FACULTATEA DE BIOLOGIEMASTER GENETICA MOLECULARAAN I  

CONTROLUL EXPRESIEI GENICETEMA

RT-PCR- metoda SYBR green

Student Dragomir ( Dan ) Steluta- Nicoleta

Lector dr.Lucian Gorgan

RT-PCR Metoda SYBR-Green Incepand cu o singura molecula de material

genetic, PCR poate genera intr-o singura dupa amiaza 100 bilioane molecule similare. Reactia este usor de excutat: necesita doar un tub, cativa reactanti si o sursa de caldura” ( K. Mullis in Scientific American).

RT-PCR Metoda SYBR-Green Spre deosebire PCR clasic PCR real time PCR

permite detectarea rapida a ampliconilor inca din timpul reactiei.

PCR de timp real a devenit o procedura foarte cunoscuta pentru nivelurile de cuantificare a expresiei genice,precum rearanjarile genetice ,amplificarile,stergerile sau mutarile de punct.

Puterea sa rezida in abilitatea de detectare a marimii produsului PCR la fiecare ciclu al PCR utilizand fluorescenta.S-au efectuat cercetari pentru a detecta produsele PCR.Cele mai cunoscute sunt bazate pe legatura hidrolizei probelor de hibridizare la secventa tinta

RT-PCR Metoda SYBR-Green O alta varianta utilizeaza coloranti ,care leaga

non-specific produsul PCR dublu-esuat. Ambele teste sunt potential rapide si

sensitive,principiile acestora de detectare si optimizare sunt diferite ,precum si costul rezultat per incercare( test).

PCR de timp real folosind SYBR Green este o tehnologie noncostisitoare.

CHIMIA SYBR GREEN

SYBR Green este un compus fluorescent mai nou utilizat la detecţia acizilor nucleici în soluţie, în aplicaţii pe biocipuri sau în citometria în flux. SYBR Green este de 25 de ori mai sensibil decât bromura de etidiu (utilizată mai rar datorită riscului aparariţiei unor mutaţii genetice).

SYBR Green se leagă preferenţial de ADN-ul duplex (în adâncitura micăa duplexului), complexul emite la 522 nm, dar poate lega şi ADN-ul monocatenar proces în urma căruia creşterea fluorescenţei este mai puţin pronunţată.

CHIMIA SYBR GREEN

Intr-o reactie PCR ,DNA sau cDNAde intrare este minim si ca urmare doar DNA dublu-atins present in suficiente marimi pentru a fi detectate este produsul PCR insusi.Ca si pentru alte reactii chimice PCR de timp real ,citirile la iesire sunt date ca numar de cicluri PCR pentru a finalize un nivel de fluorescenta dat.Pe parcursul ciclurilor PCR initiale,semnalul fluorescent emis de SYBR Green I legat de produsele PCR este de obicei prea slab pentru a inregistra fundalul de mai sus. Pe parcursul fazei exponentiale a PCR ,fluorescenta se dubleaza la fiecare ciclu.O fluorescenta precisa care se dubleaza la fiecare ciclu este un indicator important .Dupa 30-35 cicluri,intensitatea semnalului fluorescent incepe sa se aplatizeze aratand ca PCR are saturatia atinsa.

Detectarea directa a ampliconului prin agenti

fluorescenti de legare ADN

CUANTIFICAREA ABSOLUTA A EXPRESIEI GENETICE

Aceasta este o procedura simpla de optimizare a concentratiei initiatorului care se refera la cele mai bune conditii de amplificare posibile (cel mai mic Ct). Procedura consta in a varia marimile de initiator adaugat la reactive,pentru a se gasi cea mai eficienta concentratie pastrand in minte ca “mai mult nu inseamna si mai bun.”.

CUANTIFICAREA ABSOLUTA A EXPRESIEI GENETICE

Pentru pipetare usoara ( pentru o reactie de 25μl) ,pot fi utlizate concentratii de 50,100,300,500 si 1000 nM. Poate fi setata o matrice de optimizare.De obicei o matrice simpla poate fi utilizata pentru a gasi conditii bune si atunci pe viitor poate fi cizelata daca este necesar.

CUANTIFICAREA ABSOLUTA A EXPRESIEI GENETICE

Un exemplu al acestei proceduri este aratat in fig.1A si 1B.

CUANTIFICAREA ABSOLUTA A EXPRESIEI GENETICE

Urmarind optimizarea concentratiei de initiator ,trebuie sa fie luata o curba standard pentru a se realiza o cuantificare absoluta, dar si sa se gaseasca limitele de senzitivitate a testului.

Diagrama în timp real a amplificarii

CUANTIFICAREA ABSOLUTA A EXPRESIEI GENETICE

Exemplu de curba standard

Cuantificarea relativa a expresiei genice

Aceasta este o procedura simpla de optimizare simpla dar se refera la cele mai bune conditii posibile de amplificare ( cel mai mic Ct) cu o eficienta PCR similara pentru ambele .tinta si control (controale ) endogen ca referinta (gene utilizabile de mai multe ori in mod uzual).

Procedura consta in gasirea celei mai eficiente concentratii de initiator pentru ambele gene , urmat de o comparare a eficientei dintre tinta si referinta. Aceeasi matrice de optimizare poate fi setata pentru a se gasi cele mai adecvate conditii de concentratie de initiator pentru ambele pentru gene de tinta si de referinta .Atunci se utilizeaza o dilutie seriala a Cdna de intrare pentru a se compara eficienta ambelor reactii PCR in paralel.

Cuantificarea relativa a expresiei genice

Valorile Ct vor fi diferite intre tinta si referinta dar se refera la paralelismul dintre cele doua curbe standard.Eficientele PCR pot fi comparate luind in considerare panta curbei lineare a valorilor Ct considerate fata de dilutia logaritmica. O reactie perfecta are o panta de 3,3 care corespunde unei amplificari de dublu exact la fiecare ciclu al PCR intre dilutii ale unui factor de 10.

Amplificarea genetica Detectarea de amplificari genetice, de obicei in

esantionae de tumori poate fi finalizata cu metoda SYBR Green.In propriile noastre experimente am putut obtine rezultate care au fost in concordanta cu rezultatul FISH . Rezultatele noastre ( dungi negre ) au comparat cu factorul de amplificare stabilit inregistrat pentru aceste tumori ( dungi verzi ) si au confirmat prezenta amplificarii MYCN.

CONCLUZII SYBR Green I pe PCR de timp real , este o

alternativa noncostisitoare de specificare bazata pe chimicale ce a depasit scepticismul initial privind utilizarea sa.Fara indoiala dezvoltarile din analiza curbei de topire au contribuit la popularitatea sa si au permis multiplicarea testelor de discriminare alelica.

SYBR Green I sau recent descoperitele tehnici de PCR de timp real cu dsDNA pot fi utilizate in teste de discriminare alelica sau cuantificare sic el mai probabil vor continua sa castige in popularitate.