PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección ...

Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN-León)

Facultad de Ciencias Médicas

Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas (CEI)

Tesis para optar al título de Máster en Microbiología Médica

PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección y

cuantificación de los genogrupos GI y GII de Norovirus.

Autora:

Lic. Eliana María Espinoza Tórrez. Tutor: Filemón Bucardo, PhD Profesor Titular. Dpto. Microbiología y Parasitología Facultad de Ciencias Médicas UNAN-León Asesor: Johan Nordgren, PhD División de Virología Molecular Facultada de Ciencias Médicas. Universidad de Linköping, Suecia.

León, Nicaragua 2011

“A la libertad por la Universidad”

A mis padres, Rafael Espinoza y Eliana Torrez, por su amor y sabiduría.

“No tengas miedo de tener valor” Karol Wojtyla

AGRADECIMIENTO

Primero quiero dar gracias a Dios por finalizar esta etapa de mi vida llena de muy buenas

experiencias y muchos conocimientos que serán herramientas en mi futuro como persona y

como profesional.

Agradecer a mis abuelos por estar pendiente de cada miembro de la familia y su presencia.

Mis padres por darme la vida, por su ejemplo, su disciplina, sentido de la responsabilidad y

sobre todo por su amor. A mis hermanos, María José y Rafael, gracias por su amistad, su

apoyo en todo momento y su infaltable música. A mi cuñado Mike, por su apoyo y

disponibilidad para ayudarme. A mi novio, Graziano por ser mi OZ y coraje, y transmitirme

su amor. A la personita más grande en mi vida, mi sobrino Juan Pablo, la luz y alegría de

mis días.

Muchas gracias a mi tutor Filemón Bucardo. PhD por que con su profesionalismo,

paciencia y sincera amistad ha sido un excelente guía en este caminar, gracias a él hoy

puedo ver finalizada esta tesis. A Johan Nordgren. PhD y Dr. Lenart Svensson. PhD de la

Universidad de Linköping, Suecia por proveer los estándares utilizados en este estudio y

revisar el documento.

Un profundo y sincero agradecimiento a la Lic. Yahoska Reyes, que fue la persona que

durante todo este proceso me brindó su mano, su apoyo incondicional, colaboración y su

amistad. Gracias a cada una de las personas del departamento y del laboratorio de

Microbiología de la universidad, cada uno de ellos con su trabajo dio un granito de arena

para que este trabajo se pudiera desarrollar.

Quiero agradecer a mi amigo William Morales. Msc quien a lo largo de mí recorrido por

esta universidad ha sido un excelente profesor y ha compartido conmigo sus conocimientos,

su sabiduría, sus consejos y una buena amistad.

Este estudio fue desarrollado con fondos de Netropica Grant 05-N-2010.

RESUMEN

Norovirus es reconocido como la causa principal de gastroenteritis aguda no bacteriana. En

países en desarrollo, la infección por NoV causa aproximadamente 200,000 muertes al año

en niños ≤ 5 años. A pesar que NoV es un patógeno importante en humanos los métodos

diagnósticos son escasos, particularmente en países en desarrollo. Debido a la alta

diversidad genética del NoV humano y la falta de un cultivo celular, no se cuenta con un

reactivo para un diagnóstico de rutina, como el ELISA. Para mejorar la capacidad en el

diagnóstico de NoV, un ensayo de PCR en tiempo real fue optimizado y validado.

Utilizando una curva estándar de plásmidos para NoV GI y GII, nuestro método puede

cuantificar NoV en un rango dinámico de 103-107 e.g por reacción, con un límite de

detección de 100 e.g por reacción (~1.9 x 105 e.g/gr. h). Para validar el nuevo método

optimizado de PCR en tiempo real, un total de 60 muestras fueron seleccionadas

aleatoriamente de una colección de 253 muestras de heces de niños ≤ 5 años con diarrea, el

mismo material se analizó con un PCR convencional utilizado tradicionalmente para el

tamizaje de NoV. De interés es que 4 muestras fueron positivas por PCR en tiempo real y

negativas por el PCR convencional. Estas 4 muestras tienen < 1000 e.g por reacción, lo que

sugiere que el PCR convencional es menos sensible que nuestro método. La curva de

disociación y el Tm de estas 4 muestras fueron similares con las muestras de referencia, por

lo tanto pueden ser verdaderos NoV positivos. El nuevo ensayo de PCR en tiempo real

puede incrementar el número de NoV positivos en estudios epidemiológicos moleculares y

puede ser fácilmente adaptado para el diagnóstico clínico de rutina en infecciones causadas

por NoV. Este es el primer PCR en tiempo real optimizado y validado para la detección y

cuantificación de NoV en el laboratorio de Microbiología de la UNAN-León y

probablemente el primero en Nicaragua.

CONTENIDOS

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 3 3. PLANTEAMINETO DEL PROBLEMA ....................................................................... 4 4. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 5 5. MARCO TEÓRICO ................................................................................................. Véase 5.1. Biología del virus ........................................................................................................... 6 5.2. Características y evolución de NoV ............................................................................. 7 5.3. Epidemiología y transmisión ........................................................................................ 9 5.4. Características clínicas ................................................................................................ 10 5.5. Susceptibilidad del huésped, inmunología y patogénesis ......................................... 11 5.6. Métodos diagnósticos ............................................................................................. Véase 5.6.1. Ensayos inmunoenzimáticos .................................................................................... 14 5.6.2. Ensayos de PCR convencional ................................................................................. 15 5.6.3. Ensayo de PCR en tiempo real .......................................................................... Véase 5.6.3.1 Terminología en el análisis del PCR en tiempo real ............................................ 18 5.6.3.2. Químicas usadas en el PCR en tiempo real ......................................................... 23 5.6.3.3 Moléculas fluorescentes utilizadas en PCR en tiempo real ................................. 32 6. MATERIAL Y MÉTODO ............................................................................................. 36 7. RESULTADOS ............................................................................................................... 43 8. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 53 9. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 58 10. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 59 11. REFERENCIAS ........................................................................................................... 60 12. ANEXOS ....................................................................................................................... 65

ABREVIACIONES

NoV Norovirus

GI Genogrupo I

GII Genogrupo II

LUX Light-Upon-Extension

NS Región N-terminal Shell

ADN Acido desoxirribonucleico.

ADNc ADN complementario.

ADNds ADN de cadena doble.

ARN Acido ribonucleico.

ELISA Ensayos inmunoenzimático

Tm Temperatura de disociación

RT Transcripción Reversa.

PCR Reacción en Cadena de la

Polimerasa.

RdRp Región dependiente de ARN

Polimerasa

Ct Threshold cycle

∆Rn Variación de la intensidad de

fluorescencia.

nt nucleótido

kd kilo dalton

pb pares de bases

nM nano-Molar

µl micro litro

nm nanómetro

pmol pico-mol

VP1 proteína mayor de la cápside

VP2 proteína estructural menor.

VLP Virus-Like Particle.

ORF Open Reading Frame.

e.g equivalente genómico

e.g/gr h equivalente genómico por

gramo de heces.

1

1. INTRODUCCIÓN

Norovirus (NoV) es considerado como una de las principales causas de gastroenteritis viral,

tanto esporádica como epidémica, a nivel mundial. Un estudio reciente estima que cada año

NoV puede causar más de un millón de hospitalizaciones y 200.000 muertes en niños ≤ 5

años [Patel et al., 2008]. La mortalidad por gastroenteritis aguda para el año 2000 fue

estimada de 2.1 millones, y la mortalidad en niños fue mayor en países en desarrollo [Patel

et al., 2008]. NoV son un grupo amplio de patógenos entéricos con una alta diversidad

genética. Estas variantes incluyen 5 genotipos dentro del GI y al menos 17 genotipos dentro

del GII [Zheng et al., 2006]. En los últimos años, el PCR en tiempo real ha surgido como

un método altamente reproducible y sensible para la detección de NoV, probando ser más

sensible que los métodos utilizados previamente como el microscopio electrónico y el PCR

convencional. Pero los análisis moleculares para NoV se han visto incapacitado por la

necesidad de múltiples primers para detectar la gran variedad genética. [Nordgren et al.,

2008]

Existen varios ensayos de PCR en tiempo real reportados para la detección de NoV,

incluyendo ensayos TaqMan [Kageyama et al., 2003; Pang et al., 2004; Tajiri-Utagawa et

al., 2009; Trujillo et al., 2006; Vainio and Myrmel, 2006], basados en la química de SYBR

Green [Pang et al., 2004; Richards et al., 2004a] y recientemente aplicando un sistema LUX

[Nordgren et al., 2008]. Varios de los ensayos desarrollados recientemente están dirigidos

al segmento de traslape ORF1-ORF2 en el genoma viral, el cual es posiblemente la región

más conservada del genoma de NoV [Kageyama et al., 2003; Katayama et al., 2002;

Nordgren et al., 2008].

La técnica de PCR en tiempo real utilizada en este estudio se basa en el sistema de SYBR

Green que consiste en un fluoróforo que se intercala en la doble cadena amplificada de

ADN (ADNds) por tanto la fluorescencia es inespecífica, es decir los dímeros de primers o

productos inespecíficos emiten fluorescencia, a diferencia de los métodos que usan una

sonda como TaqMan.

2

Este sistema de detección tiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la

reacción es muy fácil y además es más barato que las sondas específicas. Para mejorar la

especificidad se debe emplear condiciones óptimas de reacción, así como una selección

cuidadosa de los primers para disminuir la formación de dímeros.

En Centroamérica los reportes sobre la prevalencia de NoV son muy limitados, así los

primeros datos sobre la prevalencia de NoV en Nicaragua fue realizada por Bucardo et al.,

en el 2008 quienes realizaron un estudio epidemiológico molecular en niños ≤ 5 años

hospitalizados y de la comunidad, quienes reportaron una prevalencia de NoV del 12%,

considerando a NoV como un agente etiológico importante de la diarrea aguda en niños. La

propagación rápida del virus y su estabilidad en algunos ambientes dificulta su control en

brotes, así como la falta de un diagnóstico rápido y preciso. En gran medida las deficiencias

atribuidas a la complejidad de los ensayos para NoV se deben a que el virus no puede

propagarse en cultivo de células, así los métodos moleculares han sido los ensayos de

elección para su detección.

Es por ello, que con este estudio pretendemos optimizar y validar un ensayo de PCR en

tiempo real que permita la detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de NoV

en muestras diarreicas en niños ≤ 5 años, y tener acceso a un ensayo sensible y específico

de costo más reducido en comparación con otros sistemas de PCR en tiempo real, y ser

implementado como diagnóstico de rutina en futuros estudios epidemiológicos moleculares

de NoV como causa de diarrea aguda en nuestro país.

3

2. JUSTIFICACIÓN

Las infecciones en humanos causadas por NoV se han convertido en un creciente problema

de salud de gran impacto en la salud pública a nivel mundial. La prevalencia de NoV como

causa de gastroenteritis esporádica y epidémica seguramente está subestimada debido a que

no se realiza habitualmente un diagnóstico específico.

La aplicación reciente de técnicas sensibles y específicas como es el PCR en tiempo real ha

demostrado que los NoV son causa frecuente e importante de gastroenteritis esporádica y

endémica en todo el mundo y en todos los grupos de edad. En países en vías de desarrollo,

donde la diarrea es la principal causa de muerte en niños, se sabe relativamente poco sobre

el papel desempeñado por los NoV, pero se estima que representan, aproximadamente el

12% de los casos de gastroenteritis grave en niños ≤ 5 años en todo el mundo [Fankhauser

et al., 2002; Patel et al., 2009].

A pesar que NoV es un patógeno importante en humanos los métodos diagnósticos son

escasos, particularmente en países en desarrollo. Debido a la alta diversidad genética de

NoV y el hecho de ser virus no cultivables, los reactivos para un diagnóstico de rutina,

como el ELISA son poco disponibles y poco específicos. Por ello, con el objetivo de

mejorar la capacidad en el diagnóstico de NoV un ensayo de PCR en tiempo real basado en

SYBR Green fue optimizado y validado.

El nuevo ensayo de PCR en tiempo real permitirá la realización de estudios

epidemiológicos moleculares dirigidos a la detección y cuantificación de los genogrupos GI

y GII de NoV en muestras diarreicas, así como a la implementación de un diagnóstico de

rutina sensible y específico disponible en el departamento de Microbiología de la UNAN-

León que permita brindar a la comunidad y al medio hospitalario un diagnóstico importante

de la etiología viral de la diarrea aguada principalmente en niños.

4

3. PLANTEAMINETO DEL PROBLEMA

El diagnóstico de una infección por NoV es muy limitado, el Ministerio de Salud hasta

ahora no dispone de un método diagnóstico de rutina para la detección de NoV en muestras

diarreicas que permita conocer la prevalencia de gastroenteritis por este virus.

Los métodos diagnósticos utilizados en estudios epidemiológicos han resultado ser pocos

sensibles y poco específicos en la detección de los genogrupos GI y GII de estos virus,

como es el caso de los ELISA que se han visto limitados por presentar reacciones

inespecíficas, así como también los métodos moleculares como el PCR convencional que

requiere de múltiples primers para detectar las diferentes variantes genéticas del virus y

presenta baja especificidad en muestras donde la carga viral es baja.

De esta manera, en este estudio nos planteamos la siguiente interrogante: ¿Cuáles

parámetros deben ser optimizados para obtener un método de PCR en tiempo real sensible,

específico y de costo reducido para la detección y cuantificación de los genogrupos GI y

GII de NoV en muestras diarreicas?

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4. OBJETIVOS

Objetivo general • Desarrollar un ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la

detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de Norovirus en muestras

diarreicas.

Objetivos específicos

• Optimizar los parámetros químicos y termodinámicos del ensayo de PCR en tiempo

real basado en SYBR Green para la detección de los genogrupos GI y GII de

Norovirus en muestras diarreicas.

• Validar el ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección

de los genogrupos GI y GII de Norovirus en muestras diarreicas.

• Evaluar las propiedades del ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green

para la detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de Norovirus en

muestras diarreicas.

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5. MARCO TEÓRICO

La gastroenteritis, tanto epidémica como esporádica, es causa frecuente de morbilidad y

mortalidad en personas de todas las edades [Patel et al., 2008]. Los NoV son reconocidos

como la principal causa de gastroenteritis epidémica y agente importante de gastroenteritis

esporádicas en niños como en adultos, responsable de al menos el 50% de todos los brotes

de gastroenteritis en todo el mundo, así como también causa importante de enfermedades

transmitidas por alimentos [Hall et al., 2011].

El agente Norwalk fue el primer virus identificado causante de gastroenteritis en humanos,

pero el reconocimiento de su importancia como patógeno ha sido limitada debido a la falta

de un método diagnóstico sensible, disponible y de rutina. Los recientes avances en la

comprensión de la biología molecular de los NoV junto con la aplicación de nuevas

técnicas diagnósticas, han alterado radicalmente la apreciación de su impacto. Aunque la

gastroenteritis por NoV es generalmente de media o poca duración, nuevas evidencias

sugieren que la enfermedad puede ser severa y a veces fatal entre la población vulnerable, y

es causa común de hospitalizaciones por gastroenteritis. Los métodos de diagnósticos de

rutina aún no están disponibles a la mayoría de los médicos, pero estudios epidemiológicos

han identificado una transmisión rápida local y el surgimiento de nuevas cepas de NoV que

se difunden a nivel global [Glass et al., 2009].

5.1. Biología del virus

Los NoV son un grupo de virus pequeños no envueltos e icosaédricos, su genoma está

constituido por una única molécula de ARN de cadena simple y de sentido positivo. NoV

está clasificado dentro del género Norovirus de la familia Caliciviridae. Otros géneros

dentro de la familia Caliciviridae incluyen Sapovirus, que también causa gastroenteritis en

humanos, así como también Lagovirus, Vesivirus y Nebovirus que no son patógenos para el

humano. NoV pueden ser divido en 5 genogrupos designados como GI - GV, basado en la

identidad del aminoácido en la VP1 [Green et al., 2000; Zheng et al., 2006].

7

Las cepas que infectan a los humanos se han encontrado en GI, GII y GIV mientras que las

cepas infectantes en vaca y ratón se han encontrado en GIII y GV, respectivamente.

Aunque la transmisión de NoV entre especies no se ha documentado, cepas que infectan a

los cerdos se han encontrado en GII [Wang et al., 2007], y un NoV GIV se descubrió

recientemente como causa de diarrea en perros [Martella et al., 2008]. Sugiriendo potencial

transmisión zoonótica. Basados en una similaridad de secuencias > 85% en el genoma

completo de VP1, NoV puede ser clasificado en al menos 5 genotipos pertenecientes al GI

y 17 genotipos pertenecientes al GII [CDC, 2011; Hall et al., 2011; Martella et al., 2008;

Zheng et al., 2006].

5.2. Características y evolución de NoV

Antes del año de 1993, NoV fue diagnosticado en muestras de heces por microscopía

electrónica. Fueron reportados en la literatura por su forma (virus de estructura pequeña y

redonda) o por su similitud al agente Norwalk (Norwalk–like virus) y se les llamó así por el

sitio donde fueron encontrados (por ejemplo, Norwalk, Ohio; Hawaii; y Snow mountain,

Colorado). Una vez secuenciado, el genoma del virus Norwalk reveló una sola cadena de

ARN de sentido positivo aproximadamente de 7.7-kd de tamaño, encerrado en una cubierta

proteica sin envoltura con distintas depresiones en forma de copa que los colocó como un

nuevo género -Norovirus- en la familia Caliciviridae (cuyo nombre es derivado de calyx,

que significa copa en Griego). La diversidad en NoV es grande, y las cepas humanas fueron

enseguida clasificadas, basadas en sus secuencias en tres genogrupos (GI, GII y GIV), al

menos 25 genotipos, y numerosos subgrupos, con el prototipo Norwalk virus, designado

como GI.1 (es decir genogrupo I, genotipo 1). La gran diversidad de cepas es atribuida

tanto a la acumulación de mutaciones puntuales asociadas a la replicación del ARN

propenso a errores y a la recombinación entre dos virus relacionados [Bull et al., 2007;

Nayak et al., 2008]. A pesar de esta diversidad, en los últimos años solo algunas cepas,

principalmente aquellas del genogrupo II genotipo 4 (GII.4), son responsables de la

mayoría de los casos y brotes.

8

Algunos NoV han sido identificados en animales, pero ninguno de ellos ha sido aún

detectado en humanos, pero el potencial zoonótico ha sido especulado. Cuando los genes de

la cápside de NoV fueron expresados en Baculovirus, las Virus-Like-Particle (VLP) fueron

producidas y parecían ser indistinguibles de los virus tipo salvaje [Jiang et al., 1992]. Estas

VLP se han convertido en reactivos claves para el desarrollo de técnicas de diagnóstico,

para el estudio de la estructura y unión a la célula, y utilizadas como posible candidato a

vacuna. Estudios estructurales indican que 180 moléculas de la proteína de la cápside están

organizadas como dímeros, cada una dividida dentro de un depósito y un dominio que

sobresale. Una región altamente variable del dominio sobresaliente, P2, reconoce los

antígenos de grupo sanguíneo, los cuales son reconocidos como factores de susceptibilidad

del huésped para la infección. Al menos dos sitios de unión distintos de antígenos de grupo

sanguíneo han sido localizados para varias cepas del virus (Figura 1).

Figura 1. Estructura de la cápside y genoma del virus Norwalk [Glass et al., 2009].

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Un análisis de varios brotes ha identificado NoV del GII como la cepa más frecuente en

todo el mundo. En los últimos 20 años, con la acumulación de mutaciones en el dominio

P2, los patrones de unión de los antígenos de grupo sanguíneo en diferentes NoV de GII.4

han evolucionado. Esta observación apoya la idea de la derivada genética y evolución de

los NoV que han venido evolucionando por la inmunidad de la población, incluyendo

interacciones carbohidratos - proteínas [Le Pendu et al., 2006; Siebenga et al., 2007]. El

resultado es un patrón de evolución de época, como la gripe, con el surgimiento de

variantes de NoV que remplazan cepas que dominaban previamente y causan epidemias

alrededor del mundo [Lindesmith et al., 2003; Siebenga et al., 2007].

5.3. Epidemiología y transmisión

La disponibilidad de técnicas de diagnóstico más sensibles han cambiado radicalmente la

apreciación de la epidemiología de la enfermedad por NoV [Amar et al., 2007]. En los

Estados Unidos, más del 90% de los brotes de los cuales anteriormente se desconocía la

causa, ahora pueden ser atribuidos a NoV [Fankhauser et al., 1998]. Estos brotes implican a

personas de todas las edades, ocurridos en varios lugares (hospitales, guarderías, cruceros y

restaurantes) y dirigidos a un número de grupos de alto riesgo, particularmente niños

pequeños, personas mayores, viajeros, soldados y algunos pacientes que están inmuno-

comprometidos o están recibiendo trasplante de órganos.

Se cree que los seres humanos son el único huésped para los NoV humanos. La transmisión

fecal-oral es el modo primario de transmisión, aunque el vómito infeccioso también puede

desempeñar un papel similar. Muchas características de NoV facilitan su transmisión.

Primero, la baja dosis infecciosa (aproximadamente 18 a 1000 partículas virales) [Teunis et

al., 2008] permite la transmisión del virus a través de aerosoles, fómite, contacto persona a

persona y por contaminación ambiental, como lo muestra la tasa de contagio secundario de

un 30% ó más entre contacto cercano y miembros de la familia.

10

Segundo, la excreción de virus precede a la aparición de la enfermedad en más del 30% de

las personas expuestas y puede continuar hasta después de la enfermedad, aumentando el

potencial de riesgo de una transmisión secundaria, una preocupación especial entre los

manipuladores de comida y los miembros de la familia [Atmar et al., 2008; Graham et al.,

1994; Rockx et al., 2002]. Tercero, el virus puede soportar un amplio rango de temperaturas

(congelación a 60ºC) y persiste en superficies del ambiente, en agua potable, y en una

variedad de alimentos, incluyendo ostras, vegetales y frutas crudas que son regadas con

aguas residuales. Cuarto, debido a la gran diversidad genética de las cepas de NoV y la falta

de protección cruzada completa, así como la falta de inmunidad a largo plazo, repetidas

infecciones pueden ocurrir a lo largo de la vida. Finalmente, el genoma de NoV es muy

sensible a las mutaciones que causan cambio antigénico y de recombinación, lo cual resulta

en la evolución de nuevas cepas que están disponibles a infectar a huéspedes susceptibles

[Glass et al., 2009].

5.4. Características clínicas

En estudios realizados en voluntarios y en investigaciones de brotes, la infección por NoV

causó diarrea en unos y vómito en otros, en aquellos que fueron expuestos y alrededor de

un tercio de los voluntarios fueron asintomáticos. Después del período de incubación de 10

a 51 horas la enfermedad a menudo comienza con vómitos, seguido de calambres

abdominales, fiebre (en 37 a 45% de los casos) diarrea acuosa y otros síntomas tales como

dolor de cabeza, escalofríos y mialgias. La enfermedad normalmente dura sólo de 2 a 3 días

pero puede durar más tiempo (es decir de 4 a 6 días) en brotes nosocomiales y en niños

menores de 11 años [Bon et al., 1999; de Wit et al., 2001a; de Wit et al., 2001b; Lopman et

al., 2004; Monica et al., 2007; Pang et al., 1999; Parrino et al., 1977; Patel et al., 2008;

Rockx et al., 2002]. Aproximadamente un 10% de las personas con gastroenteritis por NoV

buscan atención médica, lo cual incluye hospitalización y tratamiento por deshidratación

con terapia con líquidos vía oral e intravenosa [de Wit et al., 2001b; Phillips et al., ;

Widdowson et al., 2005].

11

NoV es excretado primeramente en las heces, pero también se puede encontrar en el vómito

de personas infectadas, aunque aún no está claro si la detección del virus solamente indica

un riesgo de transmisión [Marshall et al., 2007; Turcios-Ruiz et al., 2008]. El virus puede

ser detectado en las heces en 4 semanas en promedio después de la infección, aunque el

pico de excreción viral ocurre de 2 - 5 días después de la infección con una carga viral de

aproximadamente 100 billones de copias de virus por gramo de heces [Atmar et al., 2008].

Sin embargo, debido a la falta de un sistema de cultivo celular o un modelo animal para

NoV humano se desconoce si estos virus representan virus infecciosos o cuánto tiempo

después de la enfermedad una persona infectada no es más contagiosa. Afortunadamente,

más del 30% de las infecciones por NoV son asintomáticas, y las personas asintomáticas

pueden excretar virus aunque a bajos títulos en comparación con las personas sintomáticas

[Atmar et al., 2008; Graham et al., 1994; Phillips et al., 2009]. Aunque el papel de la

infección asintomática en la transmisión y en brotes por NoV aún no está claro.

5.5. Susceptibilidad del huésped, inmunología y patogénesis

Debido a la falta de un modelo animal y la incapacidad de cultivar los NoV, la mayoría de

información sobre la patogénesis e inmunología son de estudios en humanos voluntarios

[Johnson et al., 1990; Parrino et al., 1977; Wyatt et al., 1974], lo cual ha proporcionado

mucha visión sobre la susceptibilidad y el desarrollo de la inmunidad después de la

infección con NoV. Los primeros estudios mostraron que mientras los voluntarios

infectados desarrollaban inmunidad después de un desafío [Johnson et al., 1990; Parrino et

al., 1977; Wyatt et al., 1974], la inmunidad de corta duración apareció y las personas que

fueron sintomáticas fueron re-infectadas cuando fueron desafiadas 2 - 3 años después con el

mismo inóculo de NoV [Johnson et al., 1990]. Sin embargo, estos estudios en voluntarios y

la disminución de la duración de los síntomas con la edad en estudios de cohorte en la

comunidad, sugieren el desarrollo de una protección parcial contra NoV [Johnson et al.,

1990; Rockx et al., 2002].

12

Aproximadamente un 13 - 40% de los voluntarios nunca se enfermaron y sólo el 50%

desarrollaron la enfermedad [Parrino et al., 1977; Wyatt et al., 1974]. Aunque en un

principio no estaba claro porque algunos sujetos no desarrollaban la enfermedad,

investigaciones recientes sugieren que el tipo sanguíneo del huésped es un factor

importante en el desarrollo de la infección con NoV desde que la infección por NoV

depende de la presencia de receptores de antígenos de grupo sanguíneo en el intestino del

huésped susceptible [Lindesmith et al., 2003]. La combinación de cepas específicas unidas

y la expresión de los receptores variables de antígenos de grupo sanguíneo puede explicar

las diferencias observadas en los brotes de NoV y en estudios con voluntarios [Parrino et

al., 1977; Wyatt et al., 1974]. La especificidad del huésped puede también explicar porque

las personas con altos niveles de anticuerpos pre-existentes para NoV tienen más

probabilidad de desarrollar la enfermedad después de reinfectarse con NoV [Johnson et al.,

1990; Parrino et al., 1977]. Personas sin anticuerpos a una cepa en particular de NoV

pueden carecer de susceptibilidad genética a la infección.

13

5.6. Métodos diagnósticos

Hasta 1990, el único método disponible para diagnosticar las infecciones por NoV era la

microscopía electrónica. Desde la clonación del virus Norwalk en 1990, los ensayos de

PCR convencional han sido utilizados como método de referencia para la detección de NoV

en muestras clínicas y ambientales (agua y alimentos). Los ensayos de PCR convencional

son utilizados ampliamente en laboratorios comerciales y de investigación permitiendo la

detección del virus en muestras recolectadas al final de la enfermedad, cuando la cantidad

de virus es baja [Atmar and Estes, 2001]. El ensayo de PCR convencional seguido por la

secuenciación de nucleótidos han sido particularmente útiles en estudios de epidemiología

molecular para identificar puntos de origen de la infección, así como para diferenciar brotes

que se asumían erróneamente que estaban relacionados [Parashar et al., 1998]. Mientra la

disponibilidad de los primers para los ensayos de PCR convencional detecta varias cepas de

NoV, algunas cepas pueden escapar a la detección. El PCR en tiempo real, el cual es más

rápido y más sensible que el PCR convencional, se han desarrollado recientemente para la

rápida detección de NoV en un gran número de muestras de heces durante las

gastroenteritis epidémicas o esporádicas [Trujillo et al., 2006].

Varios métodos de ELISA comerciales para la detección de NoV en heces también han sido

desarrollados, su utilidad es en función de la sensibilidad y especificidad del ensayo y varía

dependiendo del objetivo del ensayo y de las investigaciones del brote versus el diagnóstico

clínico [Jiang et al., 1992]. Los ELISA son altamente específicos para algunos NoV pero

generalmente no lo necesariamente sensible para detectar un amplio rango de NoV [Jiang et

al., 1992]. La nueva generación de ELISA basada en el aumento de anticuerpos contra un

amplio rango de antígenos virales expresados en Baculovirus (es decir VLP) han sido

desarrolladas y probadas, pero la sensibilidad del ELISA sigue siendo limitado [de Bruin et

al., 2006]. La alta especificidad de estos ensayos los hacen útiles para el diagnóstico de

NoV en investigaciones de brotes, donde se dispone de muchas muestras y la detección

confiable del virus en algunos casos puede ser suficiente para la confirmación etiológica

[de Bruin et al., 2006].

14

Sin embargo la sensibilidad de estos ensayos depende del genotipo y los resultados pueden

variar dependiendo de la variedad de cepa circulante en la población [de Bruin et al., 2006].

Por lo tanto, si las muestras del brote son negativas por ELISA, deben ser evaluadas

utilizando un PCR convencional. Como tecnología diagnóstica evolucionada el PCR

convencional está siendo remplazado por el PCR tiempo real, la mayoría de los laboratorios

de virología clínica utilizan PCR en tiempo real para la detección de NoV.

5.6.1. Ensayos inmunoenzimáticos

Para la detección de antígenos de NoV en muestras clínicas, los ensayos rápidos (por

ejemplo, ELISA) ofrecen una alternativa atractiva a los ensayos de detección molecular

exigentes y costosos. Sin embargo, el desarrollo de una serie de reactivos ELISA para NoV

han sido probados debido al número de cepas antigénicamente distintas de NoV y a la alta

carga viral requerida para una señal positiva por este ensayo. Los kits comerciales incluyen

Norovirus ELISA (Oxoid, Ely, United Kingdom), SRSV (II)-AD (Denka Seiken Co. Ltd.,

Tokyo, Japón) y RIDASCREEN incluye alícuota de anticuerpos monoclonales y

policlonales de reacción cruzada [de Bruin et al., 2006; Okitsu-Negishi et al., 2006;

Richards et al., 2003]. En evaluaciones, al comparar la sensibilidad de estos kits con PCR

convencional oscilaron entre un 36 - 80%, y la especificidad osciló entre 47 - 100% [de

Bruin et al., 2006; Okitsu-Negishi et al., 2006; Richards et al., 2003]. Debido al modesto

desempeño de estos kits comerciales, particularmente su pobre sensibilidad, no son

recomendados para el diagnóstico clínico de una infección por NoV en casos esporádicos

de gastroenteritis. Sin embargo, dada su facilidad de uso y rápidos resultados, los kits de

ELISA con alta especificidad (> 85%) y al menos una sensibilidad moderada (> 50%)

podrían ser útiles en el tamizaje preliminar de múltiples muestras de heces asociados con un

brote de gastroenteritis aguda. Sin embargo, muestras negativas podrían ser confirmadas

por una segunda técnica de PCR convencional ó PCR en tiempo real, y por lo tanto los kits

de ELISA no serían considerados como un remplazo para los métodos moleculares durante

una investigación de brote.

15

5.6.2. Ensayos de PCR convencional

Cuatro regiones conservadas diferentes en el genoma de NoV han sido exploradas más

frecuentemente para el diseño de primers. Estas regiones están localizadas en el gen de la

polimerasa, en la unión ORF1-ORF2, en la terminal NS (N-Terminal Shell region) y en el

extremo 5´ del gen de la cápside [Vinje et al., 2004]. La región en el extremo 5´ del gen de

la cápside fue evaluada en una sola reacción con un ensayo de PCR convencional utilizando

un panel de 81 cepas de NoV (31 GI y 50 GII), donde un 95% de las muestras fueron

positivas [Vinje et al., 2004]. En un estudio colaborativo internacional para comparar

diferentes ensayos de PCR convencional para la detección y genotipificación de NoV en

Europa ninguno se destacó como el mejor [Vinje et al., 2003]. Cuatro de los cinco ensayos

de PCR convencional utilizaron el gen de la polimerasa que es el más utilizado en los

ensayos de campo [Ando et al., 1995; Green et al., 1995; Le Guyader et al., 1996; Maunula

et al., 1999]. Otro ensayo de PCR convencional utilizando la región NS detectó 100% de

las muestras positivas por microscopía electrónica, mientras que otros ensayos de PCR

convencional para los genes de la polimerasa y de la cápside detectaron un 31% y 77%,

respectivamente [Green et al., 1995; Jiang et al., 1999; Kojima et al., 2002]. El PCR

convencional diseñado por Jiang et al., en 1999 que utilizó el gen de la polimerasa tiene

ventaja sobre los otros ensayos de PCR convencional para detectar NoV y Sapovirus

simultáneamente [Jiang et al., 1999]

Las cuatro regiones diferentes (designadas A - D) del genoma han sido utilizados

exitosamente para la genotipificación de NoV [Kojima et al., 2002; Vinje et al., 2004]. Sin

embargo, la tipificación basada en los genes de la cápside (región C y D) permiten la mejor

diferenciación entre cepas (Figura 2). Aunque la secuencia de la región C ha sido utilizada

ampliamente para la genotipificación de cepas para el diagnóstico de laboratorios clínicos

en Estados Unidos, Europa y Japón, la resolución de esta región no es suficiente para

distinguir las diferencias entre ciertas variantes de GII.4, las cuales son las cepas

predominantes asociadas con brotes.

16

El estándar de oro para la genotipificación de cepas de NoV es la secuenciación completa

de la cápside. Sin embargo, en muestras clínicas con alto número de copias, la

amplificación parcial de la secuencia de la cápside es más práctica y es la única que es aún

menos discriminatoria que la secuenciación completa de la cápside [Vinje et al., 2004]. Por

esta razón, actualmente los laboratorios de investigación y el CDC (Centers for Disease

Control and Prevention) utilizan la región D para la genotipificacion.

Figura 2. Regiones del genoma de NoV usadas como diana para detección y

genotipificación. Las posiciones son basadas en la cepa Norwalk (GenBank No.

M87661)

17

5.6.3. Ensayo de PCR en tiempo real

Varios ensayos de PCR en tiempo real han sido desarrollados para mejorar la sensibilidad

en la detección de NoV en muestras de heces y del ambiente. Diferentes enfoques han sido

desarrollados, tomando ventaja de los primers inicialmente diseñados para PCR

convencional y tecnologías SYBR Green y TaqMan. Vainio et al., en el 2006 comparó

cuatro ensayos publicados [Hohne and Schreier, 2004; Jothikumar et al., 2005; Loisy et al.,

2005; Richards et al., 2004a]. Los resultados indicaron que los tres ensayos TaqMan

detectaron un número similar de muestras NoV positivas ( ≥ 88%) como lo hizo SYBR

Green (86%) [Richards et al., 2004a]. Trujillo et al., en el 2006 desarrollaron un PCR en

tiempo real para detectar GI, GII y GIV de NoV en muestras de heces utilizando primers

dirigidos a la región de unión ORF1-ORF2. El ensayo detectó un 98% (64/65) de muestras

NoV positivos que habían sido analizadas previamente por un ensayo de PCR

convencional.

El PCR en tiempo real ofrece ventajas obvias sobre los formatos de PCR convencional,

tales como la reducción del tiempo de análisis, mayor sensibilidad < 10 copias transcritas

por mezcla de reacción y cuantificación de partículas virales en el análisis de muestras. Sin

embargo, se necesita un poco de cuidado a la hora de interpretar los resultados. La

eficiencia del ensayo de PCR en tiempo real puede ser estimada analizando la fase

exponencial de la curva de amplificación. El método de PCR en tiempo real cuantitativo

presume que las secuencias dianas y las muestras son amplificadas con eficiencias

similares. Sin embargo, pequeñas variaciones en la eficiencia reflejan una disminución en

la actividad de la ADN polimerasa entre los estándares y las muestras que pueden tener un

impacto negativo en la cuantificación.

18

5.6.3.1 Terminología en el análisis del PCR en tiempo real

Existen 3 pasos principales que integran la reacción del PCR en tiempo real y las

reacciones son generalmente ejecutadas por 40 ciclos. Los pasos son 1) Desnaturalización:

aquí la temperatura debería ser apropiada para la polimerasa (usualmente 95°C). El tiempo

de la desnaturalización puede aumentarse si los contenidos de Guanina y Citosina en el

amplicon son altos 2) Hibridación: utiliza temperaturas apropiadas basadas en el cálculo

del Tm de los primers (5°C por debajo del Tm de los primers) y 3) Extensión: entre 70 -

72°C, la actividad de la ADN polimerasa es óptima, y la extensión de los primers sucede a

rangos por encima de 100 bases por segundo.

Línea Base. La línea base en la reacción del PCR en tiempo real se refiere al nivel de señal

durante los ciclos iniciales del PCR en tiempo real, usualmente de 3 a 15 ciclos, en los

cuales hay pequeños cambios en la señal de la fluorescencia. El nivel bajo de señal de una

línea base puede ser comparado al fondo o al “ruido” de la reacción. La línea base en un

PCR en tiempo real es determinado empíricamente para cada reacción, utilizando manuales

teóricos ó análisis automatizados de la marca de ampliación. La línea base puede ser

ajustada cuidadosamente para permitir una determinación precisa del Ct, definido

posteriormente. La determinación de la línea base debe de tomar en cuenta suficientes

ciclos para eliminar el fondo encontrado en los primeros ciclos de la amplificación, pero no

debe incluir los ciclos en los cuales la señal de amplificación comienza aumentar por

encima del fondo. Cuando se comparan diferentes experimentos de PCR en tiempo real, la

línea base debería ser definida en la misma forma para cada experimento [Dorak, 2007].

Umbral. El umbral de la reacción del PCR en tiempo real es el nivel de la señal que refleja

un aumento estadísticamente significativo por encima de la señal de la línea base calculada.

Esta es ajustada para distinguir señales de amplificaciones relevantes del fondo.

19

Generalmente, el software del instrumento del PCR en tiempo real automáticamente ajusta

el umbral a 10 veces la desviación estándar del valor de la señal de fluorescencia de la línea

base. Sin embargo, la posición del umbral puede ser ajustado en cualquier punto en la fase

exponencial del PCR en tiempo real [Dorak, 2007].

Threshold Cycle (Ct). El Ct es el número de ciclos donde la señal de fluorescencia de la

reacción cruza el umbral. El Ct es utilizado para calcular el número de copias inicial de

ADN, ya que el valor de Ct es inversamente proporcional a la cantidad inicial de producto

(Figura 3) [Dorak, 2007].

Figura 3. Gráfica de amplificación en el PCR en tiempo real.

Curva estándar. Series de diluciones de concentraciones conocidas de amplicones que

pueden ser utilizadas para establecer una curva estándar, y así poder determinar la cantidad

de amplicon iniciadora de estudio o evaluar la eficiencia de la reacción. El logaritmo de

cada concentración conocida en la serie de diluciones (eje x) es marcado contra los valores

de Ct para esa concentración (eje y).

20

De esta curva estándar, se obtiene información acerca de la ejecución de la reacción así

como de varios parámetros de la reacción (incluyendo pendiente, coeficiente de correlación

e intercepto-y) pueden ser derivados. Las concentraciones escogidas en la curva estándar

pueden incluir el rango de concentración esperada del estudio [Dorak, 2007].

Coeficiente de correlación (R2). El coeficiente de correlación es una medida de como los

datos ajustan la curva estándar. El valor de R2 refleja la linealidad de la curva estándar.

Idealmente, un R2=1, aunque generalmente 0.999 es el valor máximo [Dorak, 2007].

Intercepto-y. Corresponde al límite de detección teórico de la reacción ó el valor de Ct

esperado sí el número de copias de las moléculas en estudio denotan en el eje de las x un

aumento en la amplificación estadísticamente significativo. Aunque el PCR en tiempo real

es teóricamente capaz de detectar una sola copia, un número de copias de 10 es

especificado comúnmente como el nivel más bajo que se puede cuantificar realmente

utilizando el PCR en tiempo real. Esto limita el uso de los valores del intercepto-y que

pueden ser útiles para comparar diferentes sistemas de amplificación [Dorak, 2007].

Fase Exponencial. En el PCR en tiempo real es mejor cuantificar los productos de la

amplificación (amplicones) al inicio de la fase exponencial ó al final, cuando la curva busca

el Plateau (Figura 3). Al inicio de la fase exponencial, todos los reactivos están en exceso,

la ADN polimerasa está altamente eficiente, y el producto que está presente en bajas

cantidades no competirá con la capacidad de hibridación de los primers [Dorak, 2007].

Pendiente. La pendiente de la fase exponencial de la reacción de amplificación es una

medida de la eficiencia de la reacción. Para obtener resultados precisos y reproducibles, las

reacciones deben tener una eficiencia ideal del 100%, equivalente a una pendiente de -3.32.

La eficiencia se determina según la siguiente ecuación, eficiencia= 10(-1/pendiente) – 1.

Un PCR en tiempo real con una eficiencia ideal del 100% debería duplicar el número de

amplicones en cada ciclo, es decir el porcentaje de eficiencia refleja la capacidad de

amplificación en cada ciclo de una reacción de PCR en tiempo real.

21

Los factores experimentales tales como la longitud, estructuras secundarias y contenido de

GC del amplicon pueden influenciar la eficiencia. Otras condiciones es la dinámica de la

reacción por sí misma, el no utilizar concentraciones de reactivos óptimas y la calidad de la

enzima, puede resultar en una eficiencia por debajo del 90%. La presencia de inhibidores en

uno o más reactivos en el PCR en tiempo real pueden producir una eficiencia de más de

110%. Una buena reacción debería tener una eficiencia entre un 90 - 110% que corresponde

a una pendiente entre -3.58 y -3.10 [Dorak, 2007].

Rango dinámico. Es el rango de concentración inicial del amplicon sobre el cual se

obtienen valores de Ct precisos. Si se utiliza controles endógenos en el método de

cuantificación el rango dinámico del amplicon y del control deben ser comparables. En la

cuantificación absoluta la interpolación dentro de este rango es exacta, pero la

extrapolación más allá del rango dinámico se debe evitar. Cuando mayor sea el rango

dinámico, mayor será la capacidad de detectar muestras con bajo y alto número de copias

en una misma reacción [Dorak, 2007].

Curva de disociación. Es la curva gráfica de los cambios en la fluorescencia que se

producen por la liberación de los fluoróforos cuando se disocia el ADNds a medida que

aumenta la temperatura. El análisis de la curva de disociación después del PCR en tiempo

real es una simple y fuerte forma de revisar las reacciones del PCR en tiempo real de los

artefactos, los dímeros de primers, la contaminación y asegurar la especificidad de la

reacción. Debido a que la temperatura de disociación de los ácidos nucléicos es afectada

por el contenido de Guanina y Citosina y la presencia de bases “mismatches” entre otros

factores, diferentes productos de PCR en tiempo real pueden ser distinguidos con

frecuencia por sus características de disociación. La caracterización de los productos de la

reacción por medio del análisis de la curva de disociación reduce la necesidad de consumir

tiempo con el gel de electroforesis [Dorak, 2007].

22

El análisis de la curva de disociación puede ser formado solamente con las tecnologías de

detección del PCR en tiempo real en el cual el fluoróforo permanece asociado con la

amplificación. Las amplificaciones que han sido usadas en SYBR Green o con primers

LUX pueden ser sometidos al análisis de la curva de disociación.

Los dímeros de primers se producen cuando dos primers con secuencias homólogas se

unen unas con otras en el producto. El análisis de la curva de disociación puede identificar

la presencia de dímeros de primers debido a que ellos exhiben una temperatura de

disociación menor a la de los amplicones. La presencia de dímeros de primers no son

deseables en muestras que contienen producto, ya que estos disminuyen la eficiencia del

PCR en tiempo real [Dorak, 2007].

Para llevar a cabo la curva de disociación, en el instrumento del PCR en tiempo real debe

ser programado para incluir un perfil de disociación seguido inmediatamente del protocolo

de la termociclación. Después de que la amplificación es completada el instrumento

recalentará los productos amplificados para dar datos de la curva de disociación completa.

La mayoría de las plataformas de los instrumentos de PCR en tiempo real incluyen esta

característica dentro de sus paquetes de análisis. Los pasos para la programación consisten

en un calentamiento rápido de la muestra amplificada a 94°C para desnaturalizar el ADN,

calentar lentamente la muestra a 60°C (por aumento de la temperatura a 0.2°C/segundo)

mientras se marcan las señales de la fluorescencia versus temperatura (a medida que la

temperatura aumenta y el ADNds se disocia, la señal de la fluorescencia disminuirá)

[Dorak, 2007].

23

5.6.3.2. Químicas usadas en el PCR en tiempo real

Un paso clave en el diseño de un PCR en tiempo real es la selección de la química que

controlan la amplificación de la secuencia diana. La variedad de los productos químicos

fluorescentes disponibles se pueden clasificar así:

• Fluoróforos unidos al ADN (tecnologías de SYBR Green I y SYBR GreenER).

• Primers Fluorescentes (primers LUX, Amplifuor y BDQzyme).

• Sondas Fluorescentes (sondas TaqMan, Escorpiones y Beacons moleculares).

Las químicas comúnmente utilizadas para el PCR en tiempo real son SYBR Green y las

sondas TaqMan. La química que se seleccione para el ensayo del PCR en tiempo real

depende de la aplicación, del formato (monoplex o multiplex) y del costo. En general, las

reacciones simples con fluoróforos unidos al ADN pueden ser preferibles debido a que

estos ensayos son más fácil de diseñar, más rápidos de instalar y más rentables. Sin

embargo, no permite la detección de diferentes secuencias dianas en una misma reacción,

como lo hace TaqMan, que usa sondas que permiten reconocer diferentes secuencias dianas

[Dorak, 2007].

Fluoróforos unidos al ADN

El sistema más común para la detección de ADN amplificado es el uso de fluoróforos

intercalados que emiten fluorescencia cuando se une al ADNds (Figura 4). La tecnología de

SYBR Green I y SYBR GreenER utilizan este tipo de método de detección. La

fluorescencia del fluoróforo unido al ADN aumenta significativamente cuando se une al

ADNds. La intensidad de la señal de fluorescencia depende de la cantidad de ADNds que

está presente.

24

Figura 4. Los fluoróforos emiten fluorescencia cuando se unen al ADNds.

Las ventajas de utilizar fluoróforos que se unen al ADN incluyen diseños de ensayos

sencillos (sólo se necesita un par de primers y no se requieren diseños con sondas), la

habilidad de detectar múltiples genes rápidamente sin el diseño de múltiples sondas, de bajo

costo en comparación con otros sistemas de detección y la habilidad de elaborar una curva

de disociación para verificar la especificidad de la amplificación en la reacción [Dorak,

2007].

El análisis de la curva de disociación puede ser utilizada para identificar los diferentes

productos de reacción, incluyendo productos no específicos. Después de completar la

reacción de amplificación, la curva de disociación es generada por el aumento de la

temperatura en pequeños incrementos y las señales de fluorescencia son monitoreadas en

cada paso. Como el ADNds en la reacción de desnaturalización se disocia la fluorescencia

decrece. Los primeros derivados negativos del cambio en la fluorescencia son marcados en

función de la temperatura. Un pico característico del Tm del amplicon se distingue de los

otros productos, como dímeros de primers, los cuales se disocian a diferentes temperaturas.

25

Esta tecnología, aunque simple, puede carecer de especificidad debido a que el fluoróforo

colorante se une indiscriminadamente a todos los ADNds formados durante el PCR en

tiempo real, no sólo al ADN diana. Además, los artefactos del PCR en tiempo real, como

dímeros de primers y productos de amplificación inespecífica, pueden ser detectados y

contribuir a la señal de la fluorescencia total. El diseño de buenos primers y la calidad de

los reactivos del sistema son críticos para evitar la formación de productos inespecíficos

[Dorak, 2007].

Primers fluorescentes

En general, estas químicas toman ventaja sobre los trasferidores de energía de resonancia

fluorescente (FRET), como TaqMan y Beacons moleculares, porque aseguran que la

fluorescencia específica sea detectada sólo en presencia del producto amplificado. Los

primers están marcados con un fluoróforo reportero, que emite fluorescencia únicamente

cuando se une a la secuencia diana.

LUX. Emplean dos primers, uno en forma de horquilla con un reportero fluorescente unido

en el extremo 3´. Aquí el reportero está apagado por la estructura secundaria de la

horquilla, durante la amplificación el primer LUX es incorporado dentro del producto y el

reportero emite fluorescencia (Figura 5).

Figura 5. El primer LUX forma una horquilla que tiene un reportero apagado que

durante la amplificación emite fluorescencia cuando es incorpora dentro del producto.

26

Amplifluor. Emplean dos primers específicos y un primer universal llamado Uniprimer.

Uno de los primers específicos contiene una secuencia en la terminal 5´ llamada secuencia-

z, que también se encuentra en el extremo 3´ del Uniprimer. El Uniprimer forma una

estructura de horquilla. Un reportero fluorescente y un apagador se unen a los extremos 5´ y

3´ en la estructura del tallo, respectivamente. En la conformación de la horquilla, el

reportero de fluorescencia se apaga debido a su proximidad con el apagador. Durante el

primer ciclo de amplificación, uno de los primers específicos (con la secuencia-z) se

hibrida con la secuencia diana y se extiende. Durante el segundo ciclo de la amplificación,

el segundo primer específico es utilizado para sintetizar la secuencia diana que contiene

una secuencia complementaria para la secuencia-z. El producto de la segunda amplificación

puede servir como molde para el Uniprimer. En el tercer ciclo de amplificación, el

Uniprimer se extiende y sirve como molde para el próximo ciclo de amplificación. En el

cuarto ciclo de la amplificación, la extensión del amplicon a través de la región de la

horquilla del Uniprimer hace que este se abra y adopte una configuración lineal que permite

que el reportero emita fluorescencia. La amplificación exponencial utilizando un segundo

primer específico Uniprimer sucede en los ciclos de las amplificaciones posteriores. La

señal de la fluorescencia es proporcional al producto amplificado.

BD QZyme. Emplean un primer específico zymogen, un primer específico reverso y un

sustrato de oligonucleótido universal. El oligonucleótido contiene un reportero fluorescente

en el extremo 5´ y un apagador en el extremo 3´. Cuando el sustrato de oligonucleótido está

intacto, la fluorescencia del reportero es apagada por el apagador debido a su proximidad.

El primer zymogen contiene una secuencia que codifica un ADN catalítico. Durante el

primer ciclo de amplificación, el primer zymogen se extiende. En el segundo ciclo, el

producto del primer ciclo es utilizado como molde por el primer específico reverso que se

extiende para crear una secuencia nueva que contiene una región ADN catalítica.

27

En la siguiente etapa de hibridación, el sustrato de oligonucleótido marcado

fluorescentemente hibrida la secuencia de ADN catalítico y se separa. Esta división separa

al reportero del apagador resultando en una señal fluorescente que es proporcional al

producto amplificado [Dorak, 2007].

Sondas fluorescentes

Son sondas de hibridación que emplean una sonda con secuencia específica de

oligonucleótidos y dos secuencias de primers específicas. La sonda está diseñada para que

se una a las secuencia diana. La sonda lleva un colorante donador en su extremo 5´ y un

colorante aceptor en su extremo 3´ (apagador). El donante y el receptor de los fluoróforos

se seleccionan de manera que el espectro de emisión del fluoróforo donador se traslape de

forma significativa con el espectro de excitación del fluoróforo receptor, mientras que el

espectro de emisión del fluoróforo del donante es espectralmente separado del espectro de

emisión del fluoróforo aceptor. La excitación se realiza en una longitud de onda específica

para el fluoróforo del donante, y la reacción se controla con la emisión de longitud de onda

del fluoróforo aceptor. Durante la etapa de hibridación del PCR en tiempo real, las sondas

se hibridan con sus secuencias dianas [Dorak, 2007].

TaqMan. Emplean una secuencia específica, sondas de oligonucleótidos marcadas

fluorescentemente llamadas sondas TaqMan, agregadas a la secuencia específica del primer

(Figura 6). También conocidos como ensayos nucleasa-5´, el ensayo TaqMan utiliza la

actividad de la exonucleasas 5´de ciertas polimerasas termoestables, como la Taq. La sonda

contiene un reportero fluorescente unido al extremo 5´ y un apagador unido al extremo 3´.

Cuando se juntan la fluorescencia del reportero es apagada debido a la proximidad con el

apagador [Dorak, 2007].

28

Figura 6. Sondas TaqMan. En la hibridación la sonda se une a la secuencia diana, en

la extensión la sonda es desplazada y el reportero es separado emitiendo fluorescencia.

Durante los pasos de hibridación y extensión de la reacción de amplificación, la sonda

hibrida la secuencia y la actividad de la exonucleasa 5´ → 3´ de la Taq específica del

ADNds separa al reportero. Como resultado, el reportero es separado de su apagador, y la

señal de fluorescencia resultante es proporcional a la cantidad de producto amplificado en

la muestra. La ventaja más importante de utilizar las sondas TaqMan incluye la alta

especificidad y la habilidad de llevar a cabo reacciones de multiplex. La desventaja es que

el costo inicial de las sondas es alto y el diseño del ensayo son pocos triviales [Dorak,

2007].

Beacons moleculares. Emplea un par de primers específicos y una sonda que contiene una

secuencia específica que reconoce la secuencia diana, en el extremo 5`de la sonda esta el

fluoróforo y en extremo 3`el apagador. En ambos extremos de la sonda hay secuencias

complementarias (5 nt) que al unirse forman un horquilla, que mantiene apagada la

fluorescencia. Cuando la sonda encuentra su secuencia diana la horquilla se abre y el

reportero al separarse del apagador fluórese (Figura 7). La secuencia diana del Beacon está

diseñado para hibridar específicamente la sección de 15 – 30 nt de la secuencia blanco

[Dorak, 2007].

29

Figura 7. La molécula Beacon forma una horquilla que al unirse con la secuencia

diana se abre separando la sonda del apagador emitiendo fluorescencia.

A diferencia de los ensayos TaqMan, las moléculas Beacons son desplazadas pero no

destruidas durante la amplificación, ya que la ADN polimerasa carece de la actividad de la

exonucleasa 5´. La cantidad de fluorescencia emitida por el reportero en el ensayo Beacons

es proporcional a la cantidad de producto amplificado en la reacción. [Dorak, 2007]

El Beacons molecular tiene algunas ventajas sobre otras químicas de detección. Estos son

muy específicos y se pueden utilizar para las reacciones de multiplex y si la secuencia

blanco no coincide exactamente con la secuencia Beacons la hibridación y la fluorescencia

no ocurrirán. La principal desventaja del uso de esta química radica en el diseño de los

tallos de la horquilla que deben ser lo suficientemente fuerte para que la molécula no se

pliegue de forma espontánea en conformaciones no deseadas. Al mismo tiempo el tallo de

la horquilla no debe ser demasiado fuerte, ó el Beacons no puede hibridar adecuadamente la

secuencia blanco [Dorak, 2007].

30

Escorpión. Emplean dos primers específicos, uno de los cuales sirven como una sonda y

contiene una estructura de tallo-lazo con un reportero en el extremo 5´ y un apagador en el

extremo 3´ (Figura 8). La secuencia de la sonda Escorpión es complementaria a una parte

interna de la secuencia diana en la misma cadena. Durante el primer ciclo de amplificación,

el primer Escorpión se extiende y la secuencia complementaria al lazo es generada en la

misma cadena.

Figura 8. La sonda Escorpión en su estructura lazo-tallo no emite fluorescencia,

posteriormente al unirse con su secuencia diana el reportero se separa y fluórese.

La sonda Escorpión contiene un bloqueador de PCR en el apagador del extremo 3´ para

evitar la lectura durante la extensión a través de la cadena opuesta. Después de la

desnaturalización e hibridación posterior, el lazo de la sonda Escorpión hibrida a la

secuencia diana mediante una interacción intramolecular y el reportero se separa del

apagador. La señal fluorescente es proporcional al producto amplificado de la muestra

[Dorak, 2007].

31

Eclipse. Emplean dos primers y una sonda de secuencia específica de oligonucleótidos. La

sonda se une a una secuencia complementaria dentro de la amplificación y contiene un

reportero fluorescente en el extremo 3´, un apagador en su extremo 5´, y un surco menor

unido (MGB). La sonda no hibridada adopta una conformación que permite que el

reportero y apagador juntos, mantengan apagado al reportero.

Durante la etapa de hibridación del PCR en tiempo real, la sonda se hibrida con la

secuencia diana con la ayuda del MGB (Figura 9). La sonda se desdobla linealmente,

separando el reportero y apagador permitiendo que el reportero emita fluorescencia. La

señal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto amplificado [Dorak, 2007].

Figura 9. La sonda Eclipse se hibrida con la secuencia diana con la ayuda del MGB

(línea roja). La sonda se desdobla linealmente separando reportero y apagador

emitiendo fluorescencia.

32

5.6.3.3 Moléculas fluorescentes utilizadas en PCR en tiempo real

Las moléculas fluorescentes (fluoróforo) absorben luz en forma de fotones en un rango

estrecho de longitud de onda. La longitud de onda máxima de absorción es también llamada

longitud de onda de excitación. Después de la excitación, la molécula alcanza un estado de

energía más alto, este estado de energía es transitorio y de corta duración. La molécula

excitada decae rápidamente, volviendo a su estado basal de energía. Cuando esto ocurre, un

fotón de luz es emitido en una longitud de onda mayor. La luz que se libera es la longitud

de onda de emisión. Este cambio entre las longitudes de ondas de excitación y de emisión

se denomina “shift Stoke” (cambio de Stoke). Para cada fluoróforo hay una longitud de

onda óptima de excitación y de emisión. Las moléculas fluorescentes con “cambios de

Stoke” mayores son las más convenientes ya que permiten la separación más limpia de

longitud de onda de excitación y de emisión de la luz [Dorak, 2007].

Un requisito fundamental para cualquier ensayo fluorescente es que la intensidad de la

señal inicial y final tengan diferencias tan grandes como sea posible. Esto se llama el

ensayo “delta”. Todos los ensayos fluorescentes para el PCR en tiempo real logran este

“delta” mediante la utilización de FRET (transferidores de energía de resonancia

fluorescente). Los FRET requieren de dos moléculas que pueden interactuar entre sí, por lo

menos uno de los cuales puede ser capaz producir fluorescencia. El componente

fluorescente se llama donante y la segunda molécula se llama aceptor. Durante el FRET, el

colorante fluorescente donante es excitado por una fuente de energía externa de luz en ó

cerca de su longitud de onda de excitación óptima y entonces emite una luz en un cambio

mayor de longitud de onda (“cambio de Stoke”).

En lugar de ser detectado por el instrumento, la luz emitida se utiliza para excitar a la

molécula aceptora, que está en estrecha proximidad física. La molécula aceptora absorbe la

energía de luz emitida por el donante fluorescente, apagando eficientemente la señal del

donador [Dorak, 2007].

33

La longitud de onda emitida por la molécula donante debe estar cerca del máximo de

absorción de la molécula aceptora. La molécula aceptora puede o no emitir luz. Si la luz es

emitida por el aceptor, el cambio será mayor así como la longitud de onda, que aquella

emitida por el donante. La señal del aceptor será detectada por el instrumento en tiempo

real, pero no se registrará como una señal de reportero por el software. Los FRET dependen

de que las moléculas del donante y del aceptor estén muy cerca (10 – 100 Å) y disminuye

con el aumento de la distancia. Algunos de los donantes y colorantes aceptores (reportero y

apagador) más habituales que se utilizan actualmente en el PCR en tiempo real se muestran

en la Tabla Nº 1 [Dorak, 2007].

Hay tres clases de fluoróforos utilizados en el PCR en tiempo real. Los tres tipos se definen

por su función dentro de un ensayo. Los primeros son fluoróforos donantes, también

llamados reporteros. La señal fluorescente del reportero es el que se controla durante el

transcurso del experimento (ejemplo FAM). Los segundos son fluoróforos receptores o

extintores y son los responsables de la extinción inicial de la señal de reportero (ejemplo

BHQ). El último es el fluoróforo de referencia, el cual es común en todas las reacciones, no

interactúa con los componentes del ensayo y se utiliza para normalizar la señal de cada

pocillo en el software (ROX) [Dorak, 2007].

En teoría cualquier colorante fluorescente puede ser un reportero en un ensayo. El que se

utiliza con mayor frecuencia es FAM (6-carboxi fluoresceína). Este colorante es eficiente

para excitar a 448 nm, la longitud de onda producida por el láser argón-ión utilizado en los

instrumentos de ABI (Applied Biosystems Inc.,). FAM se ha mantenido como la primera

opción para otros instrumentos ya que puede ser fácilmente conjugado con oligonucleótidos

y da una fuerte señal. Otro reportero, utilizado hoy en día es SYBR Green I. A diferencia de

FAM, SYBR Green I es un colorante libre en el PCR en tiempo real y trabaja

proporcionando un dramático aumento en la fluorescencia cuando se une al ADNds [Dorak,

2007].

34

Las moléculas extintores pueden ser fluoróforos o cualquier molécula que pueda absorber

la energía de luz dentro del rango de longitud de onda apropiada. El fluoróforo apagador

original utilizado con el reportero FAM fue TAMRA (6-carboxi-tetrametilrodamina).

Cuando se acoplan los extremos de un oligonucleótido (Beacons), la señal del FAM se

apaga con eficiencia por la proximidad de TAMRA, debido al plegamiento oligo, en

solución. También hay fluoróforos apagadores conocidos como “hoyos negros” (BHQ:

Black Hole Quencher), los cuales apagan la señal del reportero y no emiten luz. Desde

hace tiempo se sabe que la fluoresceína de FAM se extingue con residuos de guanidina,

este fenómeno es el principio del funcionamiento del sistema LUX (Invitrogen), y también

es la explicación porque las sondas con reporteros fluorescentes nunca deben comenzar con

residuos de guanidina [Dorak, 2007].

35

Tabla Nº 1. Colorantes utilizados en el PCR en tiempo real.

36

6. MATERIAL Y MÉTODO

El diseño de este estudio involucra 3 etapas fundamentales: La primera es la optimización

de los parámetros químicos y termodinámicos de un PCR en tiempo real basado en SYBR

Green; la segunda es la validación del ensayo de PCR en tiempo real utilizando muestras

clínicas, sin diagnóstico de NoV, y a su vez analizar el mismo material con un PCR

convencional y la tercera consiste en la evaluación de las propiedades del nuevo ensayo de

PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de NoV.

6.1. Optimización de los parámetros químicos y termodinámicos

Se realizó la optimización de los siguientes parámetros químicos y termodinámicos del

PCR en tiempo real: volumen de muestra, concentración de primers, temperatura de

hibridación de los primers, temperatura de disociación (Tm) del amplicon y reacciones

cruzadas con otros virus que infectan el intestino.

6.1.2. Material biológico de referencia.

Panel con NoV: En total se utilizaron 10 muestras de referencia de NoV detectados

previamente en Nicaragua. Las secuencias de nucleótidos de estas muestras se encuentran

disponibles en el GenBank. En total 6 pertenecen al GII, y 4 al GI. Las muestras del GII

pertenecen a los genotipos, GII.2, GII.4, GII.17 y GII.18 NICA (GenBank N° de acceso:

EU780735 (32), EU780757 (482), EU780764 (696), EU780739 (166), EU780768 (735) y

EU780755 (432)) y las GI pertenecen a los genotipos GI.2, GI.4, y GI.11 (Genbank N° de

acceso: HM055926 (741), HM055935 (394), HM055939 (771) y HM055040 (826))

[Bucardo et al., 2008].

Panel reacciones cruzadas: Para investigar reacciones cruzadas se preparó un panel con

muestras de referencia de Rotavirus (GI [P8]), Sapovirus humanos (GI.1), Sapovirus

porcino, Poliovirus (Tipos I, II, III), Astrovirus y Adenovirus.

37

6.1.3. Volumen de ADNc para NoV GI y GII

Se probaron diferentes volúmenes de muestra de ADNc para NoV GI y GII de 1µl, 1.5µl, 2

µl, 2.5 µl y 3 µl. Para ello se utilizó el panel de muestras con NoV y se ensayó por

duplicado un PCR en tiempo real.

6.1.4. Concentración óptima de primer.

Los primers utilizados fueron NVG1f1b mwg® [20nM], NVG1rlux mwg® [20nM],

NVG2flux1 mwg® [20nM] y COG2R cibergene® [109.96 pmol], los cuales amplifican un

segmento de 87-pb y 88-pb en el traslape de ORF1-ORF2 en el genoma de los NoV GI y

GII, respectivamente [Nordgren et al., 2008] (Tabla N° 2). Todos los primers fueron

reconstituidos con agua libre de nucleasas y se preparó una solución de trabajo de 10

pmol/µl. Para investigar la concentración óptima de primers se analizaron las siguientes

concentraciones finales: 50nM, 100nM, 200nM, 400nM y 800nM.

Tabla N° 2. Primers utilizados para la detección de NoV mediante el método de PCR

convencional y PCR en tiempo real.

Primer Secuencia (5´→ 3´)b Localización Región Tamaño Ref.a

289h TGACGATTTCATCATCACCATA 4865-4886

RdRp

289i TGACGATTTCATCATCCCCGTA 4865-4886

290h GATTAC CCAGGTGGTGGGACTCCAC 4568-4590 319-pb 1

290i GATTACTCCAGGTGGTGGGACTCAAC 4568-4590

290j GATTACTCCACCTGGGATTCAAC 4568-4590

290k GATTACTCCACCTGGGATTCCAC 4568-4590

GI

NVG1f1b CGYTGGATGCGNTTCCATGA 5291-5310 ORF1-ORF2 87-pb 2

NVG1rlux GTCCTTAGACGCCATCATC 5397-5379 2

GII

NVG2flux1 ATGTTYAGRTGGATGAGRTTYTC 5012-5034 ORF1-ORF2 88-pb 2

COG2R TCGACGCCATCTTCATTCACA 5100-5080 3 a. Ref = referencia. 1 [Zintz et al., 2005] , 2 [Nordgren et al., 2008], 3 [Kageyama et al., 2003]. b. Código de ambigüedad: Y, Pirimidina (C/T); R, Purina (A/G); N, A, G, C o T.

38

6.1.5. Temperatura óptima de hibridación de los primers.

Las temperaturas de hibridación teóricas para los primers utilizados en este estudio están en

el rango de 50 – 60ºC. Con el fin de determinar la temperatura de hibridación experimental

para cada genogrupo se realizaron 3 diferentes experimentos con las siguientes

temperaturas: 50°C, 55°C y 60°C.

6.1.6. Temperatura de disociación (Tm) óptima de los amplicones.

En este ensayo se determinó el Tm teórico y el Tm práctico de los amplicones. Para

calcular el Tm teórico se utilizaron secuencias de referencias con diferentes genotipos de

GI y GII de NoV (Tabla N° 3), las secuencias se seleccionaron en el GenBank y

posteriormente se alinearon utilizando el programa bioinformático Bioedit™, se identificó

la secuencia positiva y negativa donde se unen los primers correspondientes a un segmento

de 87-pb para GI y 88-pb para GII. Cada una de las secuencias de GI y GII fue introducida

en el programa Oligocalculator™ para calcular la media de los Tm más 2 desviación

estándar y se obtuvo el Tm teórico para GI y GII.

Para calcular el Tm experimental se utilizó el panel de muestras con NoV descritas

anteriormente y se ensayaron en un PCR en tiempo real. Se determino el Tm de cada una de

las muestras y se calculó la media de los Tm más 2 desviación estándar, determinando así

el Tm práctico óptimo para GI y GII.

39

Tabla N° 3. Secuencias de referencias de NoV utilizadas para determinar el Tm

teórico del amplicon.

G. Genotipos Nombre N° de acceso en GenBank

GI.1 NV-USA93 M87661

GI.2 SOV-GBR93 L07418

GI.3 DSV-USA93 U04469

GI.4 Chiba-JPBN00 AB042808

GI.6 Hesse-DEU98 AJ277614

GII.1 Hawaii-USA94 U07611

GII.2 Msham-GBR95 X81879

GII.3 Toronto-CAN93 U02030

GII.4 Bristol-GBR93 X76716

GII.4 Lordsdale-93 X86557

GII.9 VABeach-USA01 AY038599

GII.11 SW918-JPN01 AB074893

GII.16 Tiffin-USA03 AY502010

GII.17 CSE1-USA03 AY502009

40

6.2. Validación de PCR en tiempo real para la detección de Norovirus GI y GII.

6.2.1. Muestras clínicas

Un total de 60 muestras de heces sin diagnóstico de NoV fueron seleccionadas

aleatoriamente de una colección de 253 muestras de niños ≤ 5 años con diarrea aguda

procedentes del barrio Rubén Darío y del Hospital Escuela Oscar Danilo Rosales Argüello

(HEODRA) de la ciudad de León. Estas muestras fueron analizadas con un PCR

convencional descrito por Jiang et al., en 1999 y modificado por Zintz et al., en el 2005.

Posteriormente las mismas muestras fueron analizadas con el PCR en tiempo real SYBR

Green descrito en este estudio.

6.2.2. Extracción del ARN viral

Para realizar la extracción del ARN viral, la suspensión de heces (1:10) fue descongelada a

4°C y centrifugadas a 5000 rpm por 3 minutos. Se tomaron 200 µl del sobrenadante, y

ARN viral fue extraído y purificado con el kit High Pure ARN isolation (ROCHE)

siguiendo las especificaciones del fabricante. Un total de 50 µl de ARN aislado fue

obtenido y guardado a -20°C hasta su posterior análisis (Anexo #1).

6.2.3. Reverso transcripción

Con 28 µl de ARN extraído en el paso anterior, se realizó una mezcla del random primer

dexadeoxynucleotidos (pd (N)6) [50 pmol] y agua libre de nucleasas para completar un

volumen final de 50 µl, se desnaturalizó a 97°C por 5 minutos, y rápidamente se colocó

sobre hielo por 2 minutos, luego se agregó una bead de RT-PCR (Amersham Biosciences,

United Kingdom) y la reacción de reverso transcripción se llevó a cabo a 42°C por 30

minutos en un termociclador y así obtener el ADNc.

41

6.2.4. PCR convencional

Los productos de la reverso transcripción fueron amplificados por el método de PCR

convencional para NoV utilizando los primer degenerados p289hi/290hijk dirigidos al gen

que codifica para la RdRp en la región ORF1 del genoma de NoV, resultando en un

amplicon de 319-pb para NoV (Tabla N° 2). Para la reacción de PCR convencional se

utilizó 1 µl de primer, una bead de PCR PuRe Taq-Ready-To-Go™ (Amersham

Biosciences, United Kingdom), 2.5 µl de ADNc y 21.5 µl de agua libre de nucleasas para

completar un volumen final de 25 µl. El termociclador (GeneAmp® 2700 Applied

Biosystems) fue programado de la siguiente forma: 94°C por 3 minutos, 40 ciclos a 94°C

por 30 segundos, 49°C por 1 minuto y 20 segundos, y 72°C por 1 minuto, y una elongación

final a 72°C por 10 minutos. Los productos del PCR fueron evaluados en una electroforesis

en gel de agarosa al 2% seguido por su visualización bajo luz ultravioleta (Anexo #2)

[Jiang et al., 1999; Zintz et al., 2005].

6.2.5. PCR en tiempo real basado en SYBR Green

El PCR en tiempo real fue realizado en un equipo 7500 Real-Time PCR Systems (Applied

Biosystems) utilizando un kit Fast Start SYBR Green® PCR Master (ROCHE). Se preparó

un master mix conteniendo 12.5µl de 2X Fast Start SYBR Green PCR Master, se agregaron

los primers para GI y GII de NoV a una concentración de 400nM cada uno y 8 µl de agua

libre de nucleasas, se agregó 2.5 µl de ADNc para completar un volumen final de reacción

de 25 µl. El equipo fue programado para un precalentamiento a 95°C por 5 minutos, luego

40 ciclos a 95°C por 15 segundos, una temperatura de hibridación de 55°C por 30

segundos, y una elongación a 72°C por 1 minuto (Anexo #3). Para investigar el Tm de cada

uno de los amplicones, se incremento la temperatura desde 60°C hasta 95°C, a una

velocidad de 0.1°C/s, la fluorescencia de cada reacción fue registrada para elaborar una

curva de disociación. El Tm de cada amplicon corresponde a la lectura más baja de

fluorescencia. Una muestra se consideró positiva cuando la fluorescencia de la reacción

sobrepasó el Ct óptimo y el Tm del amplicon era de 76.1 ± 0.6ºC para GI y 77.1 ± 0.6ºC

para GII.

42

6.3. Evaluación de las propiedades del ensayo de PCR en tiempo real.

6.3.1. Estándares de Norovirus GI y GII.

Los estándares de NoV GI y GII son plásmidos extraídos de Escherichia coli ultra

competentes (XL10-Gold, Stratagene) que habían sido transformadas con el vector pPCR-

Script Amp SK(+) (Stratagene) que contenían un inserto del extremo 5’ del gen de la

cápside de NoV GI (597-bp) o de NoV GII (1188-bp). Estos segmentos corresponde a las

variantes genéticas GI.4 y GII.4 de NoV aislados de muestras clínicas [Nordgren et al.,

2008]. Las Escherichia coli clonadas fueron gentilmente proporcionadas por el Dr. Lennart

Svensson del laboratorio de Virología Molecular de la Universidad de Linköping de Suecia.

6.3.2. Generación de la curva estándar.

La curva estándar se realizó utilizando una serie de siete diluciones 1:10 a partir de una

solución estándar que contiene 0.5 x 108 plásmidos/µl de GI o GII. El rango dinámico de

cada una de estas series fue de 107 a 101. Se colocó 2.5 µl de cada estándar en una reacción

de PCR en tiempo real, cuyo volumen final fue de 25 µl, como se describió anteriormente.

Una vez que se obtuvieron las lecturas de intensidad de fluorescencia (∆Rn) de cada uno de

los estándares de la serie, se realizó un análisis de regresión lineal simple y se determinaron

el valor de la pendiente y el coeficiente de correlación (R2). Estos parámetros permiten

determinar la eficiencia, reproducibilidad y el rango dinámico de detección del método de

PCR en tiempo real basado en SYBR Green. El límite de detección se estableció calculando

el promedio de las lecturas fluorescencia del ruido (∆Rn) más 10 desviaciones estándar. El

límite de cuantificación se determinó de acuerdo al modelo de regresión lineal, es decir, el

rango de concentraciones donde el método mantiene la linealidad.

43

6.4. Análisis Estadísticos

Las análisis de la curva estándar se obtuvieron mediante un modelo de regresión lineal

utilizando el software HID Real-time PCR Analysis v 1.1 para Applied Biosystems 7500

Real-time PCR. Para medir la concordancia entre el ensayo de PCR convencional y PCR en

tiempo real SYBR Green se calculó el índice de Kappa utilizando el programa estadístico

SPSS (Statistical Program for Social Science, Inc. Chicargo, IL) versión 17.

44

7. RESULTADOS

7.1. Optimización de los parámetros químicos y termodinámicos del PCR en tiempo

real.

7.1.1. Volumen de muestra

El volumen óptimo de muestra de ADNc tanto para GI como para GII está en el rango de

1.5 - 3 µl. Con estos volúmenes se obtuvo la mejor eficiencia en la amplificación del ADNc

viral, reflejados en cambios en la fluorescencia (∆Rn) mayores y en Ct menores (Ct = 29).

Con 1 µl de muestra el cambio en la fluorescencia (∆Rn) fue menor y el Ct fue alto (Ct =

31), como era de esperarse. En cambio cuando se utilizaron volúmenes de muestra en el

rango descrito (1.5 - 3 µl) no se observaron cambios significativos en el Ct, por lo tanto el

volumen de muestra seleccionado fue el promedio (Figura 10).

Figura 10. Determinación del volumen óptimo de ADNc (GI), en el eje x se grafica los

ciclos de amplificación (Ct) de PCR y en el eje y los cambios en la fluorescencia (∆Rn).

45

7.1.2. Concentración de los primers.

La concentración óptima de los primers para GI y GII fue de 400 nM. En el análisis para

determinar la concentración óptima de primer (Figura 11), se observa que las lecturas de la

fluorescencia disminuyen a medida que disminuye la concentración de primer. Por

ejemplo, a una concentración de 50 nM, la amplificación fue baja y el Ct fue

indeterminado, así también cuando se utilizó una concentración de 100 nM no se alcanzó el

máximo de amplificación (plateau), y a una concentración de 200 nM el valor del Ct fue

alto (Ct = 28). Sin embargo a una concentración de 400 nM se observa que se alcanza el

máximo de la amplificación y un Ct menor (Ct = 24). Cuando se utilizó 800 nM también se

alcanzó el máximo de la amplificación y el Ct fue un ciclo más bajo (Ct = 23), en estos

términos la concentración es óptima, pero el uso de una concentración de 800 nM

representa un mayor gasto de primers y la posibilidad de la formación de dímeros de

primers en muestras con baja carga viral.

Figura 11. Determinación óptima de primer (GI), en el eje x se grafica los ciclos de

amplificación (Ct) del PCR en tiempo real y en el eje y los cambios en la fluorescencia

(∆Rn).

46

7.1.3. Efecto de la concentración de primer y dilución de una muestra sobre el Tm del

amplicon.

Para investigar si la concentración de primer para NoV GI y GII influyen en el Tm se

analizó las curvas de disociación (Figura 12 A) observándose que, cuando se utiliza la

concentración más baja de primer el Tm es indetectable, en el resto de las concentraciones

de primers analizados, los Tm tienen pocas variaciones, es decir ≤ 0.5ºC. Mientras que

cuando se analizó el efecto de la dilución de una muestra sobre el Tm (Figura 12 B), se

observan variaciones de 1.0 ºC con una tendencia hacia la derecha del Tm óptimo.

.

Figura 12. Curva de disociación del PCR en tiempo real. A) Determinación óptima de

primer (GI). B) Efecto de la dilución de la muestra (105-108) sobre el Tm (GII).

47

7.1.4. Temperatura óptima de hibridación de los primers.

La temperatura de hibridación experimental óptima determinada para este estudio fue de

55ºC tanto para los primers GI y GII. Utilizando una temperatura de hibridación de 50ºC se

observó que la amplificación del segmento específico disminuye ó la amplificación es nula

con mayor formación de dímeros de primers. Igual ocurrió a una temperatura de 60ºC. Una

observación interesante es que cuando se usan primers con cola, como los utilizados por

Nordgren et al., en el 2008 la temperatura óptima es de 60ºC.

7.1.5 Temperatura de disociación (Tm)

El análisis de las secuencias de los amplicones de distintas cepas de referencia de NoV GI y

GII, utilizando el programa de bioinformatica BioEdit, reveló que la temperatura de

disociación teórica de los amplicones es de 78.5 ± 0.6 °C y 78.6 ± 0.6 °C para GI y GII,

respectivamente (Figura 13). Sin embargo la temperatura de disociación óptima

experimental (Figura 14) determinada para los amplicones GI y GII fue de 76.1 ± 0.6 °C y

77.1 ± 0.6 °C, respectivamente, es decir que las temperaturas de disociación experimental

son menores (Tabla Nº 4).

48

Figura 13. Temperaturas de disociación teóricas de los amplicones de distintas cepas

de referencia de NoV GI (A) y NoV GII (B).

5579.9 5278.5

5379.0

4977.6 5278.5 5278.5 5278.5 5278.5 5278.5

%CG Tm

88-pb B)

53 79.2

51 78.2

51 78.2

50 77.8

53 79.2

%CG Tm

A) 87- pb

49

Figura 14. Determinación de la temperatura de disociación experimental óptima para

GI y GII.

Tabla Nº 4. Temperaturas de disociación experimental de NoV GI y GII.

Referencias GI Tm (ºC) Referencias GII Tm (ºC)

GI.11-771 75.2 GII.17-696 77.5

GI.4-826 76.2 GII.4-735 77.5

GI.4-394 76.6 GII.4-482 76.4

GI.2-741 76.5 GII.8NICA-166 78.0

GII.2-32 76.5

GII.4-432 76.8

x 76.1 x 77.1

Dímero de primer

50

7.2 Validación del ensayo de PCR en tiempo real SYBR Green.

7.2.1. Comparación del ensayo PCR en tiempo real y un PCR convencional.

El nuevo ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green fue comparado con un

PCR convencional utilizado tradicionalmente para el tamizaje de NoV [Zintz et al., 2005].

Se encontró una concordancia de 70% entre el PCR en tiempo real y el PCR convencional,

dicha concordancia es considerada como buena según la escala de valoración propuesta por

Landis y Koch [Landis and Koch, 1977].

El PCR convencional detecto un 28 % (17/60) de positividad en muestras clínicas, mientras

que el PCR en tiempo real detectó un 35 % (21/60) de positividad en el mismo material. Es

decir, el PCR en tiempo real detectó un 7 % (4/60) más de muestras positivas que el PCR

convencional. Otra ventaja del PCR en tiempo real sobre el PCR convencional fue la

capacidad de diferenciar entre muestras NoV positivas que contienen NoV GI ó GII (Tabla

N° 5).

7.2.2. Determinación de Ct en las muestras analizadas.

La media de los valores de Ct de las muestras positivas para GI y GII fue de 24.2 ± 5.6 y

26.2 ± 6.1, respectivamente (Figura 15 A y 16 A). En cambio, la media de los valores de Ct

para las muestras que fueron positivas por PCR en tiempo real y negativas por PCR

convencional fue de 30 ± 1.4. En este estudio el PCR convencional no logró detectar NoV

en muestras que contenían una carga viral baja (≤ 106) (Tabla Nº 5 muestras: 96, 242, 165 y

221).

51

Tabla N° 5. Detección y cuantificación de NoV GI y GII por PCR en tiempo real

SYBR Green en 60 muestras diarreicas.

Muestrasa

PCR en tiempo real basado en SYBR Green PCR

convencional b Genogrupo Ct Cuantificación

copias/gr. heces

208 GI 26 4 x 106 +++

190 GI 22 5.9 x 107 +++

96 GII 29 2 x 106 -

144 GII 25 2.1 x 107 +

152 GII 27 7 x 106 ++

163 GII 22 1.7 x 108 +++

166 GII 23 7.3 x 107 +++

167 GII 24 5.0 x 107 ++

171 GII 24 5.0 x 107 +++

186 GII 23 8.8 x 107 +++

195 GII 24 4.8 x 107 +++

199 GII 28 3 x 106 ++

215 GII 24 3. 7 x 107 +

220 GII 22 1.2 x 108 +

225 GII 25 1.6 x 107 ++

240 GII 25 2.4 x 107 +

242 GII 29 1 x 105 -

151 GII 25 2. 5 x 107 ++

155 GII 30 8 x 105 +

165 GII 30 9 x 105 -

221 GII 32 2 x 105 -

a. Muestras que fueron positivas por uno o ambos métodos utilizados en este estudio.

b. La intensidad de la banda de los productos del PCR convencional en gel de agarosa,

están indicados como alta (+++), media (++) y baja (+).

52

7.2.3. Análisis de la curva de disociación de las muestras analizadas.

La curva de disociación de los productos amplificados tanto para GI como para GII (Figura

15B y 16 B) muestra dos picos, el primer pico (lado izquierdo) corresponde a los dímeros

de primers y el segundo a los productos específicos. Una muestra fue considerada como

positiva para NoV cuando el Tm para GI fue de 76.1 ± 0.6 ºC y para GII de 77.1 ± 0.6 ºC.

Figura 15. A) Amplificación de las muestras positivas para GI. B) Curva de

disociación para muestras positivas para GI.

Figura 16. A) Amplificación de muestras positivas para GII B) Curva de disociación

para muestras positivas GII.

53

7.3. Evaluación de las propiedades del ensayo del PCR en tiempo real para la

detección y cuantificación de NoV GI y GII.

La curva estándar para NoV GI y GII se muestran en la Figura 17 A y B. El límite de

detección determinado para NoV fue de 100 e.g por reacción de PCR (~1.9 x 105 e.g/gr. h)

y un rango dinámico de 103 – 107 e.g por reacción para el ensayo con NoV GI y GII. El

coeficiente de correlación (R2) entre el número de amplicones y ∆Rn fue de 0.999 y 0.995

para GI y GII, respectivamente. La eficiencia de los ensayos para GI y GII fue del 93% con

una pendiente para ambos genogrupos de -3.5. La pendiente ideal es de -3.3, sin embargo

una pendiente entre -3.1 y -3.6 generalmente es aceptable. No se observaron reacciones

cruzadas con otros virus que infectan el intestino (Rotavirus, Sapovirus Porcino, Sapovirus

humanos, Astrovirus, Poliovirus y Adenovirus).

Figura 17. Curva estándar A) NoV GI y B) NoV GII.

R2 =0.995 Pendiente= -3.5 Eficiencia= 93%

R2 =0.999 Pendiente= -3.5 Eficiencia= 93%

B) A)

54

8. DISCUSIÓN En este estudio se ha establecido un ensayo de PCR en tiempo real basado en la

fluorescencia de SYBR Green para la detección y cuantificación de productos de PCR de

los genogrupos GI o GII de NoV en muestras clínicas. A su vez, este método utiliza valores

de Ct, datos de la curva de disociación y curva estándar, para la detección y cuantificación

de los genogrupos GI y GII de NoV. Este PCR en tiempo real ofrece la ventaja de ser un

método sencillo y rápido, y cuando se utiliza el sistema de detección de SYBR Green

permite hacer uso del análisis de la curva de disociación para verificar los productos

específicos y con ello se asegura no solo la especificidad, sino también poder distinguir

entre NoV GI y GII. Este sistema se optimizó para realizarse en reacciones separadas para

GI y GII, es decir el método no se probó para la detección simultánea en una misma

reacción con ambos genogrupos, no obstante las diferencias entre el Tm de GI y GII

podrían permitir el uso del método en un sistema de multiplex.

La optimización de los parámetros de un ensayo de PCR en tiempo real permite reducir la

formación de dímeros de primers y aumentar la eficiencia y especificidad de los procesos

de amplificación. Por ello, se determinaron los parámetros químicos y termodinámicos

óptimos para este ensayo. Uno de los parámetros químicos importantes es la concentración

de primer, en un estudio realizado por Richard et al., en el 2004 determinó una

concentración óptima de primer de 640 nM, sin embargo estuvo presente la producción de

dímeros de primers y de productos espurios debido a la alta concentración y degeneración

de los primers. En este estudio la concentración óptima de primer fue de 400 nM,

encontrando que la eficiencia de la amplificación era similar que cuando se utilizaba una

concentración más alta, sin embargo el gasto de primers era menor y la producción de

dímeros de primers y de productos espurios era menor.

Otro dato importante fue el valor de Ct, ya que el promedio de Ct de las muestras positivas

para GI y GII mediante el PCR en tiempo real fue 24.2 ± 5.6 y 26.2 ± 6.1 respectivamente,

mientras que el promedio de Ct de las muestras que fueron positivas solo por PCR en

tiempo real y negativas por PCR convencional fue mayor (Ct=30). Pang et al., en el 2004

reportó datos similares, con un promedio de Ct de 24.3 ± 4.4 para muestras positivas por

55

PCR en tiempo real y el promedio de Ct en las muestras negativas por PCR convencional y

positivas por PCR en tiempo real fue de 32. Con estos datos se puede sugerir que el PCR

convencional en ambos estudio no logra detectar NoV en muestras con una carga viral baja

(Ct ≥ 30). Sin embargo, en nuestro estudio una muestra con carga viral alta no fue detectada

por el PCR convencional (Tabla N° 5, muestra 96), lo que sugiere que nuestro PCR en

tiempo real no sólo detecta bajas concentraciones de virus, sino también otros tipos de

NoV, probablemente por la sensibilidad de los primers.

La principal dificultad en el desarrollo de un ensayo molecular para NoV es el diseño y

construcción de los primers debido a la alta diversidad genética del género Caliciviridae.

Las heterogeneidades existen aún en las regiones más conservadas del genoma viral, un

ejemplo de ello es la región dependiente de la ARN polimerasa (RdRp). Hasta ahora

existen cuatro estudios publicados de ensayos de PCR en tiempo real basados en SYBR

Green [Miller et al., 2002; Pang et al., 2004; Richards et al., 2004a; Richards et al., 2004b]

utilizando diferentes primers en su mayoría dirigidos a la región RdRp. Así, Miller et al., en

el 2002 comparó la microscopía electrónica y un PCR en tiempo real utilizando primers

dirigidos a la región RdRp y reportó que el PCR en tiempo real detectó mayor número de

muestras positivas. Otro estudio por Pang et al., en el 2004 evaluó varios set de primers

diseñados originalmente para PCR convencional, encontrando que los primers CapA/CapB

para GI dirigidos al gen de la cápside [Vinje et al., 2003] y los primers NVp110/SR46 para

GII dirigidos al gen de la región RdRp [Ando et al., 1995] cumplieron con los criterios de

sensibilidad y especificidad. Por otro lado, un tercer estudio realizado por Richards et al.,

en el 2004 utilizando primers dirigido a la región RdRp reveló que eran específicos

únicamente para la cepa 8FIIA prototipo de NoV GI [Matsui et al., 1991] pero no

amplificaban ningún otro NoV GI o GII. Por último, en otro estudio [Richards et al., 2004a]

utilizando un par de primers degenerados (primers MON) dirigidos a la región RdRp

encontró que dichos primers detectaban una gran variedad de NoV.

56

Kageyama et al., en el 2003 mediante análisis filogenéticos demostró que la homología

nucleótida entre secuencias del mismo genogrupo era entre un 86 - 100% en la región

ORF1-ORF2 del genoma, estos datos coinciden con otros estudios [Nordgren et al., 2008;

Zheng et al., 2006] que indican que la región RdRp es menos conservada que la región

ORF1-ORF2, por tanto dicha región es ideal para la selección de primers.

Basados en estos últimos hallazgos, en este estudio se utilizaron dos set de primers

degenerados dirigidos al sitio ORF1-ORF2 del genoma de NoV, un set de primers para

cada genogrupo (GI y GII) con el objetivo de maximizar la sensibilidad del ensayo. Se

escogió un sistema basado en SYBR Green relativamente menos específico pero más

sensible para maximizar la detección de GI y GII, y para compensar la baja especificidad

del mismo, se utilizó un criterio de valoración combinado de valores de Ct y curvas de

disociación tal como lo había sugerido un estudio previamente [Ririe et al., 1997]. Así

mismo Nordgren et al., en el 2008 al utilizar primers degenerados dirigidos a la región

ORF1-ORF2 para NoV (GI y GII) y un sistema de detección LUX reveló que la

sensibilidad incrementó al compararlo con un ensayo inmunológico y un PCR

convencional.

Una limitación al comparar un PCR en tiempo real y un PCR convencional en el

diagnóstico de NoV es la ausencia del gold estándar. En este estudio se obtuvo un 70% de

concordancia entre el ensayo de PCR en tiempo real y el ensayo de PCR convencional. Por

otro lado, 7% (4/60) de muestras positivas por PCR en tiempo real fueran negativas por

PCR convencional, una de las razones por las que el PCR convencional falló en la

detección de NoV puede deberse a que se utilizaron diferentes set de primers para evaluar

cada método. Sin embargo, Pang et al., en el 2004 al comparar un PCR en tiempo real

SYBR Green con un PCR convencional utilizó un mismo set de primers para ambos

métodos y reportó que el PCR en tiempo real incremento en un 19% el número de muestras

positivas en comparación con el PCR convencional.

57

Los inhibidores frecuentemente encontrados en muestras biológicas resultan en una

reducción significativa de la sensibilidad y cinética del PCR convencional, Richards et al.,

en el 2004 observó que algunas muestras analizadas por PCR convencional pueden resultar

negativas debido a los altos niveles de inhibidores en las mismas, a pesar que los títulos por

PCR en tiempo real sean bastantes altos. En nuestro estudio sugerimos que la principal

razón por que el PCR convencional detectó menos NoV, es por la baja concentración de

virus en las muestras como lo revela la cuantificación de algunas muestras en este estudio

(Tabla N° 5, muestras 96, 242, 165 y 221). Un estudio reciente por Nordgren et al., en el

2008 reporta observaciones similares y plantea que una de las razones por las que el PCR

convencional falla en la detección de NoV es la baja carga viral.

Nuestro ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green ha mostrado ser más

sensible que el método de PCR convencional. Los amplicones cortos del ensayo de PCR en

tiempo real probablemente resultan en una amplificación más eficiente y de mayor

sensibilidad, como lo reportó Nordgren et al., en el 2008 al utilizar primers degenerados

con amplicones cortos. Pang et al., en el 2004 determinó que el PCR en tiempo real fue

10,000 veces más sensible que el PCR convencional, utilizando una serie de diluciones a

partir una muestra positiva. Un hallazgo interesante es que al re-analizar las 4 muestras

positivas por nuestro PCR en tiempo real y negativas por PCR convencional, con el método

de PCR en tiempo real basado en sondas TaqMan [Kageyama et al., 2003] solamente 1 de

las 4 muestras fue positiva (no se muestran datos), lo cual puede sugiere que nuestro

método es más sensible que dicho método, para confirmar estos resultados es necesario

secuenciar los amplicones de SYBR Green.

Nuestro método puede ser utilizado para la cuantificación de carga viral en muestras

clínicas. El rango dinámico reportado en este estudio para GI y GII está entre 103-107 e.g

por reacción de PCR, con un límite de detección de 100 copias genómicas por reacción

(~1.9 x 105 copias/ gr. h) y una media geométrica de 1.5 x 107 e.g/gr. h tanto para GI como

para GII. Nordgren et al., en el 2008 utilizó estándares de plásmidos y reportó un rango

dinámico de 101-107 con un límite de detección de 10 copias genómicas (~20.000 e.g/gr. h)

para GI y 20 copias genómicas (~40,000 e.g/ gr. h) para GII.

58

Kageyama et al., en el 2003 reporta un límite de detección menor (~20,000 e.g/gr. h para

NoV GI y GII) que el reportado en este estudio. Aunque el método optimizado en este

estudio tiene un límite de detección más bajo que aquellos estudios que utilizan un sistema

TaqMan o LUX es un método muy útil para el tamizaje de muestras clínicas, entonces

cuando se requiera cuantificar NoV en muestras clínicas que contienen ≤ 1000 e.g lo ideal

sería utilizar un sistema TaqMan o LUX a pesar de su alto costo. En estudios recientes se

ha observado que los pacientes con infecciones sintomáticas y asintomáticas por NoV

excretan > 106 e.g/gr. h, es decir cantidades mayores que nuestro límite de detección

[Bucardo et al., 2010; Bucardo et al., 2008].

59

9. CONCLUSIONES

• Los parámetros químicos y termodinámicos óptimos del ensayo de PCR en tiempo

real SYBR Green para NoV GI y GII fueron: volumen de ADNc de 2.3 µl,

concentración de primer de 400 nM, temperatura de hibridación para los primers de

55°C, un Tm experimental para NoV GI de 76.1±0.6 y para GII de 77.1± 0.6.

• Al comparar el ensayo de PCR en tiempo real SYBR Green con un PCR

convencional utilizado para el tamizaje de NoV se obtuvo una concordancia del

70%, y nuestro método detectó NoV en un mayor número de muestras.

• El límite de detección alcanzado para NoV GI y GII fue de 100 e. g por reacción

(~1.9 x 105 e.g/gr h) y un rango dinámico de 103 – 107 e.g por reacción de PCR y

una buena correlación entre los valores de Ct y la concentración de plásmidos (log

10n) para GI (R2=0.999) y para GII (R2=0.995).

• La eficiencia del PCR en tiempo real SYBR Green fue de 93% (pendiente -3.5)

tanto para GI como para GII.

60

10. RECOMENDACIONES

• Ensayar un sistema de multiplex para la detección simultánea de NoV GI y GII

utilizando los mismo sets de primers que permitan evaluar la eficiencia del método

en la detección de NoV de forma simultánea en una sola reacción.

• En la optimización de los parámetros termodinámicos se recomienda incluir cepas

de referencia de otros genogrupos de NoV para obtener el Tm óptimo experimental

de los amplicones, debido a que Tm entre los diferentes genogrupos puede variar.

• Para confirmar las muestras que resultaron positivas utilizando nuestro ensayo de

PCR en tiempo real SYBR Green y PCR convencional se recomienda secuenciar los

productos del PCR en tiempo real SYBR Green.

• Cuando se requiera analizar muestras clínicas que contenga ≤ 1000 e.g se

recomienda utilizar un PCR en tiempo real utilizando un sistema TaqMan o LUX

debido a que en este estudio el límite de detección fue menor.

61

11. REFERENCIAS

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66

12. ANEXOS

Anexo #1

Extracción ARN (ROCHE cat. N°. 11 858 882 001)

1. Descongelar las muestras en hielo.

2. Diluir las muestras 1:10 con PBS 1X y centrifugar brevemente.

3. Mezclar 200 µl de la muestra diluida con 400 µl del Poli (A) en un vial de 1.5 ml

estéril e incubar a T° ambiente por 10 minutos.

4. Depositar la mezcla anterior en una columna contenida en un tubo colector.

Centrifugar a 8,000 x g por 15 segundos.

5. Descartar el tubo colector que contiene el filtrado y colocar la columna en un nuevo

tubo colector. Agregar 500 µl de Buffer de Inhibición. Centrifugar a 8,000 x g por 1

minuto.


tubo colector. Agregar 450 µl de solución de lavado y centrifugar a 8,000 x g por 1

minuto.


tubo colector. Agregar 450 µl de solución de lavado. Centrifugar a 8,000 x g por 1

minuto.

8. Descartar únicamente el filtrado y centrifugar a 13,000 x g por 10 segundos.

Descartar el tubo colector que contiene el filtrado.

9. Colocar una nueva columna en un vial estéril de 1.5 ml, agregar 50 µl de buffer de

elución y centrifugar a 8,000 x g por 1 minuto.

10. Descartar la columna y rotular el vial que contiene el ARN.

11. Guardar a -20°C hasta su uso.

67

Anexo # 2

PCR convencional

(Zintz et al., 2005)

1. Descongelar los productos de la transcripción reversa y colocar los viales sobre

hielo.

2. En el cuarto blanco colocar en un vial que contiene una PCR bead 1 µl de primers

p289hi/290hijk (Tabla N°1) y 21.5 µl de agua libre de nucleasas.

3. En el cuarto oscuro agregar a la mezcla anterior 2.5 µl de ADNc para completar un

volumen final de 25 µl.

4. Colocar los viales en el equipo GeneAmp® 2700 Applied Biosystems y correr el

siguiente programa: 94°C por 3 minutos, 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 49°C

por 1minuto y 20 segundos, 72°C por 1 minuto y una extensión a 72°C por 10

minutos.

5. Colocar en un gel de agarosa los productos amplificados y realizar la corrida

electroforética.

6. Visualizar mediante luz ultravioleta el gel de agarosa (2%) una banda de 319-pb

para NoV.

68

Anexo # 3

Screening de Norovirus GI mediante PCR en Tiempo Real usando FastStart

Universal SYBR Green Master (ROX)

1. Descongelar los reactivos y el ADNc viral en hielo.

2. Preparar el Master Mix.

Componente [Final] (nM)

Vol (μl)x Rxn

FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) 2X

1X 12.5

NV-GI-fwd1b (10 μM)

400 nM

1

NV-GI-rev (10 μM) 400 nM 1 Agua libre de nucleasas 8 ADNc 2.5 Total

25 μl

3. Agregar 22.5 μl del Master Mix en cada pozo de la placa a utilizar.

4. Agregue 2.5 μl de ADNc viral, estándar o agua en cada pozo, según se especifica a

continuación:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101

B NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101

C NTC U U U U U U U U U U U

D NTC U U U U U U U U U U U

E NTC U U U U U U U U U U U

F NTC U U U U U U U U U U U

G NTC U U U U U U U U U U U

H NTC U U U U U U U U U U U

NTC: Non Template Control, U: Desconocido, S: Standard

5. Mezclar y centrifugar a 4000 rpm por 3 min.

6. Sellar los pocillos.

69

7. Colocar la placa en el equipo para PCR en Tiempo Real (ABI 7500)

8. Correr el siguiente programa:

• Precalentamiento a 95°C por 5 minutos.

• 40 ciclos de 95°C a 15 segundos, 55°C a 30 segundos y 72°C por 1 minuto.

Especificaciones de los Primer:

Genogrupo I

Primers Secuencia (5’ – 3’)a Localización

NVG1f1b CGYTGGATGCGNTTCCATGA 5391-5310

NVG1rlux GTCCTTAGACGCCATCATC 5397-5379 a. Código de ambigüedad: Y, Pirimidina (C/T); R, Purina (A/G); N, A, G, C o T.

70

Screening de Norovirus GII mediante PCR en Tiempo Real usando FastStart

Universal SYBR Green Master (ROX)

1. Descongelar los reactivos y el ADNc viral en hielo.

2. Preparar el Master Mix.

Componente [Final]

(nM)

Vol (μl)x

Rxn

FastStart Universal SYBR

Green Master (ROX) 2X

1X 12.5

NVG2flux1 (10 μM)

400 nM

1

COG2R (20 μM) 400 nM 1

Agua libre de nucleasas 8

ADNc 2.5

Total 25 μl

3. Agregar 22.5 μl del Master Mix en cada pozo de la placa a utilizar.

4. Agregue 2.5 μl de ADNc viral, estándar o agua en cada pozo, según se especifica a

continuación:

A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

B NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101

C NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101

D NTC U U U U U U U U U U U

E NTC U U U U U U U U U U U

F NTC U U U U U U U U U U U

G NTC U U U U U U U U U U U

H NTC U U U U U U U U U U U

NTC: Non Template Control, U: Desconocido, S: Standard

5. Mezclar y centrifugar a 4000 rpm por 3 min.

71

6. Sellar los pocillos.

7. Colocar la placa en el equipo para PCR en Tiempo Real (ABI 7500)

8. Correr el siguiente programa:

• Precalentamiento a 95°C por 5 minutos.

• 40 ciclos de 95°C a 15 segundos, 55°C a 30 segundos y 72°C por 1 minuto.

Especificaciones de los Primer:

Genogrupo II

Primers Secuencia (5’ – 3’)a Localización

NVG2flux1 ATGTTYAGRTGGATGAGRTTYTC 5012-5034

COG2R TCGACGCCATCTTCATTCACA 5100-5080

a. Código de ambigüedad: Y, Pirimidina (C/T); R, Purina (A/G); N, A, G, C o T.

PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección ...

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