16 沉淀法

沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。

由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。

沉淀法由于成本低、收率高 (不会使蛋白质等大分子失活 )、浓缩倍数高可达 l0-50 倍和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。

定义 沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。

沉淀的种类 盐析 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 高价金属离子沉淀法 热沉淀法

蛋白质表面特性

蛋白质溶解：相似者相溶亲水性和疏水性：

有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的 % 等。如白蛋白

不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的 % 等。如纤维蛋白原。

蛋白质溶液的稳定因素1) 、水化层 (hydration shell)

tight hydration shell(0.35g water/1g pro)loose hydration shell(2g water /1g pro)

2) 、静电排斥 zeta 电势Nernst Potential— 胶核表面电位 ( 不可测 )Stern Potential—( 不可测 ) Potential— 滑面电位 ( 可测 ,mobility)

水化层 zeta 电势 静电排斥

Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell

16.1 盐析沉淀定义 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。原理

1. 高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱 .

2. 中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子 .

16.1.1 Cohn 经验方程lgS=β－ Ks I

S: 蛋白质的溶解度 ,g/L

I: 离子强度

Ks ：盐析常数，斜率，与温度和 pH 无关，与盐和蛋白质的种类有关。

β : 常数 , 截距 , 与盐的种类无关 , 与温度和 pH 蛋白质种类有关

盐析用盐要求

盐析作用强 该盐有足够大的溶解度，适于低温操作 生物惰性 密度小 来源丰富

16.1.2 盐析的影响因素

蛋白质的种类

蛋白质的种类不同， Ks值会有所不同；

分子量越大，沉淀所需盐的量越少；

蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀。

蛋白质的初始浓度

不同浓度的蛋白质溶液产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。

蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少、蛋白质的溶解损失小。

相反，蛋白质浓度低时，中性盐的极限沉淀浓度高，共沉作用小，分辨率高，但用盐量增大、蛋白质的回收率低。

无机盐种类 阴离子盐析作用顺序柠檬酸盐 >PO4

3 － >SO42 － >CH3CO

O － >Cl －

>NO3－ >SCN －

阳离子盐析作用顺序（一价） NH4

+>K+>Na ＋

(NH4)2SO4

温度 在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降。 在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。

pH 值 在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移。

16.2 等电点沉淀定义 利用蛋白质在 pH 等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。原理 当溶液 pH 值为蛋白质的等电点时，分子表面的净电荷为零，导致蛋白质表面双电层和水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。

特 点 等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。

16.3 有机溶剂沉淀定义 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，

降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。

原理 亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加。

水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。

特点 有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。

温度 有机溶剂与水混溶时放出相当数量的热量，使体系温度升高，增大了有机溶剂对蛋白变性的影响。

pH 值 许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果。

影响因素

离子强度 较低离子强度的存在有利于沉淀作用，甚至具有保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质 pH 值的作用。稍高的中性盐会使蛋白质产生盐溶。

16.4 非离子型聚合物沉淀法

定义 许多水溶性非离子型聚合物，特别是 PEG可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。

原理 聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和两水相的形成有联系。

使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量 PEG ：而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。

PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。 PEG沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。

PEG的分子量需大于 4000 ，最常用的是 6000 和 20 000 。所用的 PEG浓度通常为 20％，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。 PEG对后续分离步骤，影响较少，因此可以不必除去。但它的存在会干扰 A280和 Lowry法测定蛋白质．但对 biuret法无干扰。

16.5 聚电解质沉淀法

原理 加入聚电解质的作用和絮凝剂类似，同时还兼有一些盐析和降低水化等作用：缺点是往往会使蛋白质结构改变，但它们应用于酶和食品蛋白的回收中，因而值得注意。

有一些离子型多糖化合物应用于沉淀食品蛋白质。用得较多的是酸性多糖，如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在 pH 低于等电点时使蛋白质沉淀。和其他絮凝剂一样，加入量不能太多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。

一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季铵盐用来沉淀乳清蛋白质。

聚丙烯酸能于 pH 2.8时沉淀 90％以上的蛋白质，聚苯乙烯季铵盐能于 pH10.4时沉淀 95％的蛋白质；

16.6 热沉淀

定义 在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。

适用对象：热稳定性高的蛋白质

16.7 金属离子沉淀

一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。例如： Ca2+、 Mg2＋、 Ba2+、 Pb2+与羧基结合 Mn2 ＋、 Zn2 ＋、 Fe2+ 、 Cu2+ 、 Co2+ 、 Ni2+与羧基、含氮化合物及杂环化合物结合。 Ag+、 Hg2+、 Pb2+ 能与巯基结合。

思考题 1. 简述蛋白质表面的特性。 2 蛋白质沉淀的主要方法。 3 Cohn 方程的形式及其中各参数的物理意

义。 4 盐析沉淀的影响因素。 5