍGUEZ VEGA

Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín Facultad de Ciencias Escuela de Química

Maestría en Ciencias Química Proyecto Bicentenario: Actividad citotóxica e inmunomoduladora de

péptidos sintéticos de origen natural - 20101007930 2011

Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de

Dermaseptina con actividad antileishmanial

CARLOS ANDRÉS RODRÍGUEZ VEGA

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Química

Directora:

PhD. BLANCA FABIOLA ESPEJO BENAVIDES

Grupo de Investigación:

Grupo Fisicoquímica Orgánica

Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín

Facultad de Ciencias

Escuela de Química

Maestría en Ciencias Química

Proyecto Bicentenario: Actividad citotóxica e inmunomoduladora de péptidos sintéticos de

origen natural - 20101007930

2011

Agradecimientos

A Dios, por todas las bendiciones y su compañía durante toda mi vida; por iluminar el camino y fortalecerme en aquellos momentos difíciles, poniendo en mi camino personas valiosas que me ayudaron a superar los obstáculos. A mi familia, especialmente a mi madre Rosana por sus sacrificios que hicieron posible que pudiera superarme cada día. A mis hermanos Ana M. y Rubén, los cuales fomentaron en mi el espíritu de superación. Agradezco sinceramente a la Doctora Blanca Fabiola Espejo Benavides, Directora de mi tesis de maestría, por su apoyo incondicional, confianza y enseñanza durante el desarrollo de mi tesis. Al grupo de investigación en inmunotoxicología (COL 0068495) de la Universidad Nacional de Colombia en Bogotá, bajo la dirección de la Doctora Gabriela Delgado por toda la colaboración brindada en los ensayos biológicos. Hago un agradecimiento especial a Julián Pérez Cordero por su colaboración y valiosa amistad. . A la Universidad Nacional de Colombia por permitir mi ingreso a los estudios de educación superior, acogiéndome con profesores de alto conocimiento y calidad humana. Un especial agradecimiento a la profesora y amiga Luz Mary Salazar Pulido por su apoyo y confianza en mi vida profesional y personal. A mis amigos Diana M. Arango, Ana Cristina Jaramillo, Pablo Andrés Ruiz, y Alejandro Chacón por todo su apoyo y colaboración. Y a todas aquellas personas que de una u otra forma participaron en la realización de esta investigación, hago un sincero agradecimiento.

Resumen y Abstract IV

Resumen

En este estudio se sintetizaron 11 péptidos con posible actividad biológica contra

Leishmania panamensis por medio de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), a

partir de aminoácidos N-Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) protegidos [1], purificados por

liofilización y cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC),

caracterizados por espectrometría de masas y dicroísmo circular (DC), lo cual permitió

establecer la estructura secundaria de carácter helical de los péptidos. Se encontró

actividad contra Leishmania panamensis, lo cual nos lleva al uso potencial como

compuesto activo para el tratamiento de la Leishmaniasis. La mejor acción biológica

contra el parasito se encontró para el péptido DM1, el cual fue capaz de inhibir el

crecimiento de promastigotes de L. panamensis a concentraciones de uso terapéutico,

causando porcentajes de hemólisis y de citotoxicidad relativamente bajos.

Palabras clave: Péptidos sintéticos, leishmaniasis, Leishmania panamensis, Fmoc.

Abstract

In this study we synthesized and evaluated 11 peptides with possible biological activity

against Leishmania panamensis by solid-phase peptide synthesis (SPPS), from amino

acids N-Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) protected [1], purified by lyophilization and

high performance liquid chromatography in reverse phase (RP-HPLC), characterized by

mass spectrometry and circular dichroism (CD), which allowed us to establish the

secondary structure of helical nature of the peptides. We found activity against

Leishmania panamensis, which leads to the potential use as active compound for the

treatment of leishmaniasis. The best biological action against the parasite was found for

the peptide called DM1, which was able to inhibit the growth of L. panamensis

promastigotes at concentrations of therapeutic use, causing hemolysis rates and

cytotoxicity of monocytes relatively low.

Keywords: Synthetic peptides, leishmaniasis, Leishmania panamensis, Fmoc.

Contenido V

Contenido

Pág.

Resumen ......................................................................................................................... IV

Lista de figuras .............................................................................................................. VII

Lista de tablas .............................................................................................................. VIII

Lista abreviaturas ........................................................................................................... IX

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Planteamiento del problema y justificación ........................................................... 3

2. Hipótesis ................................................................................................................... 7

3. Objetivos ................................................................................................................... 9

3.1 Objetivo general: ................................................................................................ 9

3.2 Objetivos específicos: ........................................................................................ 9

4. Marco teórico y estado del arte ............................................................................. 11

4.1 Leishmaniasis, enfermedad tropical endémica ................................................. 11

4.2 Péptidos antimicrobianos, Dermaseptinas ........................................................ 13

4.3 Síntesis de péptidos ......................................................................................... 15

4.4 Síntesis de péptidos en fase sólida .................................................................. 16

4.5 Soporte sólido para SPPS ................................................................................ 19

4.6 Disolventes en SPPS ....................................................................................... 19

4.7 Agitación y lavados en SPPS ........................................................................... 20

5. Materiales y métodos ............................................................................................. 21

5.1 Estudios previos y selección de secuencias para síntesis ................................ 21

VI Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina con actividad antileishmanial

5.2 Síntesis química en fase sólida Fmoc de las secuencias .................................. 21

5.3 Purificación de los péptidos .............................................................................. 23

5.3.1 Liofilización .....................................................................................................23

5.3.2 Cromatografía líquida de alta eficiencia ..........................................................23

5.4 Caracterización de los péptidos ........................................................................ 24

5.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF ...........................................................24

5.4.2 Dicroísmo circular (DC) ..................................................................................24

5.5 Ensayos biológicos ........................................................................................... 24

5.5.1 Hematíes ........................................................................................................25

5.5.2 Monocitos .......................................................................................................25

5.5.3 Parásitos ........................................................................................................25

5.5.4 Péptidos y controles .......................................................................................26

5.5.5 Ensayos de hemólisis .....................................................................................26

5.5.6 Ensayos de citotoxicidad ................................................................................27

5.5.7 Ensayos de efectividad sobre formas extracelulares de L. panamensis. ........28

6. Resultados y discusión ..........................................................................................30

6.1 Estudio previo y análisis bioinformático ............................................................. 30

6.2 Síntesis química Fmoc de los análogos seleccionados ..................................... 34

6.3 Purificación de péptidos .................................................................................... 43

6.4 Caracterización de péptidos .............................................................................. 45

6.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF ...........................................................45

6.4.2 Dicroísmo circular ...........................................................................................50

6.5 Ensayos biológicos ........................................................................................... 53

6.5.1 Ensayo de hemólisis ......................................................................................53

6.5.2 Ensayo de citotoxicidad ..................................................................................55

6.5.3 Ensayos de efectividad sobre promastigotes de L. panamensis .....................55

7. Conclusiones ..........................................................................................................61

Bibliografía .....................................................................................................................63

Lista de figuras VII

Lista de figuras

Figura 1. Principios de SPPS tomado de [56] ................................................................ 17

Figura 2. Epimerización por medio de la formación de Oxazolonas, tomado de [56]. ... 18

Figura 3. Helical Wheel para DM1 ................................................................................. 33

Figura 4. Helical Wheel para DM17 ............................................................................... 33

Figura 5. Reacciones para la activación de Fmoc-aminoácidos con DCC y HOBt ......... 35

Figura 6. Mecanismo de desprotección grupo Fmoc ..................................................... 37

Figura 7. Reacciones para la prueba de ninhidrina en presencia de un grupo amino. ... 39

Figura 8. Esquema de desanclaje de un pentapéptido en medio ácido ......................... 41

Figura 9. Esquema de formación de dicetopiperazinas, tomado de [92] ........................ 42

Figura 10. Corrida cromatográfica en fase reversa para DM11 ...................................... 44

Figura 11. Formación de piroglutámico a partir de glutamina ......................................... 46

Figura 12. Espectro de masas MALDI-TOF para DM1 ................................................... 47

Figura 13. Espectros de masas MALDI-TOF para análogos de dermaseptina ............... 48

Figura 14. Espectros de DC para análogos de dermaseptina ........................................ 52

Figura 15. Efecto de la concentración de DM1 sobre la supervivencia de L. panamensis

....................................................................................................................................... 57

Figura 16. Gráfico de la distribución de la hidrofobicidad por aminoácido para los

análogos de dermaseptina. ............................................................................................ 58

Lista de tablas VIII

Lista de tablas

Tabla 1. Estudio bioinformático de Dermaseptina S1...................................................... 31

Tabla 2. Secuencias de los análogos seleccionados para el estudio .............................. 32

Tabla 3. Tiempo total y número de ciclos efectuados para la síntesis de los análogos ... 41

Tabla 4. Tiempo total y número de ciclos en los análogos de dermaseptina ................... 43

Tabla 5. Tiempos de retención y pico de masas para los análogos de dermaseptina ..... 45

Tabla 6. Variaciones más comunes de m/z encontradas para los análogos de

dermaseptina .................................................................................................................. 49

Tabla 7. Estructura secundaria de los análogos de dermaseptina por dicroísmo circular

con el programa CONTINLL ............................................................................................ 51

Tabla 8. Actividad hemolítica y citotóxica de los péptidos sobre eritrocitos y monocitos de

sangre periférica humana respectivamente. La concentración media Hemolítica (HC50) y

la concentración letal media (CL50) expresada en μg/mL ................................................ 54

Tabla 9. Eficacia de los análogos de dermaseptina sobre promastigotes de L.

panamensis. La concentración media efectiva (EC50) es expresada en μg/mL. ............. 56

Tabla 10. Secuencias de análogos modificados de DM1 ................................................ 60

Lista de abreviaturas IX

Lista abreviaturas

ACN: acetonitrilo Boc: tertbutoxicarbonilo Bzl: bencilo CE50: Concentración efectiva media CH50: Concentración hemolítica media CL: Leishmania cutánea CL50: Concentración letal media DC: Dicroísmo circular DCC: N,N´-diciclohexilcarbodiimida DCM: diclorometano DIEA: N,N-diisopropiletilamina DMF: dimetilformamida EDT: 1,2-etanoditiol FBS: Suero fetal bovino Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo HF: Fluoruro de hidrógeno HOBt: 1-hidroxibenzotriazol IPA: isopropanol L. panamensis: Leishmania panamensis MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption of Ions Time-of-Flight NMP: N-metilpirrolidona OMS: Organización mundial de la salud OtBu: t-butil éster PA: Poliamida PAM´s: Péptidos antimicrobianos Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo PBS: Buffer fosfato salino PEG: Polietilenglicol PS: Poliestireno entrecruzado RP-HPLC: Cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa RPMI: medio Roswell Park Memorial Institute SPPS: Síntesis de péptidos en fase sólida TBTU: O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tBu: t-butilo TFA: ácido trifluoroacético TFE: 2,2,2-trifluoroetanol TIS: triisopropilsilano UFA: Unidades arbitrarias de fluorescencia VL: Leishmania visceral

Introducción

Los péptidos antimicrobianos (PAMs) son moléculas muy importantes en el sistema

inmune de muchos organismos, incluyendo el humano. Estos péptidos usualmente son

de tamaño pequeño, con características amfipáticas y carga positiva totalmente definida

[2, 3]. Para los PAMs se ha encontrado actividad contra virus, hongos, bacterias e incluso

contra células tumorales. Los mecanismos de acción de los diferentes péptidos

reportados son demasiados, entre los representativos se encuentran la interacción con

membrana celular, inhibición en alguna de las funciones como la síntesis de ácidos

nucleicos y proteínas, también se reporta acción inmunomoduladora y cicatrizante [4, 5].

El presente estudio propuso sintetizar y evaluar la actividad de 11 péptidos sintéticos a

diferentes concentraciones frente a parásitos de Leishmania. Los resultados indican que

de las once secuencias, solo 1 mostró actividad Leishmanicida contra promastigotes de

L. panamensis nombrado como DM1. La concentración efectiva media (CE50) hallada

fue de 151,9μg/mL con R2 superior a 0.9 para todos los ensayos. Se realizaron las curvas

de viabilidad de L. panamensis vs la concentración empleada para DM1.

Se estandarizó y se puso a punto la técnica para obtener por medio de síntesis Fmoc, las

diferentes secuencias peptídicas. Para estas secuencias se varió la concentración de

activadores, aminoácidos y naturaleza del solvente, usando una resina Rink amida de

sustitución conocida. La cantidad de péptido obtenido estuvo alrededor de los 50 mg de

péptido/ 100 mg de resina. En este estudio, la síntesis en fase sólida Fmoc resulto ser

una alternativa limpia y óptima para la producción de péptidos con actividad biológica. La

purificación de cada uno de los péptidos se realizó por cromatografía líquida de alta

eficiencia en fase reversa (RP-HPLC) y liofilización. Se logró establecer el gradiente de

solventes ideal para la purificación de cada uno de los péptidos. La caracterización de los

péptidos se realizó por espectrometría de masas MALDI-TOF, en la cual se logró

confirmar las secuencias peptídicas.

2 Introducción

Con ayuda de las herramientas bioinformáticas, usando el servidor Scratch Protein

Predictor (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6], se realizaron las predicciones de la

estructura secundaria de cada una de las secuencias, las cuales fueron comparadas con

los datos experimentales obtenidos por medio de dicroísmo circular (DC), indicando que

tanto por medio de las herramientas bioinformáticas como por DC el carácter helical de

todas las secuencias estuvo por encima de 41.5%.

Por otro lado, a las máximas concentraciones evaluadas para cada uno de los péptidos,

la citotoxicidad sobre monocitos de sangre periférica humana fue mínima calculándose

concentración letal media (CL50) superiores a 200μg/mL. El estudio del carácter

hemolítico de cada una de las secuencias se evaluó sobre eritrocitos humanos de

donantes sanos grupo O Rh positivo, encontrando porcentajes menores de 6.2% a la

máxima concentración del estudio.

http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/

1. Planteamiento del problema y justificación

Las infecciones bacterianas y parasitarias en humanos han aumentado de forma

dramática debido a la aparición de cepas resistentes a los compuestos antibacterianos y

antiparasitarios, por lo que la búsqueda y desarrollo de nuevos compuestos con actividad

antibacterial y antiparasitaria se ha convertido en una prioridad para el control de la

resistencia y multirresistencia que los microorganismos generan en el organismo. Aunque

la resistencia a los péptidos antimicrobianos es mucho menor comparada con antibióticos

convencionales, existen mecanismos de resistencia, tales como la degradación por

proteasas, la liberación de proteínas inhibidoras o cambios en la conformación de la

membrana externa del patógeno [7] que hacen que se busquen y mejoren este tipo de

moléculas. El desarrollo de nuevos agentes antibacterianos requiere de la elaboración

eficaz de compuestos que preferiblemente sean encontrados de manera natural y que

sean viables de obtener por medio de metodologías sintéticas relativamente económicas

y favorables con el medioambiente, haciendo a este tipo de moléculas selectivas y con

alta actividad frente a los diferentes microorganismos que causan diferentes

enfermedades.

La diversidad de péptidos de origen natural que tienen actividad biológica demostrada es

alta. Hasta el momento se encuentran reportadas 21,698 secuencias contra cáncer,

enfermedades cardiovasculares, diabetes, apoptosis entre otras [8]. Se ha encontrado

que la linfa de los insectos, los gránulos de los neutrófilos humanos y la piel de las ranas

contienen péptidos que pueden matar bacterias en medios de cultivos [7]. Además de

destruir directamente microorganismos, algunos son capaces de promover la generación

de cierta inmunidad, particularmente de la inmunidad innata, lo que genera el concepto

de péptidos de defensa innata [9, 10]. A partir de la estructura de los péptidos naturales

se llevan a cabo variaciones en la síntesis para obtener nuevos péptidos que aumenten

la actividad antimicrobiana y presenten baja toxicidad, como es el caso de la actividad

antileishmanial [11, 12].

4

Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina con actividad antileishmanial

Las especies como insectos, animales y plantas que son capaces de sobrevivir y convivir

en un medio ambiente hostil donde un ser humano no podría, eventualmente poseerían

un "sistema inmune" o de defensa que proporciona una mayor posibilidad de

supervivencia. Estas cualidades pueden ser usadas al enfrentarlas a ciertos

microorganismos que causen problemas en el hombre. Si buscamos, localizamos e

identificamos las moléculas secretadas por estos organismos, en su mayoría péptidos,

podremos llegar a encontrar nuevas y efectivas soluciones que permitan tratar y enfrentar

ciertas enfermedades que son resistentes a medicamentos conocidos actualmente.

Uno de los problemas que se ha intentado enfrentar es una enfermedad de tipo

parasitaria denominada Leishmaniasis, que tiene un carácter endémico en regiones de

América, África, Asia y los países europeos meridionales. Según datos de la

Organización Mundial de la Salud (OMS), más de 350 millones de personas en 88 países

corren el riesgo de infección de esta enfermedad tropical. Se cree que cerca de 12

millones de personas están infectadas actualmente, y se esperan de 1-2 millones de

nuevos casos por año [13]. Hasta el momento no existe ninguna vacuna eficaz contra la

leishmaniasis y el único método para tratar la enfermedad consiste en tratamiento con

diferentes fármacos los cuales en su mayoría se han desarrollado a mitad del siglo

pasado [14]. Como la resistencia del parásito frente a los medicamentos usados se

vuelve más frecuente, hay una creciente preocupación de que los fármacos actualmente

se conviertan en tratamientos ineficaces para el control de la enfermedad. En

consecuencia, existe una necesidad apremiante de desarrollar nuevos compuestos que

sean activos contra cepas resistentes de los medicamentos que actualmente se usan

para el tratamiento de la Leishmania. Por tanto, el desarrollo de nuevos agentes

antileishmaniales basados en péptidos con una actividad específica se convierte en una

alternativa de gran interés para combatir la enfermedad.

En este trabajo se realizó el diseño y síntesis de péptidos derivados de Dermaseptina

(ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ) [12, 15], los cuales fueron

sintetizados por la técnica en fase sólida Fmoc, purificados por Liofilización y HPLC en

fase reversa (RP-HPLC) y caracterizados por espectrometría de masas MALDI-TOF y

Dicroísmo Circular (DC). De los péptidos evaluados, solo 1 presentó actividad contra

Planteamiento del problema y justificación 5

promastigotes de L. panamensis lo cual es un indicio de su potencial actividad

antimicrobiana contra esta especie del parásito Leishmania.

2. Hipótesis

El uso de péptidos como tratamiento contra la Leishmania está muy poco estudiado. Uno

de los estudios reportados consiste en evaluar el potencial antileishmanial de Andropina,

Cecropina A, Cecropina B, Cecropina P1 y Dermaseptina. De los péptidos evaluados,

sólo Dermaseptina presentó actividad Leishmanicida (selectiva frente a Leishmania

major) y a concentraciones iguales o superiores a 12.5 μg/mL presentó actividad

hemolítica y citotóxica [16]. La modificación de las secuencias con actividad demostrada,

abrirá un campo más amplio para el mejoramiento de moléculas biológicamente activas y

de mayor eficacia para el control y tratamiento de la enfermedad. La actividad citotóxica

demostrada de los péptidos sobre la bicapa lipídica y al momento de usarlos vía

sistémica hace que se tenga en cuenta esta actividad para el mejoramiento de

propiedades como carga y estructura de los péptidos [3]. Realizar rompimientos dirigidos

de la secuencia de Dermaseptina con ayuda de herramientas bioinformáticas, tendrá

efecto sobre la actividad antileishmanial de L. panamensis, citotoxicidad y carácter

hemolítico, las cuales estarán relacionadas directamente con la variación de la estructura

secundaria, en especial α-hélice, y de alguna manera con la carga de las moléculas

propuestas.

3. Objetivos

3.1 Objetivo general:

Sintetizar y evaluar 11 péptidos derivados de Dermaseptina que posean acción sobre

promastigotes de Leishmania aumentando la actividad antileishmanial.

3.2 Objetivos específicos:

Adecuar los protocolos necesarios para sintetizar y purificar péptidos con

actividad biológica contra leishmaniasis.

Evaluar la contribución de la estructura de los péptidos en la actividad frente a

Leishmania.

Estudiar la acción biológica de los péptidos sintetizados y compararla con la de

péptidos ya reportados.

Modificar los análogos de Dermaseptina usando herramientas bioinformáticas con

el fin de aumentar la actividad antileishmanial.

4. Marco teórico y estado del arte

4.1 Leishmaniasis, enfermedad tropical endémica

Una de las enfermedades relevantes en los humanos es la Leishmaniasis, causada por

un parásito protozoo que afecta principalmente a vertebrados, incluido el hombre,

perteneciente a la familia Trypanosoniatidae y causante del conjunto genérico de

enfermedades denominado leishmaniasis, las cuales tienen diversos síntomas y

básicamente dependen de la especie de Leishmania y del estado inmunológico del

hospedador [17, 18]. El origen de la enfermedad aún no es muy claro, pero se cree que

su origen es en África migrando posteriormente del viejo mundo a América hace mas de

3 millones de años [19]. Las formas clínicas de la enfermedad son tres: la cutánea, la

muco-cutánea y la visceral o kala azar. La forma más común de la enfermedad es la

cutánea, con un amplio espectro de manifestaciones, que van desde lesiones simples en

la piel, hasta destrucción de tejido en la mucosa [20]. La leishmaniasis visceral es la

forma más severa de la enfermedad, y se caracteriza por síntomas como fiebre

prolongada, agrandamiento del bazo, aumento de las inmunoglobulinas, entre otros. En

la mayoría de los casos, si no es atendida a tiempo, la leishmaniasis visceral puede

causar la muerte [21]. La mortalidad y la morbilidad causadas por leishmaniasis (tanto la

leishmaniasis visceral [VL] y Leishmaniasis cutánea [CL]) solo es superado por la malaria

y la filariasis linfática, llamada comúnmente elefantiasis [22].

La propagación y la gravedad de la enfermedad se ven aumentadas por su coinfección

con VIH en algunos pacientes [23]. El tratamiento para la leishmaniasis, así como para la

tripanosomiasis (otra enfermedad parasitaria causada por kinetoplastidios), es complejo.

La forma más grave de la Leishmania, la VL requiere de un tratamiento con

medicamentos que resulta ser prolongado, costoso y con reacciones adversas en el

organismo. Además, se complica por la resistencia que genera la Leishmania contra los

medicamentos [24, 25]. Esta tendencia a la resistencia de los actuales medicamentos por

12 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina

con actividad antileishmanial

parte del parásito, ha dado lugar a la utilización de fármacos más tóxicos en el

tratamiento de esta infección parasitaria. Esos factores junto con la falta de vacunas

eficaces contra la enfermedad, hacen que el descubrimiento de nuevos agentes

terapéuticos sea una prioridad para la OMS y el mundo entero [26].

Los fármacos actualmente en uso para el tratamiento de la Leishmaniasis se limitan a

cuatro. Los compuestos de primera línea son dos antimoniales pentavalentes,

estibogluconato de sodio (Pentostam) y antimoniato de metilglumina (Glucantime). Estos

compuestos se usaron por primera vez en 1947 y 1950, respectivamente. Son

administrados por vía parenteral en dosis de 10-20 mg Sb/kg/día durante 10 a 30 días.

Las recaídas se producen en todas las formas de la leishmaniasis y en la mayoría de los

casos es la causa de abandono del tratamiento por parte de los pacientes. Sí estos

fármacos no son eficaces, se usan los compuestos de segunda línea que son la

pentamidina (Lomidine) y anfotericina B (Fungizone), introducidos en 1940 y 1959,

respectivamente [24, 27].

Hasta el momento no existen vacunas efectivas que permitan combatir o prevenir la

Leishmaniasis [28], aunque algunos medicamentos experimentales están pasando por

ensayos clínicos. Estos son:

El alopurinol, un fármaco en uso para el tratamiento de la gota. Se supone que

funciona como un sustrato alternativo para la enzima transferasa hipoxantina

guanina fosforribosil (HGPRTase), lo que conduce a la inhibición de la síntesis de

proteínas en el parásito. También es usado para tratar la enfermedad de Chagas

y actualmente para el tratamiento de la leishmaniasis en perros. [29]

El Ambisome, una formulación de anfotericina B en liposomas. Debido a la alta

capacidad de interacción de los macrófagos, las células huésped del parásito

Leishmania, el fármaco se convierte en un objetivo específico y es captado por

estas células. Esto aumenta la eficacia y reduce la toxicidad del fármaco. [30]

El Ketoconazol (Janssen Pharmaceutica), un inhibidor del citocromo P450 y de la

síntesis de egosterol que corresponde a esteroles de la membrana. Además se

usa para el tratamiento tópico de enfermedades sistémicas y otras infecciones por

hongos. También inhibe la síntesis de esteroles en Leishmania e interfiere con su

Marco teórico y estado del arte 13

crecimiento y división intracelulares. Se usa en perros y en seres humanos en

algunos países latinoamericanos [30, 31].

La leishmaniasis representa un reto mundial para el descubrimiento de nuevas

alternativas que permitan controlar y frenar la infección. En Colombia el panorama sobre

la enfermedad no es muy alentador, se tiene reportes que en el periodo comprendido

entre el 2005 al 2009 Colombia registro cerca de 63000 casos de leishmaniasis cutánea,

de los cuales el 50% compromete a militares de las fuerzas armadas colombianas. Una

de las preocupaciones es el aumento de las notificaciones acerca de casos de

Leishmania, reflejando un posible incremento de la transmisión atribuido a factores como

el aumento del contacto humano con ambientes silvestres en donde aumenta el riesgo

por transmisión con la fauna especifica del lugar y a los cambios de los entornos,

incluyendo zonas selváticas donde el acceso al sistema de salud no es el ideal [32, 33].

El potencial uso de emulsiones, liposomas y nanopartículas que sean capaces de portar

un fármaco activo contra la enfermedad, ha adquirido mucho interés debido

principalmente a su versatilidad y a las ventajas de este tipo de moléculas al tiempo de

atacar cualquier forma del parasito [28]. La liberación controlada de medicamentos y

moléculas biológicamente activas, en especial nanopartículas, es de gran interés, debido

a que son consideradas partículas “inteligentes” de pequeño tamaño (de 1nm hasta

100nm) que contienen una sección de reconocimiento y una parte terapéutica. La

variedad de este tipo de partículas es alta, se conocen nanopartículas de naturaleza

orgánica e inorgánica con características biodegradables y no degradables [34].

4.2 Péptidos antimicrobianos, Dermaseptinas

En los años sesenta se observó la presencia de un péptido con actividad antimicrobiana

y hemolítica en la piel de un sapo de panza amarilla, Bombina variegata y se le denominó

bombinina por Kiss y Michl [35]. En 1972 Habermann [36] descubrió en el veneno de

ciertas abejas y avispas un péptido que fue denominado melitina. Posteriormente, en

1980 Hans en Estocolmo demostró la presencia de péptidos antibióticos inducibles en la



hemolinfa de lepidópteros [37]. Se sabe que tanto plantas como animales e incluso

microorganismos comparten un mecanismo de defensa efectivo frente a los patógenos

invasores. Existen trabajos descritos en insectos [37], crustáceos [38], anfibios [39],

mamíferos [40] y plantas [41], bacterias, hongos y virus [42]. En determinadas

circunstancias, y ante un proceso inflamatorio o infeccioso, la presencia de éstos

péptidos antibióticos en diferentes animales y también en los humanos aumenta. Además

se sabe que los péptidos producidos por células eucariotas pueden presentar actividad

antibacteriana, antifúngica, antiparasitaria, antiviral o antitumoral [41].

Los antimicrobianos convencionales, son aquellas moléculas que logran inhibir el

crecimiento o que eliminan totalmente al microorganismo, denominada acción

bacteriostática o acción bactericida respectivamente. La obtención de esos compuestos

activos puede provenir de diferentes fuentes como insectos, anfibios, mamíferos y

plantas para la preparación de productos farmacéuticos. Los antibióticos, como la

penicilina, son moléculas que en la mayoría de los casos tienen actividad antimicrobiana

y fueron obtenidas en un principio por hongos y levaduras. Actualmente, algunos

investigadores obtienen nuevos agentes medicinales partiendo de ventajas naturales de

ciertos países e integrando áreas como la bioquímica, biología molecular y últimamente

la bioinformática, para permitir el hallazgo de novedosos antimicrobianos que son parte

de las líneas primarias de defensa de los organismos [43, 44].

Por otro lado, encontramos las Dermaseptinas

(GLWSKIKEVGKEAAKAAAKAAGKAALGAVSEAV), que corresponden a una familia de

ocho péptidos estrechamente relacionados que fueron aislados originalmente de la piel

de una rana de Sur América (Phyllomedusa sauvagei). Estos compuestos son péptidos

lineales, compuestos de 28 a 34 aminoácidos, con estructura en α-hélices de tipo

anfipática en disolventes apolares [45]. Todos los péptidos conservan residuos de

Triptófano (W) en la posición 3, y una carga positiva atribuible a la presencia de residuos

de Lisina (K) que marcan una cierta distribución en la secuencia [45, 46]. Algunas

dermaseptinas muestran una notable capacidad para inhibir células microbianas de

manera eficiente, rápida e irreversible sin efecto tóxico sobre las células de mamíferos

[47, 48]. Se ha demostrado que las Dermaseptinas también son eficaces contra


protozoos (Leishmania mexicana y Plasmodium falciparum) [49-51], levaduras y hongos

filamentosos (Aspergillus fumigatus y Aspergillus niger) [46, 51].

4.3 Síntesis de péptidos

Los péptidos (del griego πέσσειν Peptein que significa digerir) son moléculas en la

mayoría de los casos biológicamente activas constituidas de aminoácidos. Los péptidos

se pueden explicar como la formación química repetida de enlaces amida, en los cuales,

las funciones carboxilo y amina de L-α-aminoácidos adyacentes son conectados entre sí.

La complejidad de este enlace es muy alta, ya que los L-α-aminoácidos como su nombre

lo indica, tienen dos grupos funcionales, y estos dan la posibilidad de formar especies no

deseadas, por lo cual es necesario proteger ciertos grupos funcionales y únicamente

dejar desprotegidas una de las funciones para lograr el enlace peptídico deseado.

Además, muchos de estos aminoácidos tienen grupos funcionales en su cadena lateral,

lo que hace que deban estar protegidos durante la síntesis. Cuando la secuencia de

aminoácidos es superior a 50 aminoácidos, se denomina proteína, considerando las

proteínas como los compuestos de gran peso molecular, de actividad biológica

reconocida y constituida de péptidos.

La historia de la síntesis química de péptidos inicia desde 1901, cuando Emil Fischer

logró descomponer ciertas proteínas en aminoácidos y también formar de manera

sintética el primer dipéptido de Glicilglicina por hidrólisis de dicetopiperacina de la glicina

[52]. En ese momento solo se realizaban péptidos de un solo tipo de residuo, y el avance

de la síntesis química se vio retrasada. En 1906, Fischer junto con Axhausen sintetizaron

un octadecapeptido L-(G)3-L-(G)3-L-(G)9, para el cual se empleó el primer grupo protector

tipo uretano, etoxycarbonilo (C2H5OCO), el cual abrió la puerta para usar protectores de

este tipo, que son removidos en condiciones básicas. En 1932, Max Bergmann y

Leonidas Zervas, introdujeron el grupo benzyloxicarbonilo como grupo protector, que fue

usado en 1953 para producir una de las primeras hormonas oligopeptídicas, la Oxytocina

por du Vigneaud [52]. Los anteriores métodos se basaban en la adición secuencial de

aminoácidos en solución, que implicaba pasos muy tediosos de purificación y

cuantificación. En 1963, Merrifield realizó la primera síntesis de un tetrapéptido LAGV por



estrategia en fase sólida, usando una resina de poliestireno como soporte sólido [53]. A

partir de ese momento, la síntesis en fase sólida para la producción de péptidos ha

avanzado considerablemente.

Los métodos de síntesis actualmente se puede dividir en dos grandes clases, Lineal y

Convergente. En la síntesis lineal la elongación secuencial de la cadena peptídica se da

aminoácido tras aminoácido [54]. Es importante resaltar que la síntesis química de los

péptidos se da por la adición de los aminoácidos de manera contraria a la que se da en el

ribosoma, se va adicionando el aminoácido al soporte sólido por su extremo C- terminal

hasta el N-terminal, para evitar la pérdida de la quiralidad de los residuos implicados. En

la estrategia convergente, las unidades que se agregan no son aminoácidos protegidos,

sino que son péptidos protegidos [55].

4.4 Síntesis de péptidos en fase sólida

La síntesis en fase sólida no es una metodología exclusiva para la alternativa secuencial,

pero ha tenido mayor importancia en este tipo de síntesis. La síntesis de péptidos implica

numerosos pasos repetitivos y el uso de un soporte sólido con numerosas ventajas. Los

excesos de los reactivos y de productos secundarios se pueden separar del péptido

insoluble simplemente por filtración y lavados, haciendo que todos los pasos de síntesis

se realicen de manera consecutiva. Los principios de SPPS se ilustran en la figura 1. El

aminoácido C-terminal y N-protegido es anclado a través de su grupo carboxilo a un

grupo hidroxilo (o cloro) o resina con un grupo amina para producir un péptido con

extremo C-terminal de tipo éster o amida respectivamente. Después de anclar el primer

aminoácido, la secuencia deseada se va montando por metodología lineal desde el

extremo C-terminal a N-terminal mediante ciclos repetitivos de n-desprotecciones y

reacciones de acoplamiento de aminoácidos. La cadena lateral de ciertos grupos

funcionales de los aminoácidos debe estar protegida de manera permanente mediante

grupos protectores (Pn) que son estables en las condiciones de reacción utilizadas

durante la elongación del péptido.

El grupo α-amino tiene protección de tipo temporal (T) que es generalmente compuestos

derivados de uretano. El grupo de protección temporal (T) puede ser fácilmente removido


bajo condiciones suaves que preservan la integridad del péptido y reduce la

epimerización (la mayoría de los casos conduce a la formación de Oxazolonas) como se

ilustra en la figura 2. La función protectora de tipo uretano para evitar la epimerización

también explica el predominio de la estrategia de síntesis desde el extremo C-terminal a

N-terminal. Después del acoplamiento, el exceso de reactivos se elimina por filtración y

lavados. La desprotección del grupo protector temporal N-terminal se realiza para permitir

la adición del siguiente aminoácido protegido por N-uretano y activados en su extremo

ácido α-carboxílico. Este proceso (desprotección / acoplamiento) se repite hasta llegar a

la secuencia deseada. En una etapa final, el péptido se libera de la resina y los grupos de

protección de las cadenas laterales (Pn) son eliminados [56].

Figura 1. Principios de SPPS tomado de [56]



Figura 2. Epimerización por medio de la formación de Oxazolonas, tomado de [56].

En SPPS, se utilizan dos estrategias principales: Boc/Bzl y Fmoc/tBu denominados así

por los grupos protectores T/Pn. La estrategia Boc (terc-butoxicarbonilo) se basa en el

grado de labilidad ácida del grupo protector. El grupo Boc se elimina mediante lavados

con ácidos de fuerza moderada [33% de ácido Trifluoroacético (TFA) en Diclorometano

(DCM)] lo que implica que los protectores de tipo Bzl (bencilo) que se usan para las

cadenas laterales deban ser estables en estas condiciones. Luego de la remoción del

grupo Boc por medio ácido, se debe hacer una neutralización [5% de N,N-

diisopropiletilamina (DIEA) en DCM]. La eliminación de los protectores de la cadena

lateral y separación del péptido al soporte sólido requiere de tratamientos ácidos mas

fuertes como el fluoruro de hidrógeno (HF) anhidro [56]. Debido a que el HF es un ácido

extremadamente fuerte que puede alterar la integridad de la secuencia peptídica y que

necesita de espacios físicos especiales para su manipulación, se desarrollo una

estrategia más suave basada en el grupo Fmoc [1]. Este grupo se elimina con bases de

fuerza moderada [20-25% de piperidina en dimetilformamida (DMF)], a través de una

reacción de β-eliminación. Esta ventaja permite el uso de protectores de tipo t-butilo (tBu)

que son lábiles en presencia de ácidos como el TFA. La ventaja adicional de Fmoc sobre

Boc es el uso de protectores de tipo ortogonal [57, 58], puesto de otra manera, se

pueden eliminar los grupos protectores mediante dos estrategias químicas diferentes,

permitiendo el uso de condiciones ácidas más débiles para la liberación final.


4.5 Soporte sólido para SPPS

A menudo el término "resina" es mal utilizado en lugar de “sistema-linker”,

ignorando el hecho de que la matriz polimérica es igual de importante como la solución

donde se encuentra el aminoácido activado y listo para realizar el acople [59]. Existen en

el mercado muchísimos soportes sólidos disponibles y de gran variedad. La elección del

soporte sólido se da por la secuencia peptídica a sintetizar y al “linker” o brazo

espaciador más adecuado para la síntesis.

La resina que comúnmente se usa para SPPS se basa en una matriz polimérica de

poliestireno entrecruzado (PS). La distribución de ese entrecruzamiento se da por

tamaños que oscilan de 200-400 mesh (que corresponde a un diámetro de alrededor de

50 micras) y una sustitución entre 0.5 a 0,8 mmol/g. Estas características garantizan en

el polímero buenas propiedades de hinchamiento en disolventes típicos de lavados como

DMF y DCM, una buena distribución de los reactivos en toda la zona del polímero,

garantizando la accesibilidad de los reactivos. Para péptidos de tamaño superior (más de

25 residuos) o secuencias “difíciles” se requiere un grado de sustitución menor (0,1-0,3

mmol/g). Resinas a base de poliamida (PA) y polietilenglicol (PEG) son mucho más

hidrofílicas que las PS, por tanto se comportan mejor para secuencias con cierta

dificultad [59].

4.6 Disolventes en SPPS

En cuanto a los disolventes usados durante la síntesis éstos son de gran importancia ya

que para llevar a cabo el crecimiento de la cadena peptídica, éste debe garantizar el

máximo volumen desplegado de la resina, la interacción de los aminoácidos con la parte

activa y la solubilidad de los aminoácidos activados, para mejorar los rendimientos de los

acoplamientos. Para las PS el DCM presenta una óptima propiedad de hinchamiento o

aumento de volumen en la resina. Para los pasos de acoplamiento el uso de disolventes

polares apróticos como DMF o N-metilpirrolidona (NMP) se prefieren para mejorar la

solubilidad de los reactivos. Alcoholes y el agua no son disolventes adecuados para las

resinas PS ya que reducen el tamaño de la resina, encogiéndola. Esta propiedad es

usada para realizar los lavados y ayudar a retirar de manera eficiente los reactivos en



exceso. Después de ese encogimiento, la resina se vuelve a hinchar usando DCM o DMF

[56].

4.7 Agitación y lavados en SPPS

Otro factor importante cuando se está realizando un acople es la agitación, ésta no debe

ser brusca como la que se obtiene con agitación magnética, ya que el fenómeno del

acople se da por un la difusión y la interacción entre las partes (aminoácido activado y

resina), con lo que agitaciones vigorosas pueden provocar daños en la resina debido a

que está constituida de granos muy finos y frágiles [56].

Los pasos de lavado se usan para eliminar los productos secundarios y el exceso de

reactivos usados en los pasos de acoplamiento y desprotección. El método simple es

llenar el reactor con el solvente a usar en el lavado, dejarlo en agitación durante un corto

tiempo (1-3 min) y desechar la solución de lavado. Se recomienda hacer varios lavados

con pequeña cantidad de disolvente y no pocos lavados con demasiada cantidad. Los

protocolos de acoplamiento y desprotección varían según el tipo de activador de la

función carboxilo del aminoácido, el tipo de soporte sólido, el tipo de reactor y la

secuencia a sintetizar, al igual que la desprotección final del péptido.

5. Materiales y métodos

5.1 Estudios previos y selección de secuencias para síntesis

Para la selección de las secuencias, se procede a realizar cortes sucesivos de la

secuencia Dermaseptina S1 (ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ) desde

el extremo N-terminal hasta el C- terminal cada 15 residuos. El número de residuos para

los cortes fue seleccionado por estudios previos de la evaluación de la actividad

antimicrobial sobre análogos de Dermaseptina S1, en donde se encontró que el

fragmento mínimo que posee actividad antimicrobial comparable con la secuencia

original es DS1(1–15)-NH2 [60]. Luego de los cortes se realiza la predicción de estructura

secundaria para cada análogo de Dermaseptina con los servidores Scratch Protein

Predictor (SPP, http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6] y Protein Predictor (PP,

http://www.predictprotein.org/) [61] los cuales muestran la posible conformación

secundaria de cada uno de los residuos en la secuencia peptídica.

Posteriormente se calcula la carga neta de cada uno de los análogos y se hace el

análisis de relación entre estructura secundaria y carga de la molécula, la cual busca

favorecer las secuencias que puedan tener una mayor estructura secundaria en hélice y

una distribución anfipática de carga en la secuencia. Las secuencias seleccionadas

forman parte de la matriz de estudio e intentan ilustrar la contribución de cada residuo en

la posición del péptido.

5.2 Síntesis química en fase sólida Fmoc de las secuencias

La síntesis lineal en fase sólida de los péptidos se lleva a cabo usando la estrategia N-

Fmoc. Los disolventes usados para la síntesis son diclorometano (DCM), isopropanol


http://www.predictprotein.org/



(IPA), N,N'-dimetilformamida (DMF) y 1-metil-2-pirrolidona (NMP). Los activadores que se

usan son N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), y

tetrafluoroborato de O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU). Para las

desprotecciones se usa piperidina, ácido trifluoroacético (TFA), 1,2-etanoditiol (EDT),

triisopropilsilano (TIS). Como soporte sólido polimérico se usa una resina Rink Amida de

sustitución 0.40 mmol/g. Los diferentes L-α-aminoácidos (Fmoc-aminoácidos) tienen una

pureza >99%. El grupo protector α-amino terminal en todos los aminoácidos es el 9-

fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). El protector de la cadena lateral para la Lisina (K) y el

Triptófano (W) fue el tertbutoxicarbonilo (Boc), para la Serina (S), Tirosina (Y) y Treonina

(T) fue el grupo tertbutilo (tBu), para la Arginina (R) fue el grupo 2,2,4,6,7-

pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf), para el ácido Glutámico (E) y el ácido

Aspártico (D) el grupo protector fue t-butil éster (OtBu) y el resto de aminoácidos usados

no tenían protección en su cadena lateral.

Para las reacciones de activación se usa DCC y HOBt (1:1) en DMF a 5 excesos con

respecto al aminoácido. Los acoples son dejados en agitación constante y a temperatura

ambiente durante 6 horas. Para los acoples que presenten alguna dificultad, se cambia la

estrategia de activación con DCC y TBTU (1:1) en NMP a 7 excesos durante 2 horas. Las

activaciones de la función carboxilo se cumplen como es descrito por Merrifield y

Amblard [53, 56], la cual consiste en formar un éster activo entre el aminoácido y los

reactivos de activación, para posteriormente realizar la reacción del éster con el amino

libre y disponible. Las reacciones de acople de las cadenas peptídicas se ejecutará

siguiendo el procedimiento desarrollado por Albericio y Barany [57, 58], el cual garantiza

un tiempo de reacción adecuado para favorecer la reacción entre el éster del aminoácido

activado y el nuevo amino libre. Después de éste tiempo de acople, viene la liberación

del grupo protector de la función amino y su eliminación del medio de reacción mediante

una serie de lavados. Esto se realiza hasta obtener las secuencias deseadas. Para

comprobar el avance de cada acople se realizan pruebas de ninhidrina según

procedimiento de Merrifield y Van [62, 63], el cual consiste en la reacción entre la función

amino que se encuentra libre con hidrato de ninhidrina para formar un aducto que

presenta una coloración azul. El desanclaje final se realiza por tratamiento de la resina

con 95% TFA, 2% TIS, 2% Agua y 1% EDT durante 2 horas con agitación constante a

Materiales y métodos 23

temperatura ambiente. La extracción del péptido se realiza por medio de lavados

sucesivos con éter etílico frio. Este protocolo de desanclaje y desprotección del péptido

fue establecido por Barany y Kates [58, 64].

5.3 Purificación de los péptidos

5.3.1 Liofilización

La liofilización de los péptidos se realiza en un equipo LABCONCO 117 de 2.5 L. Todas

las muestras se someten a un precongelamiento a -50ºC durante 24 horas. Luego de la

precongelación, las muestras se introducen en un recipiente que se conecta al sistema

de vacío. La temperatura de congelación de la cámara de refrigeración es de -50°C y se

mantiene durante 24 h. La presión del sistema de liofilización se encuentra en valores

cercanos de 0.08 mbar (0,03 ó 0,2 mbar) a una velocidad de 0,5°C/min. Al final del

proceso se obtienen presiones cercanas a 0,01 mbar. El liofilizador cuenta con cierre

manual de la cámara de refrigeración y las muestras después de la liofilización son

retiradas. El péptido obtenido es conservado en un desecador para las pruebas

posteriores. Este protocolo de precongelamiento, liofilización y almacenamiento de los

péptidos liofilizados fue establecido por Zinge P. [65].

5.3.2 Cromatografía líquida de alta eficiencia

La cromatografía (RP-HPLC) de los péptidos se realiza en un cromatógrafo Agilent

Technologies Serie 1200, usando columnas Zorbax Eclipse XDB-C18 RP-18 (5 µm). Los

solventes usados en la cromatografía son metanol, acetonitrilo, agua y ácido

trifluoroacético (TFA) de una pureza grado HPLC. Los péptidos son eluídos mediante el

uso de un sistema de gradiente lineal A/B de 0 a 70 % B (A: Agua desionizada 0.01%

TFA), (B: acetonitrilo 0.01% TFA), a una velocidad de flujo de 1.0 mL/min en la modalidad

analítica y de 5.0 mL/min en la modalidad Semipreparativa. Se inyectan 20 μL de

muestra (1mg/mL) en modalidad analítica y 500 μL (10mg/mL), las cuales se someten a

la corrida cromatográfica correspondiente. El tiempo total de corrida en las dos

modalidades es de 45 minutos a temperatura ambiente. La detección de las señales se

logra mediante el uso de un detector UV-VIS (ultravioleta visible) con un seguimiento a

220 nm de acuerdo al protocolo establecido inicialmente por Choi [66].



5.4 Caracterización de los péptidos

5.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF

La caracterización por medio de la espectrometría de masas con desorción iónica

provocada por láser y asistida por matriz con detección de tiempo de vuelo MALDI-TOF

(Matrix-Assisted Laser Desorption of Ions Time-of-Flight), se realiza en un espectrómetro

de masas Bruker Daltonios Serie microflex MALDI-TOF Compass 1.2 aplicando un

campo eléctrico de 3 nanosegundos, a una longitud de onda de 337 nm incidiendo una

luz láser a una intensidad de 50 μJ. La matriz que se emplea es una solución

sobresaturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. La concentración del péptido es de

5.0 x 10-4 mg/μL, sembrando en placa 2.5 μL de una solución que contiene una relación

1:6 de péptido y matriz respectivamente. El protocolo anteriormente mencionado fue

establecido por Rodthongkum [67].

5.4.2 Dicroísmo circular (DC)

Los espectros de DC son procesados por un espectropolarímetro Jasco (Jasco

Internacional Co J-810) usando una cubeta de cuarzo, con una longitud de paso óptico

de 0,1. Los péptidos son leídos a una concentración de 5,0x10-6 M al 30% de

trifluoroetanol (TFE) en un rango de 190-260 nm con una velocidad de 50nm/min y un

ancho de banda de 0.5 nm. Los datos son promediados y se calcula el contenido de

estructuras secundarias incluyendo α-hélice en los péptidos mediante tres programas

que realizan la deconvolución de las señales CONTIN/LL [68], CDSSTR [69] y SELCON3

[70], lo cuales vienen incorporados con el software del equipo.

5.5 Ensayos biológicos

Los ensayos biológicos fueron realizados por el por Doctor José Julián Pérez Cordero, en

el laboratorio del Grupo de Investigación en Inmunotoxicología (COL 0068495) de la

Universidad Nacional de Colombia en Bogotá, dirigido por la Doctora Gabriela Delgado.

Esta colaboración, estuvo enmarcada en un macroproyecto financiado por la


Vicerrectoría de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia, Convocatoria

Bicentenario, 2009.

5.5.1 Hematíes

Para la obtención de glóbulos rojos se obtuvo sangre periférica de voluntarios sanos O

positivo [Acorde con la normatividad vigente, respecto a la donación de muestras con

fines de investigación, disposiciones legales vigentes emanadas del Ministerio de la

Protección Social de la República de Colombia, Resolución No. 008430 DE 1993 (4 de

Octubre 1993)]. Los glóbulos rojos fueron separados de la sangre completa mediante

centrifugación y diluidos en buffer fosfato salino (Phosphate buffered saline (PBS)) para

su empleo en los ensayos de hemólisis. El protocolo sobre la obtención de los glóbulos

rojos de sangre periférica humana es el establecido por Turpin [71].

5.5.2 Monocitos

Los monocitos se obtienen a partir de la separación de glóbulos blancos por

centrifugación en gradiente de Ficoll (Ficoll-Hypaque, Sigma Aldrich–St Louis. USA) a

2800 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante 30 minutos, a partir de muestras de

voluntarios sanos. La fracción de glóbulos blancos, se lava tres veces en PBS mediante

centrifugación siguiendo el protocolo enunciado por Carter [72] y posteriormente

sembrada en cajas de Petri de Poliestireno (BD Biosciences, Falcon) en medio RPMI

1640 [73] (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) durante 2 horas de

incubación, al cabo de las cuales, la fracción no adherente es removida. La fracción de

monocitos adheridos, se recolecta y siembra en cajas de 96 pozos fondo plano (TPP

Tissue Culture Labware 92096, Suiza) e incubada durante 24 horas a 37 ºC con

atmósfera de CO2 al 5%. Después de este periodo, puede ser empleado en los ensayos

de citotoxicidad.

5.5.3 Parásitos

Promastigotes de L. panamensis fueron cultivados en medio RPMI 1640 (Gibco,

Scotland, UK) suplementado al 10% con Suero Fetal Bovino (FBS, Microgen, Bogotá,

Colombia), y L-glutamina (Gibco BRL-Life Technologies Inc, Grand Island, NY) 10X, a 26



ºC. Los parásitos en fase estacionaria fueron usados en los ensayos de efectividad sobre

formas extracelulares de esta especie de Leishmania.

5.5.4 Péptidos y controles

Como péptido control fue utilizado CLIP, que corresponde a la cadena peptídica

invariable naturalmente cargada en el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y

que para el caso del tipo II es reemplazado enzimáticamente dentro de los endosomas

para cargar esta molécula con fragmentos peptídicos en el proceso de presentación de

antígenos [74]. Como control positivo de tratamiento, se usó el isotianato de pentamidina,

el cual se ha convertido en el medicamento de elección para el tratamiento de la LC en

varios países donde la enfermedad es endémica, presentando una eficacia muy similar a

los antimoniales pentavalentes pero con una incidencia menor de efectos adversos [75-

77]. La pentamidina, fue usada en concentraciones seriadas a partir de 10 μg/mL en los

ensayos de citotoxicidad y de efectividad contra la forma extracelular de L. panamensis.

5.5.5 Ensayos de hemólisis

Para determinar la actividad hemolítica de los péptidos de interés, como parte del efecto

no deseado de formulaciones antileishmaniales, se sembraron en cajas de 96 pozos

fondo en V (Corning, USA), 0,1 mL de suspensión de eritrocitos humanos de donantes

sanos grupo O Rh + por pozo, a una concentración de 2% de su hematocrito final en

solución salina fisiológica al 0.9% (Baxter, Colombia). Se evaluaron por duplicado, ocho

concentraciones distintas del péptido, adicionando un volumen de 0,1 mL/pozo de cada

dilución. Fueron incluidos pozos controles con iguales diluciones de CLIP, pentamidina,

eritrocitos sin péptido en Solución Salina correspondiente al 0% de hemólisis, y eritrocitos

en agua destilada estéril como control del 100% de hemólisis. Luego de la incubación a

37 ºC con CO2 al 5% durante 2 horas, las cajas fueron centrifugadas a 3500 r.p.m. y los

sobrenadantes fueron recolectados para la determinación de la concentración de

hemoglobina mediante la determinación de la absorbancia a 550nm en un

espectrofotómetro digital (Ultramark Microplate Reader, Bio-Rad, USA) [78]. Tomando

como control negativo o 100% de viabilidad, las unidades de absorbancia de los

eritrocitos no expuestos a ninguna sustancia y diluidos en solución salina. Las unidades


de absorbancia obtenidas de la lectura de la solución de eritrocitos expuestos a agua

destilada estéril, fueron consideradas como 100% de hemólisis y respecto a ella fueron

normalizados los datos obtenidos en unidades de absorbancia de los sobrenadantes de

los diferentes pozos con solución de eritrocitos, expuestos a cada uno de los péptidos y

pentamidina (a sus diferentes concentraciones) siendo calculado entonces, el porcentaje

de hemólisis para cada caso según la siguiente fórmula: % hemólisis a una concentración

X = (Unidades de Absorbancia a concentración X x 100) / unidades de absorbancia de

solución de eritrocitos expuestos a agua destilada. Posterior a la obtención de los

porcentajes de hemólisis, los datos fueron exportados al programa GraphPad Prism 5

Demo Software (GraphPad Software Demo, Inc, La Jolla, CA, USA) [79] para la

obtención de una curva concentración-respuesta y el cálculo de la concentración

hemolítica media (CH50), que equivale a la concentración de un péptido que produce la

lisis del 50% de los eritrocitos en una solución. Cada ensayo se realizó por triplicado y en

tres ocasiones distintas.

5.5.6 Ensayos de citotoxicidad

Para establecer el efecto citotóxico de los PAMs sobre monocitos, se sembraron en cajas

de 96 pozos, 0,1 mL de suspensión celular por pozo, a una concentración de 1 x 105

monocitos/mL en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino (fetal calf

serum FCS) al 5%. Luego de 24 horas de incubación a 37 ºC con CO2 al 5% para permitir

la adhesión celular, se evaluaron por duplicado ocho concentraciones distintas de cada

péptido en RPMI 1640 a partir de 200 μg/mL, adicionando un volumen de 0.1mL/pozo de

cada dilución. Fueron incluidos pozos controles con iguales diluciones de CLIP,

pentamidina, monocitos sin péptido, y uno solo con RPMI 1640. Luego de la incubación a

37 ºC con CO2 al 5% durante 72 horas, la viabilidad celular fue evaluada mediante el

método de Alamar Blue el cual se describe a continuación basado en el protocolo

establecido por Khromykh [80]. Se adicionó resazurina (Sigma Aldrich, USA) a una

concentración de 44mM y luego de 4 horas adicionales de incubación bajo las mismas

condiciones anteriores, se leyeron las unidades arbitrarias de fluorescencia (UFA)

utilizando un espectrofluorómetro (Genios Tecan Plate Reader) y el Software Magellan®).

Los datos obtenidos en UFA, fueron exportados al programa Microsoft Excel 2000 y

procesados para la obtención de los porcentajes de viabilidad celular con cada uno de los



péptidos y controles a sus respectivas concentraciones. Se consideró como 100% de

viabilidad, las UFA obtenidas de la lectura de los pozos de células no tratadas, ni

expuestas a ninguno de los controles. Los datos obtenidos de los demás tratamientos y

controles, fueron procesados con respecto a éste mediante la fórmula: % de viabilidad a

una concentración X = (UFA a concentración X x 100) / UFA de células en condiciones

normales de cultivo y no expuestas a ningún tratamiento. Estos porcentajes fueron

exportados posteriormente al programa GraphPad Prism 5 Demo Software (GraphPad

Software, Inc, La Jolla, CA, USA) [79] para el trazo de una curva concentración-respuesta

y posterior obtención de la concentración citotóxica media (CL50), la cual corresponde a

la concentración de un péptido, que genera la muerte del 50% de las células en el cultivo.

Cada ensayo se realizó por duplicado.

5.5.7 Ensayos de efectividad sobre formas extracelulares de L. panamensis.

Una suspensión de promastigotes de L. panamensis a una concentración de 2 x 106

promastigotes por mL, fueron expuestos a los péptidos a 8 concentraciones distintas,

obtenidas por diluciones seriadas a partir de 200 μg/mL. Los cultivos fueron sembrados

en cajas de 96 pozos fondo plano (TPP Tissue Culture Labware, Suiza), a 0,1 mL/pozo e

incubados a 26 ºC en RPMI 1640. La viabilidad de los parásitos fue evaluada mediante el

método de Alamar Blue adicionando este colorante a una concentración final de 44mM, e

incubando durante 48 horas a 26 ºC, luego de lo cual, las UFA, derivadas del metabolito

secundario resofurina, fueron determinadas mediante el uso del espectrofluorómetro

Genios Tecan [80]. Los datos fueron transferidos al programa Microsoft Excel 2000 para

su posterior procesamiento considerando las UFA, obtenidas de los pozos con

promastigotes cultivados en las condiciones descritas y no expuestos a ningún

tratamiento (100% de viabilidad). Los datos obtenidos de la lectura de cada uno de los

tratamientos, fueron procesados con respecto al 100% de viabilidad, mediante la fórmula:

% de viabilidad a X concentración = (UFA a X concentración x 100) / UFA de parásitos en

condiciones normales de cultivo y no expuestos a ninguna sustancia. Posteriormente, los

porcentajes obtenidos, fueron exportados al programa GraphPad Prism 5 Demo Software

(GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA) para el trazo de una curva concentración-


respuesta y la determinación de la concentración efectiva media (CE50), que

corresponde a la concentración de péptido capaz de inducir la muerte del 50% de los

parásitos expuestos. Cada ensayo fue realizado por triplicado y en tres ocasiones

distintas.

6. Resultados y discusión

6.1 Estudio previo y análisis bioinformático

Se realizó una búsqueda del carácter Antimicobacterial y Antileishmanial que presentaba

la secuencia de Dermaseptina S1 (ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ),

la cual en estudios previos se reporta como posible herramienta terapéutica para el

tratamiento de la Leishmaniasis [81]. Al evaluar la secuencia desde el extremo N-terminal

hacia el C-terminal en el servidor AntiBP Server, se encontraron valores positivos en la

predicción de la acción Antimicrobial para algunos fragmentos. Dichos valores indican la

posible actividad antimicrobiana que está directamente asociada a la secuencia basada

en la información que recolecta el servidor con alrededor de 500 péptidos

antimicrobianos base y una función de base radial junto con un polinomio kernal, que

son propios del software de predicción [82]. En la tabla 1 se muestran los resultados

obtenidos para cada uno de los fragmentos al realizar la evaluación en el servidor. Por

otro lado se realizaron cortes sucesivos de la secuencia original cada 15 residuos

partiendo desde el extremo N terminal, basándonos en los resultados encontrados por

Savoia [60], según el cual secuencia mínima con actividad biológica es de 15 residuos.

A todos los cortes de la secuencia de 15 residuos se les realizó una predicción de la

estructura secundaria con los servidores Scratch Protein Predictor (SPP,

http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6] y Protein Predictor (PP,

http://www.predictprotein.org/) [61] mostrando un valor elevado en la estructura de tipo α-

hélice para la mayoría de los análogos. Como se observa en la tabla 1, el valor

antimicrobial para algunas secuencias es negativo (valores en rojo), lo que nos sugiere

que por predicción dichos fragmentos no poseen carácter antimicrobial.



Resultados y discusión 31

Tabla 1. Estudio bioinformático de Dermaseptina S1

ND Valor no disponible

El valor más elevado de la predicción antimicrobial lo presenta el análogo nombrado

DM1, que también posee un elevado porcentaje helical. La mayoría de los fragmentos

que no poseen acción antimicrobiana por predicción son los que poseen un carácter

catiónico superior a 3 en la secuencia, excepto en las secuencias DM3, DM4, DM7, DM9

y DM10, que a pesar de tener un carácter catiónico, no poseen un valor antimicrobial

aceptable por predicción antimicrobial. El menor valor del carácter antimicrobiano lo

presenta DM20, que corresponde al fragmento con el mayor carácter aniónico en la

secuencia, que en principio estaría de acuerdo a lo reportado para los péptidos, ya que el

primer paso de acción de este tipo de péptidos sugiere la interacción con fosfolípidos de

membrana celular [83], haciendo que para DM20 esta interacción no se realice

efectivamente, lo que genera que la predicción para la secuencia sea negativa. La

selección final de los análogos para ser sintetizados se definió por el alto contenido de α-

hélice y carácter catiónico, que concuerda con la polaridad típica de los péptidos

antimicrobianos, favoreciendo la interacción con la membrana celular y su efecto

inmunomodulador sobre las células. Los resultados de la selección de los análogos son

mostrados en la tabla 2.

Abreviatura Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial

DERMs1 A L W K T M L K K L G T M A L H A G K A A L G A A A D T I S Q G T Q 85.3 4 ND

DM1 A L W K T M L K K L G T M A L 60.0 3 1.367

DM2 L W K T M L K K L G T M A L H 53.3 4 0.402

DM3 W K T M L K K L G T M A L H A 40.0 4 -0.205

DM4 K T M L K K L G T M A L H A G 20.0 4 -0.937

DM5 T M L K K L G T M A L H A G K 66.7 4 0.605

DM6 M L K K L G T M A L H A G K A 60.0 4 0.286

DM7 L K K L G T M A L H A G K A A 46.7 4 -0.401

DM8 K K L G T M A L H A G K A A L 13.3 4 0.075

DM9 K L G T M A L H A G K A A L G 60.0 3 -0.825

DM10 L G T M A L H A G K A A L G A 60.0 2 -0.418

DM11 G T M A L H A G K A A L G A A 60.0 2 0.509

DM12 T M A L H A G K A A L G A A A 40.0 2 -0.880

DM13 M A L H A G K A A L G A A A D 26.7 1 -0.781

DM14 A L H A G K A A L G A A A D T 33.3 1 0.183

DM15 L H A G K A A L G A A A D T I 66.7 1 -1.687

DM16 H A G K A A L G A A A D T I S 60.0 1 -1.230

DM17 A G K A A L G A A A D T I S Q 73.3 0 -0.151

DM18 G K A A L G A A A D T I S Q G 66.7 0 -1.909

DM19 K A A L G A A A D T I S Q G T 60.0 0 -1.636

DM20 A A L G A A A D T I S Q G T Q 60.0 -1 -2.135

SECUENCIA



Tabla 2. Secuencias de los análogos seleccionados para el estudio

El principio estructural fundamental de los PAMs nace en su capacidad de adoptar una

forma en la que los aminoácidos hidrofóbicos y catiónicos son organizados

espacialmente en sectores discretos de la molécula (diseño anfipático). Para las

secuencias seleccionadas y mostradas en la tabla 2, se realizó el diseño anfipático, en

donde se observó la distribución catiónica por una cara de la hélice y una distribución

hidrofóbica para la otra cara. En la figura 3 se muestra la distribución helical de los

aminoácidos para DM1, se puede observar los residuos polares de tipo catiónico en la

parte superior y los residuos de carácter hidrofóbico en la parte inferior de la figura. Este

tipo de distribución anfipática se encontró para la mayoría de los análogos seleccionados,

excepto para DM17, DM19 y DM20, donde la distribución no se da uniformemente y se

presenta una ausencia del carácter catiónico, haciendo que se presente una

conformación polar aniónica por una cara de la hélice y una apolar por la otra cara.

En todas las secuencias seleccionadas se observa un porcentaje helical mayor a 60%, lo

que sugiere que la distribución de tipo anfipática mostrada en la figura 3 para DM1, es

adecuada para todos los análogos e indica la cercanía espacial de cada uno de los

residuos. El tipo de residuo con los cuales existe una mayor interacción y el tamaño de

dichos residuos, también nos brinda una idea aproximada del grado de dificultad que se

puede dar al intentar acoplar un residuo en la síntesis química, y brinda una luz acerca

de la forma en la que la cadena peptídica se va plegando para adquirir su estructura

secundaria de tipo helical.

Abreviatura Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial

DERMs1 A L W K T M L K K L G T M A L H A G K A A L G A A A D T I S Q G T Q 85.3 4 ND

DM1 A L W K T M L K K L G T M A L 60.0 3 1.367

DM5 T M L K K L G T M A L H A G K 66.7 4 0.605

DM6 M L K K L G T M A L H A G K A 60.0 4 0.286

DM9 K L G T M A L H A G K A A L G 60.0 3 -0.825

DM10 L G T M A L H A G K A A L G A 60.0 2 -0.418

DM11 G T M A L H A G K A A L G A A 60.0 2 0.509

DM16 H A G K A A L G A A A D T I S 60.0 1 -1.230

DM17 A G K A A L G A A A D T I S Q 73.3 0 -0.151

DM18 G K A A L G A A A D T I S Q G 66.7 0 -1.909

DM19 K A A L G A A A D T I S Q G T 60.0 0 -1.636

DM20 A A L G A A A D T I S Q G T Q 60.0 -1 -2.135

SECUENCIA


Figura 3. Helical Wheel para DM1

Para la secuencia DM17 y DERMs1 el valor de helicidad es 73.3% y 85.3%

respectivamente, lo cual sugiere que el tipo de distribución helical sea mayor, Aun así,

para DM17 la distribución anfipática no es la mejor (figura 4). Debido a que DM17 no

presenta un carácter catiónico, la distribución de los aminoácidos polares se hace de

manera uniforme, lo que impide que la carga positiva del péptido quede sectorizada hacia

una cara de la hélice.

Figura 4. Helical Wheel para DM17

Este tipo de estudio bioinformático es de gran importancia antes de realizar la síntesis

química de péptidos, ya que permite predecir de alguna manera la estructura secundaria

de las secuencias, la distribución espacial de los aminoácidos y la posible actividad

antimicrobial de los péptidos, convirtiéndose en una valiosa herramienta predictiva para

la construcción de análogos de una secuencia determinada. Es importante resaltar que a

pesar de que los valores de predicción bioinformática en la mayoría de los casos son

Helical Wheel From 1 to 16

Ala 1

Leu 2

Trp 3

Lys 4

Thr 5

Met 6

Leu 7

Lys 8

Lys 9

Leu 10

Gly 11

Thr 12

Met 13

Ala 14

Leu 15

Helical Wheel From 1 to 16

Ala 1

Gly 2

Lys 3

Ala 4

Ala 5

Leu 6

Gly 7

Ala 8

Ala 9

Ala 10

Asp 11

Thr 12

Ile 13

Ser 14

Gln 15



confiables, estos criterios no pueden ser los únicos para la selección de las secuencias

candidatas a síntesis, ya que dichos valores no necesariamente se ajustan a los

resultados reales de las secuencias y solo con la síntesis, caracterización y evaluación

de la actividad biológica para cada secuencia, es posible confirmar o no, los valores

predichos por el estudio bioinformático.

6.2 Síntesis química Fmoc de los análogos seleccionados

La síntesis de todos los análogos se llevó a cabo por tecnología Nα-Fmoc en fase sólida.

Se usó como soporte sólido una resina Rink Amida [84], la cual presentaba un grado de

sustitución de 0,40 mmol/g. La síntesis de los análogos se inició con la adición del primer

aminoácido del extremo C-terminal, para lo cual se realizó el enlace peptídico entre el

grupo carboxilo del aminoácido y el grupo amino de la resina. En todas las secuencias

este primer acople requirió de un segundo ciclo, para lo cual se aumentó el número de

excesos de los activadores y del tiempo de reacción. La razón para que este acople

tenga un mayor grado de dificultad radica en que el soporte sólido es una resina que

tiene propiedades mecánicas específicas, principalmente la capacidad de hincharse y

comprimirse, las cuales por el tamaño relativamente pequeño de la resina y la poca

disponibilidad del sitio amino, hace que requiera mayor esfuerzo para la formación del

primer enlace peptídico junto con mayor tiempo. Para todos los acoples fue necesario

realizar una preactivación con DCC y HOBt en NMP durante 10 minutos, lo cual favorece

que el aminoácido a acoplarse se encuentre activado por el grupo carbonilo para

posteriormente generar el enlace peptídico de una manera más eficiente. En los acoples

que después de un segundo intento no daban la coloración amarilla típica de amino

protegido en la prueba de ninhidrina [62], se aumentaba el numero de excesos a 10.

El primer paso para realizar el enlace peptídico es la activación del grupo carbonilo de

cada aminoácido, dicha activación se realiza mediante la adicción de DCC y HOBt en un

solvente aprótico como es la DMF o NMP. El aminoácido protegido por el grupo Fmoc en

su amino, forma en primer paso un éster, O-acilisourea, que rápidamente se convierte en

N-acilisourea, ésta última insoluble en el medio de reacción. La O-acilisourea formada en


presencia de HOBt forma un éster activo de benzotriazol, que es la especie final que

reacciona con el grupo amino libre disponible para realizar el enlace peptídico. El

mecanismo de reacción entre un aminoácido y el grupo amino de la resina es mostrado

en la figura 5. Para que las reacciones 5a, 5b y 5c se presenten, se deja durante 10

minutos aproximadamente el aminoácido a acoplar con los excesos de los activadores

DCC y HOBt a temperatura ambiente y con agitación constante, tiempo en el cual

empieza a aparecer un precipitado que corresponde a la N-acilisourea formada, que se

muestra en la figura 5b. La conversión de la O-acilisourea a N-acilisourea (figura 5b) es

una reacción lenta y se ve minimizada con la adición de HOBt, para formar el éster activo

de benzotriazol, siendo ésta una reacción rápida (figura 5c) [85].

Después de los pasos de preactivación, reacciones 5a, 5b y 5c, el éster activo de

benzotriazol formado se deja en agitación constante y a temperatura ambiente durante

un tiempo aproximado de 6 horas, en el cual se realiza la reacción de acople entre el

grupo amino libre y el grupo carboxilo activado (figura 5d). Esta reacción se realiza en un

solvente aprotico NMP ó DMF, el cual garantiza que el soporte sólido se encuentre en las

condiciones adecuadas para realizar la reacción.

La remoción del grupo protector amino Fmoc se realiza con lavados de piperidina al 25%

(ó 35%) en DMF durante un corto tiempo. La piperidina es una base que remueve

eficientemente el grupo Fmoc del medio, formando un aducto dibenzofulveno de

piperidina que absorbe fuertemente en la region UV, es soluble y facilmente removible

del medio de reacción mediante varios lavados cortos con DMF [56, 86, 87]. El

mecanismo de desprotección para la posterior remoción del grupo Fmoc es mostrado en

la figura 6. En el paso 6a se muestra el ataque de la piperidina al proton del grupo Fmoc,

formando una especie inestable que rápidamente hace una deslocalización electrónica

para dar los subproductos obtenidos en 6b. En los pasos 6d y 6e se muestra el aducto

final formado entre la piperidina y el grupo Fmoc removido. La remoción del grupo Fmoc

usando piperidina puede ser monitoreada por espectroscopia UV (270-312 nm) [88], ya

que el aducto presentado en 6e es un subproducto que absorbe en la region UV, el

seguimiento de ese aducto es un procedimiento común usado en los sintetizadores de

péptidos automatizados pero no es muy usado en la SPPS manual [56].



Figura 5. Reacciones para la activación de Fmoc-aminoácidos con DCC y HOBt

Para los lavados de remoción de los subproductos con DMF, es muy importante que toda

la piperidina sea removida del medio eficientemente para que no genere reacciones de

desprotección en pasos de la sintesis donde no es adecuado su uso. Ademas de los

lavados con DMF, se hacen lavados con IPA y con DCM para garantizar la remoción de

la piperidina y de los subproductos del medio de reacción. La reacción de desprotección

en todos los casos fue verificada mediante el uso de la prueba de ninhidrina, arrojando

un color azul, confirmando que la reacción de desprotección fue adecuada y que existen

grupos amino libre disponibles para el siguiente paso de la sintesis.

NO

OH

RH

Fmoc H

t-Bu

+N C N N

NH

O

O NH

R

Fmoc

t-Bu

a

Fmoc-Aminoácido diciclohexilcarbodiimida(DCC) O-acilisourea

N

NH

O

O NH

R

Fmoc

t-BuNH

O

N

O

NHR

Fmoct-Bu

b

O-acilisourea N-acilisourea

N

NH

O

O NH

R

Fmoc

t-Bu

+ NN

N

OH

NN

N

O

O R

NH

t-Bu

Fmoc

c

O-acilisourea HOBt éster activo de benzotriazol

NN

N

O

O R

NH

t-Bu

Fmoc+

CH3

NH2

CH3

NH

OR

t-Bu

NHFmoc

d

éster activo de benzotriazol grupo NH2 disponible Acople formado


Figura 6. Mecanismo de desprotección grupo Fmoc

a

b

c

d

NH2

+

+O

NH O

NH

R

O

CH3

O

CH3

O

O

NHPEG

O

C-

+

NH

O

NH O

NH

R

O

CH3

O

CH3

O

O

NHPEG

OH

O

NH O

NH

R

O

CH3

O

CH3

O

O

NHPEG

O

C-

NH- O

NH

R

O

CH3

O

CH3

O

O

NHPEG

CH2

++ OO

CH2

+NH

C-

NH+

NH- O

NH

R

O

CH3

O

CH3

O

O

NHPEG

+NH2

+

NH2O

NH

R

O

CH3

O

CH3

O

O

NHPEG

+NH



e

La sensibilidad de la reacción de ninhidrina como prueba cualitativa y cuantitativa para

determinar aminas primarias es muy alta. En la figura 7 se muestra las reacciones

primordiales para la prueba de ninhidrina con un aminoácido. En los primeros pasos de la

figura 7 se ilustra la reacción del hidrato de ninhidrina con el grupo amino de un

aminoácido, reacción que involucra el desplazamiento de un grupo OH por un grupo NH2

(figura 7b), paso que es determinante en la velocidad de reacción según reportes de

Friedman [89]. Los productos de la reacción de un aminoácido con ninhidrina son CO2

(figura 7c), un aldehído (RCHO) (figura 7d), y un aducto de ninhidrina denominado

purpura de Ruhemann (figura 7f). La etapa 7c corresponde a una descarboxilación que

según reportes no es la etapa determinante de la reacción debido a que esta reacción es

unimolecular y no está sujeta a impedimentos estéricos marcados [89]. La reacción de

ninhidrina se lleva a cabo a 100 ºC durante 5 minutos, tiempo en el cual el hidrato de

ninhidrina en piridina es capaz de reaccionar con el grupo NH2 del aminoácido para

formar un color purpura intenso que corresponde a la formación del aducto mostrado en

la figura 7f. Si en el medio no existe un grupo amino disponible para realizar la reacción,

la solución queda de un color amarillo claro y corresponde a un resultado negativo para

la prueba de ninhidrina. Basados en el mecanismo descrito para la reacción de

ninhidrina, se ha confirmado que la prueba es negativa para aminos unidos directamente

a átomos de carbonos terciarios o para aminas terciarias impedidas estéricamente [89].

Según los resultados esperados para la prueba de ninhidrina, esta reacción se usa en la

síntesis de péptidos para determinar si en el medio de reacción existen grupos NH2

disponibles que aún no hayan formado el enlace peptídico descrito en la figura 7d.

Cuando en el medio el grupo amino se encuentra protegido por el grupo Fmoc, la prueba

de ninhidrina da negativa, pero sí en cambio el grupo amino protegido ha sido sometido a

C-

NH+ N


la etapa de desprotección con piperidina, en el medio se encontraran grupos NH2 libres

que hacen que la prueba de ninhidrina sea positiva dando un color purpura intenso.

Figura 7. Reacciones para la prueba de ninhidrina en presencia de un grupo amino.

Para cada paso de acople y desprotección fue necesario llevar a cabo la prueba de

ninhidrina, la cual era el indicativo cualitativo para evaluar el avance de SPPS. Cada

prueba contó con un blanco, que sirvió como comparativo para calificar la prueba de

ninhidrina. Es importante anotar que para muchos otros compuestos la prueba de

ninhidrina da positiva sin presentar la estructura mostrada en la figura 7f. Entre los

compuestos que presentan la prueba de ninhidrina positiva de forma “anormal” son por

ejemplo los aminoácidos polifuncionales como arginina, asparagina, cisteína y triptófano,

los iminoácidos como la prolina y el ácido pipecólico, las aminas aromáticas como la

anilina, y otros compuestos como la fructosa, ácido levulínico, los iones cianuro entre

O

O

OH

OH

O

O

O + OH2

a

O

O

O +NH2

O

OH

R

O

O

N

O

OHR

+ OH2

b

O

O

N

O

OHR

O

O

N

R

+OO

c

O

O

N

R

OH2+

O

O

NH2

O

RH

+

d

O

O

NH2 +

O

O

O

O

O

N

O

O

+ OH2

e

O

O

N

O

O

O

O

N

O

O

H

f



otros. Este tipo de compuestos presentan reacción de ninhidrina denominada “no clásica”

[89].

La etapa de desanclaje se realiza mediante la adición de TFA (80%-97%) y compuestos

que sean capaces de capturar y eliminar los grupos protectores de cadenas laterales

denominados “scavengers”. Se realiza el desanclaje con el porcentaje adecudado de

TFA y “scavengers” dependiendo de los aminoácidos presentes y grupos protectores de

las cadenas laterales de los aminoácidos. El esquema de desprotección para péptidos

sintetizados mediante técnica Fmoc es mostrado en la figura 8, donde se muestra

claramente la función del TFA y de los “scavengers”. En la figura 8 se muestra el

desanclaje de un pentapéptido con TFA y los “scavengers” necesarios que son Anisol,

EDT, fenol y agua. Dependiendo de la secuencia obtenida se escogen los “scavengers” y

su porcentaje en el desanclaje final [56]. Los péptidos son recogidos sobre éter etílico

frío, con lo que se logra observar la precipitación de un sólido blanco que corresponde al

péptido libre obtenido. Mediante la filtración y lavados con éter etílico al péptido, se

realiza la remoción de las especies formadas entre los diferentes “scavengers” usados en

el desanclaje y los grupos protectores de las cadenas laterales, garantizando la remoción

efectiva de especies no deseadas. El rendimiento promedio calculado para las diferentes

síntesis fue de 74%. Este valor de rendimiento es relativamente alto si se tiene en cuenta

la pérdida de material en cada ensayo de ninhidrina, ya que por cada residuo se deben

hacer como mínimo 2 ensayos de verificación con ninhidrina que son de tipo destructivo.

Los tiempos de reacción para cada análogo de dermaseptina son mostrados en la tabla

3. El mayor tiempo de síntesis fue requerido para el análogo DM18, con un total de 465

horas y 24 ciclos, 9 ciclos más de los 15 ciclos necesarios para completar la síntesis.

Esta dificultad puede explicarse debido a la presencia de glicina en el extremo C-

terminal, que puede adoptar fácilmente una conformación Cis resultando el enlace amida,

lo que hace que la ciclización para formar dicetopiperazinas sea muy probable (ver figura

9) [90, 91].


Figura 8. Esquema de desanclaje de un pentapéptido en medio ácido

Tabla 3. Tiempo total y número de ciclos efectuados para la síntesis de los análogos

TFA:tioanisol:EDT:fenol:agua 82.5:5:2.5:5:5

CH3

NH

O

O

NH

O

CH3

CH3

CH3O

O

O

CH3

CH3

CH3

NH

O

O

NH

NH

O

CH3

CH3

NH

O

NH2

S

OH

O

NH

OH

O

O

OH

NH

O

O

NH2

NH

O

CH3

CH3

NH

O

NH3

+

SH

CH3

CH3

CH3OHF3C

O

O

CH3

CH3

CH3

S+

CH3

CH3

CH3

CH3

S S

Ph

Ph

CH3

CH3

CH3

Ph

Péptido tiempo total (h) Ciclos

DM1 326 17

DM5 409 21

DM6 278 15

DM9 325 17

DM10 326 17

DM11 405 20

DM16 416 21

DM17 440 22

DM18 465 24

DM19 390 20

DM20 330 17



Figura 9. Esquema de formación de dicetopiperazinas, tomado de [92]

Para los diferentes análogos de dermaseptina se presentó una mayor dificultad en los

últimos acoples de las síntesis con el aminoácido Lisina (K). La Lisina debido a su

carácter catiónico presenta efectos de repulsión de carga en la estructura del péptido, lo

que explicaría la dificultad de añadirse a la secuencia peptídica que se está formando. La

dificultad obtenida en los últimos acoples de la síntesis se explica debido al impedimento

estérico que presenta la estructura de los péptidos que van tomando su conformación

helical y la repulsión que generan los residuos, en especial Lisina y Triptófano en la

estructura. Al evaluar los tiempos de reacción para los análogos, se comprobó la

dificultad que tienen los últimos acoples en la síntesis peptídica, ya que necesitan más

tiempo de reacción y se evidenció que para aminoácidos de menor tamaño y de carácter

menos polar, el acople requiere menor tiempo, ver tabla 4. En general los análogos de

dermaseptina presentaron un grado de dificultad elevado con el fragmento de la

secuencia AAA, debido a que el posible plegamiento e interacciones de tipo hidrofóbico

desfavorecen que el nuevo aminoácido llegue efectivamente al punto de reacción.

Podemos observar también que los aminoácidos en mayor proporción dentro de los

análogos de dermaseptina son alanina, leucina y lisina, lo que verifica la alta helicidad de

las secuencias, ya que estos aminoácidos son considerados buenos formadores de

hélice [93].


Tabla 4. Tiempo total y número de ciclos en los análogos de dermaseptina

6.3 Purificación de péptidos

Luego de realizar el desanclaje de los análogos de dermaseptina (figura 8) y los lavados

con éter etílico, el péptido obtenido es disuelto en agua desionizada y congelado a -70 ºC

durante 12 horas. Luego los péptidos son liofilizados durante 24 horas con lo cual se

logra obtener el péptido sólido. Después de la liofilización cada péptido se purifica por

cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa, en donde se obtiene el gradiente

de ACN-AGUA efectivo para la separación de los péptidos en modalidad analítica, que se

usan de igual manera en la modalidad semipreparativa. Al realizar la corrida

cromatográfica se obtuvieron en algunos casos más de dos picos significativos, un

ejemplo se muestra en la figura 10, a tiempo de retención de 17,8 min, 19,0 y a 19,1 min

para el análogo DM11. La presencia de los tres picos en el cromatograma posiblemente

se debe a subproductos de la reacción o a una posible deleción en uno de los acoples, lo

cual es confirmado después por masas. Las corridas cromatográficas para la mayoría de

los análogos muestran un único pico que corresponde al péptido obtenido, el cual es

verificado por espectrometría de masas MALDI-TOF y discutido más adelante. Los

tiempos de retención para cada pico representativo de los análogos son mostrados en la

tabla 5. Para la mayoría de los análogos se encontraron tiempos de retención

relativamente similares y cercanos a 18 min haciendo corridas cromatográficas en

Aminoácido tiempo (h) Ciclos

A 1235 65

G 721 35

L 578 28

K 385 20

T 321 17

M 200 10

H 132 7

D 81 5

I 150 8

Q 180 9

S 109 6

W 18 1



modalidad analítica, los cuales sirvieron para la posterior corrida en modalidad

semipreparativa. Para las corridas de DM5, DM11, DM17 y DM19 se encontraron más de

un pico representativo (valores mostrados en verde), los cuales fueron separados por

HPLC en modalidad semipreparativa y analizados por espectrometría de masas.

Es importante resaltar que para todos los análogos de dermaseptina a pesar de

encontrar un solo pico por HPLC, todos fueron recolectados en modalidad

semipreparativa y las fracciones recolectadas fueron liofilizadas y conservadas en un

desecador para los estudios posteriores. El mayor tiempo de retención se encontró para

DM1, lo cual no es lógico inicialmente, ya que es uno de los péptidos con carga

relativamente alta (+3), lo que indica una mayor polaridad comparado con otras

secuencias. Esta diferencia se puede explicar por medio de la rueda helical (helical

wheel) para DM1 (figura 3), la cual muestra claramente una buena organización de los

residuos apolares sobre una de las caras de la hélice y cuenta con la ventaja de tener un

residuo heterocíclico aromático apolar como el W, el cual aumenta el efecto de

disminución de la polaridad sobre toda la secuencia debido a su tamaño y disposición

sobre la hélice.

Figura 10. Corrida cromatográfica en fase reversa para DM11

min17 18 19 20 21

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

VWD1 A, Wavelength=220 nm (DERMASEPTINAS\DM11000001.D)

17.

809

19.

004

19.

131

20.

503


Tabla 5. Tiempos de retención y pico de masas para los análogos de dermaseptina

Abreviatura tRa MH

+b MH

+c

DM1 21,566 1705,4 1704,047

DM5 16,586 1600,2 1599,140

DM6 18,176 1570,2 1568,955

DM9 18,386 1438,9 1438,071

DM10 18,301 1381,8 1380,937

DM11 19,131 1339,8 1339,135

DM16 18,644 1353,7 1353,130

DM17 15,276 1344,7 1545,156

DM18 15,473 1330,6 1330,077

DM19 18,634 1374,7 1274,893

DM20 15,566 1374,7 1374,069 a tR es el tiempo de retención en minutos determinado por RP-HPLC analítica.

b El pico de masas (MH+) calculado con valores de literatura. C El pico de masas (MH+) fue obtenido por MS MALDI-TOF.

6.4 Caracterización de péptidos

6.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF

Las señales obtenidas por espectrometría de masas se resumen en la tabla 5. Se

observan las masas para los diferentes iones moleculares. Debido al tipo de técnica es

posible encontrar dichos iones sin presentar una fragmentación de la muestra. Para los

análogos DM17 y DM19 no se encontró el pico de ion molecular con la masa que

indicaba la secuencia adecuada (valores en rojo tabla 5). Para DM17 se encontró el pico

de m/z de 128.129 que posiblemente corresponde a la ciclización intramolecular de la

glutamina N-terminal que conlleva a la formación de residuos de ácido piroglutámico

mostrados en la figura 11 [94]. De igual manera se encontró un pico de m/z de 287.273

para DM19 que es igualmente explicado por la ciclización intramolecular de la glutamina

en el extremo N-terminal. Aunque la formación de piroglutámico en Fmoc normalmente

no se presenta debido a las condiciones básicas que se mantienen a lo largo de la

síntesis [95], esta puede ocurrir lentamente a pH básico o neutro y se favorece en

condiciones ácidas [96]. La adición de HOBt como activador en la síntesis, pudo generar



que el pH del medio de reacción se acidificara a tal punto que la ciclización intramolecular

en estas dos secuencias se favoreciera. [97].

Figura 11. Formación de piroglutámico a partir de glutamina

La mayoría de péptidos sintéticos tienden a formar aductos salinos en la placa donde se

siembra la muestra para MALDI-TOF. Los aductos de los péptidos que se encuentran

comúnmente son los formados por iones como sodio Na+ (+22 Da), potasio K+ (+38 Da)

y los aductos múltiples formados por Na+ K+ (+30 Da) [96]. Estos aumentos en la

relación m/z por parte de los iones sodio y de los iones potasio en todos los péptidos fue

encontrada. En general, los picos de ión molecular en los análogos de dermaseptina,

excepto en DM17 y DM19, indican que la síntesis química de los péptidos se llevó en

gran medida de manera adecuada, permitiendo obtener las secuencias peptídicas

deseadas.

En la figura 12 se muestra el espectro de masas MALDI-TOF para la DM1. Se puede

observar un pico en m/z en 1775.111 que corresponde a un pico con masa +71.064 con

respecto a la secuencia de DM1, que posiblemente es debido a la adición de un residuo

de alanina dentro de la secuencia. En la secuencia DM1 (ALWKTMLKKLGTMAL) están

presentes 2 residuos de alanina, una al comienzo de la secuencia y otra al final. Cuando

se estaba acoplando la primera alanina que corresponde a la más cercana del extremo

C-terminal, esta presentó problemas en el primer ciclo y tuvo que montarse con un nuevo

ciclo, pero lamentablemente el nuevo ciclo se realizó al día siguiente, lo que pudo

favorecer que parte del grupo protector Fmoc se haya retirado del extremo amino, para

que posteriormente llegara una nueva alanina a formar un nuevo acople, formando así la

posible secuencia (ALWKTMLKKLGTMAAL) con la alanina que ingresa en el segundo

ciclo.

O

O

NH2

OH

NH2

-NH3

O

ONH

OH

Glutamina Acido piro-glutámico


Figura 12. Espectro de masas MALDI-TOF para DM1

Es importante anotar que el desprendimiento del grupo Fmoc se lleva a cabo bajo

condiciones básicas, y que esta se pudo ver favorecida si el soporte sólido no se

encontraba totalmente seco cuando se dejo para el segundo ciclo, que corresponde a un

tiempo relativamente largo, y que si a eso se le suma que el pH del medio fue

relativamente básico, se favorece la desprotección. Es importante resaltar que la

intensidad del pico de m/z 1775.111 es muy superior al encontrado para DM1 con m/z

1704.047 debido a que la especie 1775.111 posee una mayor facilidad para ionizarse por

MALD-TOF, pero que dichas intensidades de las señales no me da un indicativo de la

concentración de la especie, lo que si hacen los cromatogramas de HPLC, lo cual se

discutió anteriormente.

En la figura 13 se presentan los espectros de masa MALDI-TOF para todos los análogos

de dermaseptina. En cada uno de los espectros se logró identificar la señal que

corresponde a la secuencia del análogo, las cuales se resumen en la tabla 5, excepto

para los análogos DM17 y DM19. También se logró identificar la mayoría de las señales

presentes en todos los espectros, debidas a la adición o deleción de ciertos residuos, a



ciclizaciones y a otros fenómenos ocurridos en la síntesis, las cuales se resumen en la

tabla 6. En la tabla 6 se muestran las variaciones en la relación m/z encontradas para los

análogos de dermaseptina, en donde se puede observar que algunos análogos de

dermaseptina aún contienen estructuras propiamente debidas al desanclaje final.

Figura 13. Espectros de masas MALDI-TOF para análogos de dermaseptina

DM5 DM6

DM9 DM10

DM11 DM16

DM5 DM6

DM9 DM10

DM11 DM16


Tabla 6. Variaciones más comunes de m/z encontradas para los análogos de

dermaseptina

DM17 DM18

DM19

DM20

DM19 DM20

Variación en masa

promedioVariación debida a:

±71.09 Alanina (A)

-57.07 Glicina (G)

137.16 Histidina (H)

113.17 Isoleucina (I)

±128.19 Lisina (K)

113.17 Leucina (L)

128.14 Glutamina (Q)

87.09 Serina (S)

- 101.12 Treonina (T)

200.46 Aducto HMP (hidroximetilfenil)/TFA

93.20 1,2-etanoditiol (EDT)

22.05 Sodio (Na+)

38.00 Potasio (K+)

60.05 Sodio Potasio (Na+K+)

56.18 t-butyl (tBu)

-17.20 Acido piroglutamico de Q

32.13 Oxidación de M

162.07 Fmoc unido a péptido

44.93 disodio (Na+Na+)

96.87 Trifluoroacetil (TFA)

117.45 Éster de Hidroxibenzotriazol (HOBt)



6.4.2 Dicroísmo circular

Se realizó dicroísmo circular para cada uno de los análogos sintetizados, y se encontró

para todas las secuencias que el porcentaje de estructura en α-hélice es el mayoritario

comparado con los demás porcentajes de las conformaciones de estructura secundaria

(ver tabla 7). Al comparar los valores de predicción de la estructura secundaria por medio

bioinformático (ver tabla 2) con los valores obtenidos por dicroísmo circular (ver tabla 7),

se encuentra que en la mayoría de las secuencias, excepto en DM6, DM9, DM17 y

DM20, el porcentaje de α-hélice encontrado por dicroísmo circular es superior al de la

predicción bioinformática. Estos resultados demuestran que la mayoría de análogos de

dermaseptina como se había descrito por bioinformática, adoptan una estructura de tipo

helical, y que muy posiblemente esta conformación favorece la formación de hélices

anfipáticas mencionadas y evaluadas anteriormente por medios bioinformáticos. El

menor valor de de helicidad lo presentó DM9, encontrando también que es uno de los

que tiene mayor porcentaje de estructura al azar junto con DM20. Esto se podría explicar

de alguna manera con la hidrofobicidad de los residuos y el desfavorecimiento de la

hélice de tipo anfipática para estas dos secuencias. Por otro lado se puede observar que

para análogos de dermaseptina las conformaciones de tipo hojas beta y giros no son

favorecidos debido a que los residuos presentes en la secuencia no permiten este tipo de

conformación.

Al observar los datos de la tabla 7, se observa que no existen datos para la secuencia

DM19, esto es debido a que el dicroísmo circular de esta secuencia no es posible

calcularla con el programa CONTINLL que trae incorporado el equipo. Sin embargo, al

observar el espectro de dicroísmo circular (figura 14j) se observa la misma tendencia del

espectro para secuencias helicales (figura 14a, 14b y 14f), lo que demuestra que

posiblemente la conformación de la estructura secundaria para el péptido DM19 es

igualmente helical. En la figura 14 se muestran los espectros para los análogos de

dermaseptina. En los espectros se observan los dos mínimos de la curva de dicroísmo,

uno cercano a los 205 nm y el otro sobre 225 nm, que indican el carácter de organización

en forma helical de los péptidos, que es observable para todos los espectros DC de los

análogos prácticamente en igual proporción. Todos los espectros fueron corridos en agua

con 30% de TFE.


Tabla 7. Estructura secundaria de los análogos de dermaseptina por dicroísmo circular

con el programa CONTINLL

SD: Sin deconvolución

Se puede observar que todos los espectros presentan la misma tendencia debida a

estructuras de tipo helical, y al posible efecto que tiene el trifluoroetanol en la estructura

de algunos péptidos (figura 14). Este cosolvente ayuda a estabilizar la hélice α debido

posiblemente a que su constante dieléctrica es relativamente baja (26.69) comparada

con la del agua (78.50) [98] y posee un momento dipolar alto, lo cual promueve el

plegamiento de la cadena peptídica, favoreciendo así la formación de puentes de

hidrógeno intramoleculares que estabilizan la hélice. Este posible plegamiento debido al

favorecimiento de los puentes de hidrógeno intramoleculares en el péptido, hacen que el

agua sea expulsada de los alrededores del péptido [99], acompañado con una

disminución de la constante dieléctrica del medio [100]. En varios estudios se ha

encontrado que para péptidos en agua con concentraciones mayores o iguales de 30%

de TFE, se favorece la interacción hidrofóbica entre parte de las cadenas laterales de

ciertos residuos lo que conlleva al plegamiento de la estructura secundaria del péptido

[101, 102].

Péptido % Hélice% Hojas

beta% Giro % Al azar

DM1 98.1 1.8 0.0 0.1

DM5 100.0 0.0 0.0 0.0

DM6 55.5 2.4 14.4 27.7

DM9 41.5 4.8 18.2 35.5

DM10 85.8 0.0 1.1 13.1

DM11 100.0 0.0 0.0 0.0

DM16 77.3 2.6 5.9 14.2

DM17 42.1 0.5 24.8 32.6

DM18 74.4 0.0 0.0 25.6

DM19 SD SD SD SD

DM20 48.6 0.0 3.9 47.5



Figura 14. Espectros de DC para análogos de dermaseptina

a b

c d

e f

-3.00E+05

-1.00E+05

1.00E+05

3.00E+05

5.00E+05

190 200 210 220 230 240 250 260

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM1

-2.00E+05

-1.00E+05

0.00E+00

1.00E+05

2.00E+05

190 200 210 220 230 240 250 260

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM5

-1.32E+05

-8.80E+04

-4.40E+04

0.00E+00

4.40E+04

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM6

-1.50E+05

-1.00E+05

-5.00E+04

0.00E+00

5.00E+04

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM9

-2.00E+05

-1.00E+05

0.00E+00

1.00E+05

2.00E+05

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM10

-2.00E+05

-1.00E+05

0.00E+00

1.00E+05

2.00E+05

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM11

-3.00E+05

-2.00E+05

-1.00E+05

0.00E+00

1.00E+05

2.00E+05

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM16

-8.00E+04

-6.00E+04

-4.00E+04

-2.00E+04

0.00E+00

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM17

g h

i j

k

-4.80E+05

-1.80E+05

1.20E+05

4.20E+05

7.20E+05

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM19

-3.00E+05

-2.00E+05

-1.00E+05

0.00E+00

1.00E+05

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM18

-1.50E+05

-1.00E+05

-5.00E+04

0.00E+00

5.00E+04

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM20


6.5 Ensayos biológicos

6.5.1 Ensayo de hemólisis

En este estudio se encontró que todos los análogos de dermaseptina evaluados

presentan baja actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos. Los datos son

presentados en la tabla 8, en la cual se observa que la concentración hemolítica media

(HC50) para todos los péptidos es superior a la concentración máxima del estudio (200

μg/mL). En la cuarta columna se observan los porcentajes de hemólisis a la máxima

concentración del estudio calculados para cada secuencia. El mayor efecto hemolítico lo

genera DM17 (6.16%), seguido de DM20 (5.61%) y DM5 (4.99%), en donde DM17 y

DM20 tienen un efecto mínimo sobre los glóbulos rojos, lo cual es conveniente para la

acción de los péptidos sobre células humanas. De los 3 péptidos que presentaron el

mayor efecto hemolítico, el menor efecto lo muestra DM5, posiblemente a que su carga

total es +4, la cual es mayor a la de DM17 (0) y DM20 (-1), lo que dificulta la interacción

de tipo electrostática con el glóbulo rojo.

g h

i j

k

-4.80E+05

-1.80E+05

1.20E+05

4.20E+05

7.20E+05

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM19

-3.00E+05

-2.00E+05

-1.00E+05

0.00E+00

1.00E+05

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM18

-1.50E+05

-1.00E+05

-5.00E+04

0.00E+00

5.00E+04

190 210 230 250

Elli

p. M

ol

Wavelength (nm)

DM20



Los controles usados en el estudio fueron eritrocitos diluidos en solución salina sin

exposición a ninguna sustancia que corresponden al control negativo o 100% de

viabilidad y eritrocitos expuestos a agua destilada estéril considerado como control

positivo el cual genera el 100% de hemólisis. Aparte de los péptidos se evaluó el carácter

hemolítico que presentan la pentamidina y el péptido CLIP, los cuales corresponden a un

medicamento de elección para el tratamiento de la LC en varios países y a la cadena

peptídica invariable naturalmente cargada en el complejo mayor de histocompatibilidad

(CMH) respectivamente. A la máxima concentración de los péptidos evaluada, se

encontraron porcentajes de hemólisis inferiores al 6.16% con HC50 superiores a

200μg/mL.

Tabla 8. Actividad hemolítica y citotóxica de los péptidos sobre eritrocitos y monocitos de

sangre periférica humana respectivamente. La concentración media Hemolítica (HC50) y

la concentración letal media (CL50) expresada en μg/mL

Péptido HC50 (μg/mL)CL50 en DC

(μg/mL)

% hemólisis a la

máxima

concentración

DM1 >200 >200 1.82

DM5 >200 >200 4.99

DM6 >200 >200 2.15

DM9 >200 >200 1.47

DM10 >200 >200 2.65

DM11 >200 >200 1.05

DM16 >200 >200 1.80

DM17 >200 >200 6.16

DM18 >200 >200 2.03

DM19 >200 >200 2.05

DM20 >200 >200 5.61

Pentamidina > 10 > 10 < 1

Clip >200 >200 < 1


6.5.2 Ensayo de citotoxicidad

El efecto citotóxico sobre células monocitos de sangre periférica humana fue mínimo en

todos los péptidos evaluados, lo cual se reporta en la tabla 8. Estos resultados muestran

que los análogos de dermaseptina pueden llegar a ser usados como herramienta

terapéutica, ya que a concentraciones relativamente altas (>200 μg/mL) no se genera

citotoxicidad sobre células humanas sanas. La posibilidad del uso de estos análogos

como posible tratamiento contra LC, es viable solo para aquellas secuencias activas

contra el parasito, sin efectos sobre células humanas a las concentraciones de péptido

de uso terapéutico.

A las máximas concentraciones evaluadas para cada uno de los péptidos, la citotoxicidad

sobre monocitos de sangre periférica humana fue mínima calculándose CL50 superiores

a 200μg/mL. Estos datos se muestran en la tabla 8.

6.5.3 Ensayos de efectividad sobre promastigotes de L. panamensis

De los péptidos evaluados, sólo se detectó actividad leishmanicida contra promastigotes

de L. panamensis en un péptido, el análogo denominado DM1. Para este péptido, la

CE50 hallada fue de 151,9μg/mL con R2 superior a 0.9 para todos los casos, ver tabla 9.

Al observar los valores de la eficacia sobre L. panamensis presentados en la tabla 9, se

puede observar que la pentamidina presenta una concentración media efectiva casi 100

veces menor (EC50<1,25μg/mL) comparado con el único análogo activo contra L.

panamensis DM1 (EC50=151,9μg/mL), lo que indica que este medicamento es más

activo contra la especie de Leishmania, pero es importante resaltar que esa efectividad

del medicamento no es selectiva contra el parasito. La pentamidina, tiene un efecto

compartido para promastigotes y amastigotes, lo cual favorece los protocolos

experimentales, a diferencia de las sales antimoniales como el antimoniato de

meglumina, que al ser un profármaco, sólo resulta efectivo sobre las formas

intracelulares del parásito [33, 103]. El isotianato de pentamidina, se ha convertido en el

medicamento de elección para el tratamiento de la LC en varios países donde la

enfermedad es endémica, presentando una eficacia muy similar a los antimoniales

pentavalentes pero con una incidencia menor de efectos adversos, lo cual se ha



evaluado también en Colombia [33, 75-77]. Esa incidencia menor de los efectos adversos

que presenta la pentamidina no es comparable con la posible incidencia del usó de

péptidos con acción biológica, ya que estos efectos adversos se ven disminuidos al

máximo [104]. Por eso, a pesar de que DM1 tiene una CE50 mayor comparado con la

CE50 de la pentamidina, esto no indica que la secuencia DM1 se pueda convertir en una

mejor alternativa para el tratamiento de la LC causada por promastigotes de L.

panamensis.

Tabla 9. Eficacia de los análogos de dermaseptina sobre promastigotes de L.

panamensis. La concentración media efectiva (EC50) es expresada en μg/mL.

La curva de viabilidad de L. panamensis vs la concentración empleada de DM1 se

presenta a continuación (figura 15). Se puede observar que la concentración efectiva

para llevar al 50% de supervivencia del parasito es cercana a 151,9μg/mL. La figura 15

muestra que no existe un efecto importante sobre la supervivencia del parasito a las

concentraciones bajas de DM1 en el estudio, pero cuando la concentración del péptido

aumenta, dicho efecto aumenta drásticamente, indicando que el péptido a

concentraciones superiores a 150μg/mL tiene un efecto alto sobre la supervivencia del

parasito.

Péptido

EC50

Leishmania

panamensis

(μg/mL)

DM1 151.9

DM5 >200

DM6 >200

DM9 >200

DM10 >200

DM11 >200

DM16 >200

DM17 >200

DM18 >200

DM19 >200

DM20 >200

Pentamidina < 1,25

Clip >200


Figura 15. Efecto de la concentración de DM1 sobre la supervivencia de L. panamensis

La diferencia entre DM1, que corresponde al análogo de dermaseptina activo contra L.

panamensis y los demás análogos, se encuentra básicamente en la región inicial de la

secuencia, que corresponde al extremo amino de la secuencia. La DM1 al igual que la

secuencia dermaseptina S1 son activas contra la forma extracelular del parasito [81] y

poseen un residuo de triptófano (W) invariante en la posición 3, que básicamente es el

característico en la familia de dermaseptinas [105]. La única que posee ese residuo

invariante al inicio de su secuencia es el análogo DM1, y que se ve favorecido aún más

por la carga neta de la molécula. Al evaluar la hidrofobicidad de los análogos de

dermaseptina según la escala de Kyte y Doolittle [106], se puede apreciar la distribución

hidrofóbica e hidrofílica de cada análogo, los cuales se presentan como gráficos en la

figura 16. Al observar la distribución de hidrofobicidad para DM1, se puede observar

claramente que es diferente a los demás análogos evaluados, DM1 presenta al inicio de

la secuencia dos regiones de carácter hidrofílico totalmente definidas que son debidas a

los residuos iniciales W, K y T que no están presentes en ningún otro análogo en el

extremo N-terminal. La distribución de la hidrofobicidad de los demás análogos no es

totalmente definida como si lo es en DM1, lo que sumado a la presencia de una hélice

totalmente definida de carácter anfipático, hace que esta distribución de la hidrofobicidad

a lo largo de la secuencia, posiblemente genere un resultado global sobre la acción de

los análogos de dermaseptina al ser enfrentados con promastigotes de L. panamensis.

Para el caso de DM5, DM17 y DM20 que corresponden a las secuencias que arrojaron la

actividad hemolítica superior comparado con los demás péptidos, se puede observar en

la figura 16, que la distribución hidrofílica de estos péptidos esta favorecida hacia el

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

% Su

perv

ivenc

ia

Concentración de DM1 / (μg/mL)



extremo C-terminal de la secuencia, y que además el carácter hidrofóbico de los residuos

no está totalmente definido si se compara con DM1. Esta posible distribución hidrofílica

desplazada hacia el extremo C-terminal, puede afectar de alguna manera la interacción

con el glóbulo rojo, y de alguna manera aumentar la lisis del eritrocito debido a su

interacción con el péptido.

Figura 16. Gráfico de la distribución de la hidrofobicidad por aminoácido para los

análogos de dermaseptina.

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

A L W K T M L K K L G T M A L

Hid

rofo

bic

idad

DM1

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

T M L K K L G T M A L H A G K

Hid

rofo

bic

idad

DM5

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

M L K K L G T M A L H A G K A

Hid

rofo

bic

idad

DM6

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

K L G T M A L H A G K A A L G

Hid

rofo

bic

idad

DM9

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

L G T M A L H A G K A A L G A

Hid

rofo

bic

idad

DM10

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

G T M A L H A G K A A L G A A

Hid

rofo

bic

idad

DM11

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

H A G K A A L G A A A D T I S

Hid

rofo

bic

idad

DM16

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

A G K A A L G A A A D T I S Q

Hid

rofo

bic

idad

DM17

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

G K A A L G A A A D T I S Q G

Hid

rofo

bic

idad

DM18

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

K A A L G A A A D T I S Q G T

Hid

rofo

bic

idad

DM19

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

A A L G A A A D T I S Q G T Q

Hid

rofo

bic

idad

DM20


Aunque estos resultados no establecen claramente un mecanismo de acción de los

péptidos sobre las formas del parasito, ni lo intentan establecer, dicho mecanismo puede

estar asociado con una actividad dual (sinérgica) de los péptidos, incluyendo la

distribución de los residuos a través de una estructura secundaria totalmente definida que

logre su acción sobre las células del huésped y/o en el parasito. Para poder potencializar

el uso de los péptidos con actividad antileishmanial en medicamentos que traten la

enfermedad, se requiere de estudios adicionales, incluyendo modificaciones químicas de

los péptidos sintéticos para aumentar su efecto contra la Leishmaniasis. En el caso del

presente proyecto, estas modificaciones deben estar enfocadas en el inicio de la

secuencia de dermaseptina (extremo N-terminal), logrando con la variación de algunos

residuos aumentar su acción leishmanicida selectiva contra promastigotes de L.

panamensis. La estructura secundaria de cada uno de los análogos de Dermaseptina

juega un papel importante en la actividad contra el parasito, en la cual un mayor

porcentaje de estructura de tipo helical no necesariamente proporciona una mayor acción

antileishmanial, pero la distribución de los residuos en la secuencia si logran de alguna

manera aumentar dicha acción. También se encontró que un mayor carácter catiónico

con distribución anfipática e hidrofóbica en la secuencia, favorece la interacción con

membrana celular y favorece la acción leishmanicida sobre L. panamensis.

Al evaluar los resultados obtenidos para los análogos de dermaseptina, se pueden

sugerir modificaciones de la secuencia activa contra el parasito DM1, e intentar predecir

por medio de herramientas bioinformáticas su estructura secundaria, carga total y

distribución de la hidrofobicidad a través de una posible estructura helical anfipática. En

la tabla 10 se presentan algunas modificaciones del análogo DM1, las cuales cumplen las

características encontradas para un posible péptido activo contra Leishmania. Todos

conservan un porcentaje de helicidad superior al 53%, una carga total positiva superior a

+3 y presentan un valor de carácter antimicrobial comparable con el calculado para DM1.

Se muestran en rojo los residuos modificados en la secuencia original del análogo DM1.

Es importante resaltar que todos los análogos modificados conservan una distribución

hidrofóbica favorable en la totalidad de la secuencia, e intentan mejorar de alguna

manera la distribución de los residuos en la hélice anfipática.



Tabla 10. Secuencias de análogos modificados de DM1

Secuencia Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial

GLWKTMLKKLGTMAL 60.0 3 1.940

KLWKTMLKKLGTMAL 60.0 4 1.110

LWKTMLKKLGTMALH 53.3 4 0.402

ALWKTMLKKLGTWAL 60.0 3 1.286

ALWKTWLKKLGTMAL 60.0 3 1.354

GLWKTWLKKLGTWAL 60.0 3 1.853

7. Conclusiones

Se logró estandarizar las condiciones necesarias para sintetizar análogos de

Dermaseptina S1 por SPPS mediante metodología Fmoc.

Se logró determinar la estructura secundaria de los análogos sintetizados y

compararla con datos obtenidos por predicción bioinformática, encontrando alta

correlación entre los valores experimentales y los obtenidos por medio

bioinformático.

Los análogos de Dermaseptina evaluados muestran baja actividad hemolítica y

citotóxica sobre eritrocitos humanos de donantes sanos grupo O Rh positivo y

monocitos de sangre periférica respectivamente.

De los péptidos evaluados, el único péptido que presentó actividad selectiva

contra promastigotes de L. panamensis fue DM1, lo cual es un indicio de su

potencial actividad antimicrobiana contra esta especie del parásito Leishmania.

Se encontró que la que la concentración efectiva media para DM1 contra L.

panamensis es de 151,9μg/mL, a partir de la cual existe un efecto elevado sobre

la supervivencia del parasito bajo la acción del péptido.

Se logró establecer una relación directa entre la estructura secundaria de los

péptidos y la distribución hidrofóbica de ciertos residuos a lo largo de la cadena

con la acción leishmanicida de los análogos evaluados contra promastigotes de

L. panamensis.

Los resultados obtenidos en este proyecto son de gran utilidad para diseñar y

sintetizar péptidos cortos que sean usados como nuevos fármacos contra la



leishmaniasis y se conviertan en una alternativa para combatir los efectos

adversos que conllevan los tratamientos actuales

Bibliografía

1. Carpino LA, Han GY: The 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting

group. Journal of Organic Chemistry 1972, 37(22):3404-3409.

2. Hancock REW, Sahl HG: Antimicrobial and host-defense peptides as new

anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology 2006, 24(12):1551-

1557.

3. McGwire BS, Kulkarni MM: Interactions of antimicrobial peptides with

Leishmania and trypanosomes and their functional role in host parasitism.

Experimental Parasitology 2010, 126(3):397-405.

4. Yang D, Biragyn A, Hoover DM, Lubkowski J, Oppenheim JJ: Multiple roles of

antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in

host defense. In: Annual Review of Immunology. vol. 22; 2004: 181-215.

5. Hale JDF, Hancock REW: Alternative mechanisms of action of cationic

antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy

2007, 5(6):951-959.

6. Scratch Protein Predictor [http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/]

7. Tellez G, Castaño, J: Peptidos antimicrobianos. In: Revista Infectio. vol. 14;

2010: 56 – 67.

8. Massachusetts General Hospital HU: Peptide Database. In., vol. 2011.

Massachusetts; 2009.

9. Scott MG, Hancock REW: Cationic antimicrobial peptides and their

multifunctional role in the immune system. Critical Reviews in Immunology

2000, 20(5):407-431.

10. Hancock RE: Cationic peptides: Effectors in innate immunity and novel

antimicrobials. Lancet Infectious Diseases 2001, 1(3):156-164.

11. Díaz-Achirica P, Ubach J, Guinea A, Andreu D, Rivas L: The plasma membrane

of Leishmania donovani promastigotes is the main target for CA(1-8)M(1-18),

a synthetic cecropin A-melittin hybrid peptide. Biochemical Journal 1998,

330(1):453-460.




12. Cobb SL, Denny PW: Antimicrobial peptides for leishmaniasis. Current

Opinion in Investigational Drugs 2010, 11(8):868-875.

13. Leishmaniasis [http://www.who.int/leishmaniasis/en/]

14. Croft SL, Sundar S, Fairlamb AH: Drug resistance in leishmaniasis. Clinical

Microbiology Reviews 2006, 19(1):111-126.

15. Hani K, Zairi A, Tangy F, Bouassida K: Dermaseptins and magainins:

Antimicrobial peptides from frogs' skin-new sources for a promising

spermicides microbicides-a mini review. Journal of Biomedicine and

Biotechnology 2009, (2009): 1-8.

16. Pérez J, Lozano, J., Cortés, J., Orjuela, G: Potencial Leishmanicida de

péptidos sintéticos con actividad antimicrobiana. In: XXIX Congreso

latinoamericano de química. Colombia; 2010.

17. Alvar J: Leishmaniasis and AIDS co-infection: The Spanish example.

Parasitology Today 1994, 10(4):160-163.

18. Alvar J, Cañavate C, Gutiérrez-Solar B, Jiménez M, Laguna F, López-Vélez R,

Molina R, Moreno J: Leishmania and human immunodeficiency virus

coinfection: The first 10 years. Clinical Microbiology Reviews 1997, 10(2):298-

319.

19. Momen H, Cupolillo E: Speculations on the Origin and Evolution of the Genus

Leishmania. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 2000, 95(4):583-588.

20. Reithinger R, Dujardin JC, Louzir H, Pirmez C, Alexander B, Brooker S:

Cutaneous leishmaniasis. Lancet Infectious Diseases 2007, 7(9):581-596.

21. Boelaert M, Criel B, Leeuwenburg J, Van Damme W, Le Ray D, Van Der Stuyft P:

Visceral leishmaniasis control: A public health perspective. Transactions of

the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2000, 94(5):465-471.

22. Bern C, Maguire JH, Alvar J: Complexities of assessing the disease burden

attributable to leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases 2008, 2(10).

23. Molina R, Gradoni L, Alvar J: HIV and the transmission of Leishmania. Annals

of Tropical Medicine and Parasitology 2003, 97(SUPPL. 1).

24. Croft SL, Barrett MP, Urbina JA: Chemotherapy of trypanosomiases and

leishmaniasis. Trends in Parasitology 2005, 21(11):508-512.

http://www.who.int/leishmaniasis/en/

Bibliografía 65

25. Kedzierski L: Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today? Journal of Global

Infectious Diseases 2010, (2)2:177–185.

26. Organization WH: Lead discovery for infectious tropical diseases. In.: World

Health Organization; 2009, BL3.08:1-44.

27. Natera S, Machuca C, Padrón-Nieves M, Romero A, Díaz E, Ponte-Sucre A:

Leishmania spp.: proficiency of drug-resistant parasites. International Journal

of Antimicrobial Agents 2007, 29(6):637-642.

28. Tiuman TS, Santos AO, Ueda-Nakamura T, Filho BPD, Nakamura CV: Recent

advances in leishmaniasis treatment. International Journal of Infectious

Diseases 2011, 15(8):e525-e532.

29. Loiseau PM, Bories C: Recent strategies for the chemotherapy of visceral

leishmaniasis. Current Opinion in Infectious Diseases 1999, 12(6):559-564.

30. Berman J: Current treatment approaches to leishmaniasis. Current Opinion in

Infectious Diseases 2003, 16(5):397-401.

31. Grevelink SA, Lerner EA: Leishmaniasis. Journal of the American Academy of

Dermatology 1996, 34(2 I):257-272.

32. Saravia NG, Nicholls RS: Leishmaniasis: a public health challenge that

demands concerted effort and will (editorial). Leishmaniasis: un reto para la

salud pública que exige concertación de voluntades y esfuerzos 2006, 26 Suppl

1:7-9.

33. Soto-Mancipe J, Grogl M, Berman JD: Evaluation of pentamidine for the

treatment of cutaneous leishmaniasis in Colombia. Clinical Infectious

Diseases 1993, 16(3):417-425.

34. Arruebo M, Fernández-Pacheco R, Ibarra MR, Santamaría J: Magnetic

nanoparticles for drug delivery. Nano Today 2007, 2(3):22-32.

35. Kiss G, Michl H: Uber das Giftsekret der Gelbbauchunke, Bombina variegata

L. Toxicon 1962, 1(1):33-34.

36. Habermann E: Bee and wasp venoms. Science 1972, 177(4046):314-322.

37. Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, Boman HG: Insect immunity. Purification

and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of

immunized pupae of Hyalophora cecropia. European Journal of Biochemistry

1980, 106(1):7-16.



38. Nakamura T, Furunaka H, Miyata T, Tokunaga F, Muta T, Iwanaga S, Niwa M,

Takao T, Shimonishi Y: Tachyplesin, a class of antimicrobial peptide from the

hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus). Isolation and

chemical structure. Journal of Biological Chemistry 1988, 263(32):16709-16713.

39. Zasloff M: Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin:

Isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of

a precursor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America 1987, 84(15):5449-5453.

40. Ganz T, Selsted ME, Szklarek D: Defensins. Natural peptide antibiotics of

human neutrophils. Journal of Clinical Investigation 1985, 76(4):1427-1435.

41. De Lucca AJ, Walsh TJ: Antifungal peptides: Novel therapeutic compounds

against emerging pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1999,

43(1):1-11.

42. Hancock REW, Chapple DS: Peptide antibiotics. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy 1999, 43(6):1317-1323.

43. Sang Y, Patil AA, Zhang G, Ross CR, Blecha F: Bioinformatic and expression

analysis of novel porcine beta-defensins. Mammalian Genome 2006,

17(4):332-339.

44. Lynn DJ, Higgs R, Gaines S, Tierney J, James T, Lloyd AT, Fares MA, Mulcahy G,

O'Farrelly C: Bioinformatic discovery and initial characterisation of nine

novel antimicrobial peptide genes in the chicken. Immunogenetics 2004,

56(3):170-177.

45. Mor A, Nicolas P: Isolation and structure of novel defensive peptides from

frog skin. European Journal of Biochemistry 1994, 219(1-2):145-154.

46. Mor A, Hani K, Nicolas P: The vertebrate peptide antibiotics dermaseptins

have overlapping structural features but target specific microorganisms.

Journal of Biological Chemistry 1994, 269(50):31635-31641.

47. Navon-Venezia S, Feder R, Gaidukov L, Carmeli Y, Mor A: Antibacterial

properties of dermaseptin S4 derivatives with in vivo activity. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy 2002, 46(3):689-694.

48. Kustanovich I, Shalev DE, Mikhlin M, Gaidukov L, Mor A: Structural

requirements for potent versus selective cytotoxicity for antimicrobial

Bibliografía 67

dermaseptin S4 derivatives. Journal of Biological Chemistry 2002,

277(19):16941-16951.

49. Krugliak M, Feder R, Zolotarev VY, Gaidukov L, Dagan A, Ginsburg H, Mor A:

Antimalarial activities of dermaseptin S4 derivatives. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy 2000, 44(9):2442-2451.

50. Dagan A, Efron L, Gaidukov L, Mor A, Ginsburg H: In vitro antiplasmodium

effects of dermaseptin S4 derivatives. Antimicrobial Agents and Chemotherapy

2002, 46(4):1059-1066.

51. Coote PJ, Holyoak CD, Bracey D, Ferdinando DP, Pearce JA: Inhibitory action

of a truncated derivative of the amphibian skin peptide dermaseptin s3 on

Saccharomyces cerevisiae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998,

42(9):2160-2170.

52. Suresh VV: One Hundred Years of Peptide Chemistry. Journal of Science

Education Search About Resonance 2001:68-75.

53. Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a

tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society 1963, 85(14):2149-2154.

54. Barany G, Kneib-Cordonier N, Mullen DG: Solid-phase peptide synthesis: a

silver anniversary report. International Journal of Peptide and Protein Research

1987, 30(6):705-739.

55. Lloyd-Williams P, Albericio F, Giralt E: Convergent solid-phase peptide

synthesis. Tetrahedron 1993, 49(48):11065-11133.

56. Amblard M, Fehrentz JA, Martinez J, Subra G: Methods and protocols of

modern solid phase peptide synthesis. Molecular Biotechnology 2006,

33(3):239-254.

57. Albericio F, Kneib-Cordonier N, Biancalana S, Gera L, Masada RI, Hudson D,

Barany G: Preparation and application of the 5-(4-(9-

fluorenylmethyloxycarbonyl) aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy)-valeric

acid (PAL) handle for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide

amides under mild conditions<sup>1-3</sup>. Journal of Organic Chemistry

1990, 55(12):3730-3743.

58. Barany G, Albericio F: A three-dimensional orthogonal protection scheme for

solid-phase peptide synthesis under mild conditions. Journal of the American

Chemical Society 1985, 107(17):4936-4942.



59. Czarnik AW: Solid-phase synthesis supports are like solvents. Biotechnology

and Bioengineering 1998, 61(1):77-79.

60. Savoia D, Guerrini R, Marzola E, Salvadori S: Synthesis and antimicrobial

activity of dermaseptin S1 analogues. Bioorganic and Medicinal Chemistry

2008, 16(17):8205-8209.

61. PredictProtein [http://www.predictprotein.org/]

62. Sarin VK, Kent SBH, Tam JP, Merrifield RB: Quantitative monitoring of solid-

phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction. Analytical Biochemistry

1981, 117(1):147-157.

63. van Dijk M, Nollet ML, Weijers P, Dechesne AC, van Nostrum CF, Hennink WE,

Rijkers DT, Liskamp RM: Synthesis and characterization of biodegradable

peptide-based polymers prepared by microwave-assisted click chemistry.

Biomacromolecules 2008, 9(10):2834-2843.

64. Kates SA, Sole NA, Johnson CR, Hudson D, Barany G, Albericio F: A novel,

convenient, three-dimensional orthogonal strategy for solid-phase synthesis

of cyclic peptides. Tetrahedron Letters 1993, 34(10):1549-1552.

65. Zingel C, Sachse A, RÃ¶ÃŸling GL, MÃ¼ller RH: Lyophilization and

rehydration of iopromide-carrying liposomes. International Journal of

Pharmaceutics 1996, 140(1):13-24.

66. Choi H, Aldrich JV: Comparison of methods of the Fmoc solid-phase

synthesis and cleavage of a peptide containing both tryptophan and

arginine. International Journal of Peptide and Protein Research 1993, 42(1):58-

63.

67. Rodthongkum N, Chen Y, Thayumanavan S, Vachet RW: Selective enrichment

and analysis of acidic peptides and proteins using polymeric reverse

micelles and MALDI-MS. Analytical Chemistry, 82(20):8686-8691.

68. Sreerama N, Woody RW: Protein secondary structure from circular dichroism

spectroscopy. Neural network, ridge regression and self-consistent

methods. Journal of Molecular Biology 1994, 242(4):497-507.

69. Johnson WC: Analyzing protein circular dichroism spectra for accurate

secondary structures. Proteins: Structure, Function and Genetics 1999,

35(3):307-312.


Bibliografía 69

70. Sreerama N, Woody RW: A self-consistent method for the analysis of protein

secondary structure from circular dichroism. Analytical Biochemistry 1993,

209(1):32-44.

71. Turpin J, Hester JP, Hersh EM, Lopez-Berestein G: Centrifugal elutriation as a

method for isolation of large numbers of functionally intact human

peripheral blood monocytes. Journal of Clinical Apheresis 1986, 3(2):111-118.

72. Carter CS, Leitman SF, Cullis H: Use of a continuous-flow cell separator in

density gradient isolation of lymphcoytes. Transfusion 1987, 27(4):362-365.

73. Gholami K, Nejati V, Delirezh N, Bakhsh MG, Asadi M: Differentiation of

monocyte-derived dendritic cells on endothelial cells as feeding layer.

Tehran University Medical Journal 2011, 69(3).

74. Agudelo WA, Galindo JF, Patarroyo ME: Electrostatic potential as a tool to

understand interactions between malaria vaccine candidate peptides and

MHC II molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications,

410(3):410-415.

75. Astelbauer F, Walochnik J: Antiprotozoal compounds: State of the art and new

developments. International Journal of Antimicrobial Agents 2011, 38(2):118-124.

76. Oliveira LF, Schubach AO, Martins MM, Passos SL, Oliveira RV, Marzochi MC,

Andrade CA: Systematic review of the adverse effects of cutaneous

leishmaniasis treatment in the New World. Acta Tropica 2011, 118(2):87-96.

77. Mitropoulos P, Konidas P, Durkin-Konidas M: New World cutaneous

leishmaniasis: Updated review of current and future diagnosis and

treatment. Journal of the American Academy of Dermatology 2011, 63(2):309-

322.

78. Fairbanks VF, Ziesmer SC, O'Brien PC: Methods for measuring plasma

hemoglobin in micromolar concentration compared. Clinical Chemistry 1992,

38(1):132-140.

79. GraphPad Prism Software [http://www.graphpad.com/prism/prism.htm]

80. Khromykh LM, Anfalova TV, Kazanskii DB: Colorimetric in vitro evaluation of T-

cell cytotoxicity. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2003,

136(3):314-317.

http://www.graphpad.com/prism/prism.htm



81. Pérez-Cordero JJ, Lozano JM, Cortés J, Delgado G: Leishmanicidal activity of

synthetic antimicrobial peptides in an infection model with human dendritic

cells. Peptides 2011, 32(4): 683-690.

82. Wang G, Li X, Wang Z: APD2: The updated antimicrobial peptide database

and its application in peptide design. Nucleic Acids Research 2009, 37(SUPPL.

1).

83. Zasloff M: From Development of Novel Antimicrobial Agents: Emerging

Strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2001, 51(5): 1321.

84. Kogan MJ, Olmedo I, Hosta L, Guerrero AR, Cruz LJ, Albericio F: Peptides and

metallic nanoparticles for biomedical applications. Nanomedicine 2007,

2(3):287-306.

85. Montalbetti CAGN, Falque V: Amide bond formation and peptide coupling.

Tetrahedron 2005, 61(46):10827-10852.

86. Newcomb WS, Deegan TL, Miller W, Porco JA: Analysis of 9-

fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) loading of solid-phase synthesis resins

by gas chromatography. Biotechnology and Bioengineering 1998, 61(1):55-60.

87. Nagarkar RP, Schneider JP: Synthesis and primary characterization of self-

assembled peptide-based hydrogels. In: Methods in Molecular Biology. Edited

by Gazit E, Nussinov R, vol. 474; 2008: 61-77.

88. Fields GB: Methods for removing the Fmoc group. Methods in molecular

biology (Clifton, NJ) 1994, 35:17-27.

89. Friedman M: Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino

Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004, 52(3):385-406.

90. Khosla MC, Smeby RR, Bumpus FM: Failure sequence in solid-phase peptide

synthesis due to the presence of an N-alkylamino acid. Journal of the

American Chemical Society 1972, 94(13):4721-4724.

91. Rothe M, MazÃ¡nek J: Side-reactions arising on formation of cyclodipeptides

in solid-phase peptide synthesis. Angewandte Chemie (International ed in

English) 1972, 11(4):293.

Bibliografía 71

92. del Fresno M, Alsina J, Royo M, Barany G, Albericio F: Solid-phase synthesis of

diketopiperazines, useful scaffolds for combinatorial chemistry. Tetrahedron

Letters 1998, 39(17):2639-2642.

93. Chou PY, Fasman GD: Conformational parameters for amino acids in helical,

Î²-sheet, and random coil regions calculated from proteins. Biochemistry

1974, 13(2):211-222.

94. Reimer J, Shamshurin D, Harder M, Yamchuk A, Spicer V, Krokhin OV: Effect of

cyclization of N-terminal glutamine and carbamidomethyl-cysteine

(residues) on the chromatographic behavior of peptides in reversed-phase

chromatography. Journal of Chromatography A, 1218(31):5101-5107.

95. P. Lloyd-Williams FAaEG: Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides

and Proteins; 1997.

96. Van Wandelen Cea: Cleavage, deprotection, and isolation of peptides after

Fmoc synthesis. Milligen/Biosearch, Division of Millipore 1989, 1-17:i-iv.

97. W.H Freeman C: Synthetic Peptides: A User´s Guide; 1992.

98. Wohlfarth C: Dielectric constant of 2,2,2-trifluoroethanol. In: Data extract from

Landolt-Börnstein IV/17: Static Dielectric Constants of Pure Liquids and Binary

Liquid Mixtures. vol. 17: Springer-Verlag Berlin Heidelberg; 2008.

99. Luo P, Baldwin RL: Mechanism of helix induction by trifluoroethanol: A

framework for extrapolating the helix-forming properties of peptides from

trifluoroethanol/water mixtures back to water. Biochemistry 1997, 36(27):8413-

8421.

100. Buck M: Trifluoroethanol and colleagues: Cosolvents come of age. Recent

studies with peptides and proteins. Quarterly Reviews of Biophysics 1998,

31(3):297-355.

101. Reiersen H, Rees AR: Trifluoroethanol may form a solvent matrix for assisted

hydrophobic interactions between peptide side chains. Protein Engineering

2000, 13(11):739-743.

102. Naumenkova TV, Levtsova OV, Nikolaev IN, Shaitan KV: Comparative

molecular dynamics study of the structural properties of melittin in water

and trifluoroethanol/water. Biophysics, 55(1):24-28.

103. Van Der Meide WF, Sabajo LOA, Jensema AJ, Peekel I, Faber WR, Schallig

HDFH, Fat RFMLA: Evaluation of treatment with pentamidine for cutaneous



leishmaniasis in Suriname. International Journal of Dermatology 2009, 48(1):52-

58.

104. Chadbourne FL, Raleigh C, Ali HZ, Denny PW, Cobb SL: Studies on the

antileishmanial properties of the antimicrobial peptides temporin A, B and

1Sa. Journal of Peptide Science.

105. Nicolas P, El Amri C: The dermaseptin superfamily: A gene-based

combinatorial library of antimicrobial peptides. Biochimica et Biophysica Acta -

Biomembranes 2009, 1788(8):1537-1550.

106. Kyte J, Doolittle RF: A simple method for displaying the hydropathic

character of a protein. Journal of Molecular Biology 1982, 157(1):105-132.

Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados ...diferentes secuencias peptídicas....

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