TÈCNICAS MOLECULARES DE

UTILIDAD EN INVESTIGACIÓN

INDUSTRIAL

LIANY LUNA TANIA VELASCO

Prácticas complementarias

SUMARIO

CompetenciasGeneralEspecíficos

Extracción de DNA Técnicas de biología molecular

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)ClonaciónTransformaciónWestern Blot

Purificación “Mini-Prep” del DNA de un plásmido recombinado oclonado

Evaluación de DNA y ProteínasElectroforesis en gel de agarosaElectroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Bibliografía

COMPETENCIAS

COMPETENCIA GENERAL

Conocer las diferentes técnicas moleculares utilizadas en investigación industrial

implementadas en los laboratorios de Genética y Bioquímica funcional y estructural de la

UFSCAR

COMPETENCIAS

COMPETENCIAS ESPECIFICAS

Conocer e identificar la aplicabilidad de las diferentes técnicas moleculares en el área de la investigación en el desarrollo de trabajos de investigación

Entender los principios básicos de cada una de las técnicas de biología molecular

Identificar la multidisciplinariedad con la cual se trabaja las diferentes técnicas moleculares

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; partiendo de fragmento original, o molde.

Fase 1:Desnaturalización

Fase 2:Hibridación

Fase 3:Elongación

CICLOS DE LA PCR

Temperaturas

Desnaturalización Hibridación Elongación

CLONACIÒN MOLECULAR DE DNA

Recombinación In vitro de un fragmento de DNA con un DNA vector (molécula de ADN utilizado como un vehículo para llevar material genético extraño) con capacidad de

replicación autónoma (Plásmido).

El fragmento de DNA se replicara junto con el DNA

vector en la célula hospedadora y así será posible

obtenerlo en un número elevado de copias.

Principio de la clonación de DNA

Inserción del DNA amplificado mediante PCR , en un plásmido

apropiado (DNA vector) mediante un proceso denominado ligación, con

previa linearización

In vivo

Hospedador apropiado

Electrocompetente

Favorece la entrada del

DNA recombinante

Etapas del proceso

Restricción

Restrictasas

Catalizan el corte de ambas cadena azúcar–fosfato del

dsDNA

Clasificación

Tipo I

Cortan en el sitio de reconocimiento (4 a 8 pb) o

muy cerca, de forma específica.

Tipo II

Cortan a distancias grandes y variables del sitio de

reconocimiento

Tipo IIICortan 25 pb fuera del sitio de

reconocimiento

Etapas del proceso

Ligación

Un extremo 5’ (portador de un grupo fosfato) y un extremo 3’

(grupo hidroxilo de la desoxirribosa)

Requiere

Transformaciòn

Introducción de material genético

en una célula

Orificios en las envolturas celulares, mediante procesos químicos y tratamientos físicos

Etapas del proceso

Métodos de transformación comúnmente utilizados Electroporación

Breve pulso eléctrico, permeabilizando las membranas (poros u orificios)

Entrada en la célula de moléculas de DNA grandes

Biobalistica

Microproyectiles para introducir ácidos nucleicos con

partículas microscópicas

Metales pesados como el oro o tungsteno

Impregnadas del DNA

Etapas del procesoMétodos de transformación comúnmente utilizados

Microinyecciòn

Se inyecta el DNA con una aguja muy fina (Micromanipulador) y la ayuda de un

microscopio a cada una de las células; una a una y manualmente

Lipofecciòn

Liposomas capaces de unirse tanto al DNA como a la superficie celular, ambos

cargados negativamente

El DNA transferido no se integra en el

genoma

Etapas del proceso

Selección

Vector con DNA Codifica para una o varias enzimas que le confiere resistencia a antibióticos

Células + VectorCrecen en medio selectivo

suplementado con Antibiótico( Ampicilina, Tetraciclina, Zeocina)

Selección de colonias

transformantes

Purificación “Mini-prep” del DNA de un plásmido recombinado o clonado

DNA extracromosómico, circular y de pequeño tamaño y que se

caracterizan por que se pueden replicar de manera independiente del

DNA cromosómico.

Estructura de un plásmidoOrigen de Replicación:

Gen de resistencia:

Sitios de restricción:

Mini-prep

Extracción de ADN de naturaleza plasmídica de un cultivo bacteriano

Lisis alcalina

Desnaturalización del DNA mediante NaOH (medio básico) y SDS (detergente)

Cuando se neutraliza el medio + Acetato potásico

Precipitación de proteínas por SDS y concentración de sales

DNA plasmídico se renaturaliza correctamente y queda soluble

GE Healthcare ( Ilustra plasmid-prep mini spin kit)

EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO

Iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior

extracción de la célula

Lisis celular mediante un detergente y el ADN se disuelve en una solución tampón

El tampón contiene: ADN y restos celulares (Proteínas, ARN y Carbohidratos)

Las proteínas asociadas al ADN se fraccionan en cadenas más pequeñas y separadas (Detergente)

ADN ( Se extrae con alcohol etílico al 95%)

Reactivos utilizados en la extracción de ADN

Detergente aniónico, agente solubilizante de proteínas, membranas y tejidos

Deshidrata ADN (perder contacto con el agua)

Precipitación del ADN

Precipitación del ADN, compite con el agua Deshidratandolo y llevándolo al fondo del tubo

WESTERN BLOT O INMUNOBLOT

Visión general

Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada

Preparación de la muestra

Disrupción mecánicao química

Sobrenadante de Cultivos celulares

Electroforesis en gel de Acrilamida

Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño

Transferencia electroforética a una

membrana

Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un

soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas

(SDS) se une a las proteínas y confiere una carga (-) a las

proteínas

Hibridación del Anticuerpo

Incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el

epítopo específico de la proteína diana.

un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma

específica al anticuerpo primario, proporcionando una

forma de detección

Preparación de la muestra

Detección de las bandas

GEL DE AGAROSA

TAE

Pesar Agarosa

ChemiDoc

Fuente de Energía

una técnica que se emplea para separar los ácidos

nucleicos y las proteínas en función del tamaño, la

carga eléctrica y otras propiedades físicas

GEL DE POLIACRILAMIDA

Peines Vidrios

Soporte de fundición

Soporte de fundición de vidrio

Tanque de buffer

Montaje de Fijación y electrodo

Fuente de Energía

Tampón de corrida

Revelar el Gel

Comassie azul brillante

Horno por 30 segundos

Solución lavadoraAcido Acético 8% Etanol 15%

Transformación 16 horas 37 °C

10 mL de LBkana (25µg/mL) Overnight, 37 °C

220rpm

100 mL de LB

Kana

(25µg/mL)

Colonia única

1 mLDO600

de 0.7

1 mM IPTG1% L-arabinose2 horas, 37 °C

220rpm

centrifugación

Resuspende

0.5 mL(50 mM fosfatosódio, pH 7.4 ; 5

mM EDTA)

Igual volume deEsferas de vidro

vortex

E. Coli (BL21-AI)

pET28a_PcaK

Transferência de el lisado

Centrifugación

Listo para Purificación de

proteína

Agar LB

PROCEDIMIENTO PARA OBTENER PROTEÍNA

PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD DE NIQUEL- INTERCAMBIO IONICO

Buffer de lavado 10 mM

Columna de IMAC- Níquel

Buffer de lavado 25 mM

Buffer de lavado 50 mM

Buffer de lavado 100 mM

Buffer de lavado 75 mM

Buffer de lavado 250 mM

Buffer de lavado 10 mM: KPB + NaCl 1 M + glicerol 10% + imidazol 10 mM.

Gel del Electroforesis de

Poliacrilamida

BIBLIOGRAFIA

Protocolos del Departamento de Genética y Evolución del laboratorio de BiologíaMolecular, Universidad Federal de Sao Carlos.

Nelson, D; Cox, M. LEHNINGER PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA. 4ª edición. Edit. Omega.Pags. 306-317

Alberts y cols. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA CELULA. 4ª edición. Ediciones Omega.Pags. 500-504

Lodish y cols. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 5ª edición. Ed. MedicaPanamericana

Karp, G. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 4ª edición. Edit. Mc Graw Hill. Pags. 822-835

Higuchi, R.; Fockler, C.; Dollinger, G.; Watson, R. 1993. Kinetic PCR analysis: realtimemonitoring of DNA amplification reactions. Bio/Technology 11: 1026-1030