Proteasas ParasitariasProteasas Parasitarias

ProteasasDefinición

• Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptídicos (subclase E.C 3.4)

• Proteólisis limitada: limitado número de enlaces hidrolizables

• Proteólisis ilimitada: proteasoma, lisosomas

Enlace PeptídicoEnlace PeptídicoCaracterísticasCaracterísticas

Plano

Rígido

Polar

Restringe conformación de la cadena polipeptídica

El Problema Químico

ProteasasNomenclatura

ProteasasNomenclatura de Schercher y Berger

ProteasasProteasasClasificación según mecanismo Clasificación según mecanismo

de acciónde acción

• Serina proteasas

• Cisteína proteasas

• Metaloproteasas

• Aspártico proteasas

• Treonina proteasas

• Glutámico proteasas

ProteasasProteasasClasificaciónClasificación

• Familia: homología significativa a nivel de secuencia de amino ácidos en la porción catalítica.

• Clan: Grupos de familias que han evolucionado a partir de una proteína ancestral. Similitud a nivel de estructura tridimensional

Proteasas en los Genomas Eucariotas

Serina proteasasGeneralidades

• Familia de Qumiotripsina: Tripsina, elastasa, factores de la coagulación XIIa, XIa, IXa, plasmina

• Familia Subtilisina, enzimas bacterianas

• Tríada catalítica

Serina ProteasasMecanismo de Acción Catalítica

Tríada Catalítica: His57, Asp102 y Ser195

-Formación de acil intermediario entre el substrato y la Ser

Formación de este intermediario covalente se produce a través de un intermediario tetrahédrico de transición cargado negativamente

Se cliva el enlace peptítico

Serina ProteasasMecanismo de Acción Catalítica (cont.)

Fase de deacilación

El intermediario acil-enzima se hidroliza por una molécula de agua liberado el péptido y restaurando el hidroxilo en Ser

La His provee una base y acepta el OH de la Ser reactiva

Cisteína ProteasasGeneralidades

Papaína, catepsinas lisosomales B, H y L

Calpaínas citosólicas• Díada catalítica:

Cis25, His159 juegan los mismos roles que Ser e His en serina proteasas

Cisteína ProteasasMecanismo de Acción Catalítica

La catálisis también se produce a través de la formación de un intermediario covalente e involucra a Cys e His

El nucleófilo es en este caso un ion tiolato en lugar de un grupo hidroxilo

El tiolatio se estabiliza por la formación de un par iónico con el imidazol vecino en la His

El ataque nuclefílico es en este caso el par iónico tiolato-imidazol en ambos pasos, por tanto no se requiere una molécula de H2O2

MetaloproteasasGeneralidades

• Amplias differencias en secuencias y estructura

• La gran mayoría contienen Zn en sitio activo

• Ej: Termolisina, metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs), algunas aminopeptidasas Sito activo de la termolisina

mostrando Zn, HIS142, HIS146 and GLU166.

MetaloproteasasMecanismo de Acción

El mecanismo catalítico lleva a la formación de un intermediario tetrahédrico no covalente luego del ataque de la molécula de H2O unida al Zn sobre el grupo carbonilo del enlace peptídico.

El intermediario se descompone por la transferencia del protón del ácido glutámico al grupo NH

Aspártico ProteasasGeneralidades

• Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina• Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son

monoméricas, por lo que la dimerización se requiere para formar la enzima activa

• Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo está entre dos lóbulos homólogos. Cada lóbulo contribuye con un aspartato

• El pH óptimo es ácido para la mayoría de las aspártico proteasas, donde un protón está compartido por los dos aspartatos del sitio activo

• El agua es activada por los aspartatos para realizar el ataque nucleofílico

Aspártico ProteasasMecanismo de Acción

Los 2 residuos aspartil tienen una gran proximidad geométrica en la molécula

Un aspartato se ioniza mientras que el segundo no lo está al rango de pH óptimo de 2-3

La catálisis de las aspártico proteasas no involucra la gneración de un intermediario covalente si bien existe un intermediario tetrahédrico.

El ataque nucleofílico se consigue por 2 transferencias simultáneas de protones: una desde el H2O2 a la díada de dos carboxilos y otra desde la diáda al oxígeno carbonilo del substrato con el consiguiente clivaje CO-NH

En términos generales es una catálisis ácido-base.

Inhibidores de ProteasasBajo Peso Molecular

• Cisteína: E-64, Leupeptin

• Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP), PMSF, Benzamidina, Dicloroisocumarina

• Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina, Bestatina

• Aspártico: Pepstatina

Inhibidores de ProteasasInhibidores Naturales

• Mas de 100 compuestos naturales identificados

• Desde bacterias a animales y plantas• Reversibles o seudo-irreversibles• Impiden acceso al sitio activo• Proteicos, de 50 a 400 aa• Clase específicos excepto familia de α-

Macroglobulina• Inhibidores de Serina y Cisteína proteasas

son los mejor caracterizados. Ej. α-1 antitripsina y cistatinas

Metodología de EstudioSubstratos Cromogénicos

Estos substratos, al clivarse generan un compuesto cromogénico. La tasa de hidrólisis se mide en Los más utilizados son péptidos 4-nitroanilides pNA) y péptidos thioesteres

Metodología de EstudioMetodología de EstudioSustratos FluorgénicosSustratos Fluorgénicos

Generan un compuesto fluorogénico al producirse el clivaje.

La tasa de hidrólisis se cuantifica por medio de un espectrofluorómetro o fluorómetro en forma continua o ensayos puntuales.

Los sustratos más usados son los que tienen acoplado AMC (peptidyl 4-metil-7 cumarilamidas).

Metodología de EstudioSustratos con Quenching intramolecular

En estos substratos, la secuencia peptídica separa un grupo fluorescente dador de un grupo aceptor que actúa como mitigador (quencher) de fluorescencia. El fenómeno se llama transferencia de energía resonante. El clivaje del enlace peptídico lleva a separación del par dador-aceptor produciendo un incremento de la fluorescencia. Existen varios pares de dador-aceptor reportadoss, por ej. o-aminobenzoic acid (Abz) como dador y 2, 4 dinitrophenyl (Dnp) como aceptor.

Substratos sintéticosEjemplos

• Cathepsin B Bz-Arg-pNAPyr-Phe-Leu-pNAZ-Arg-Arg-pNAZ-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCAZ-Phe-Arg-MCA

• Cathepsin G MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNASuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNASuc-Ala-Val-Pro-Phe-pNASuc-Phe-Leu-Phe-pNA –

• Cathepsin H H-Arg-pNABz-Arg-pNA H-Arg-MCA

• Cathepsin L Z-Phe-Arg-pNA» Z-Phe-Arg-AMC

Geles de gelatina-SDS-PAGEGeles de gelatina-SDS-PAGE

CL1

27,5 kDa

CL1 gelatinolytic activity

CL229 kDa

CL2 gelatinolytic activity

SDS-PAGE acoplado a Substratos Fluorogénicos

Acciones de las Proteasas Acciones de las Proteasas Parasitarias en el Contexto Parasitarias en el Contexto

del Parasitismodel Parasitismo

• Invasión

• Migración

• Nutrición

• Evasión de la respuesta inmune

• Inmunomodulación

Invasión y MigraciónMembranas Basales y Matríz

Extracelular

Nutrición

• Hemoblobina

• Proteínas del suero

• Proteínas intracelulares

• Proteínas extracelulares (MEC)

Evasión de la Respuesta Inmune

• Degradación de Igs (IgG, IgM, IgE, IgA)

• Degradación de componentes del Complemento

• Clivaje de moléculas de superificie de células del sistema inmune (Ej. CD4)

Inmunomodulación

La cisteína proteasa CPB2.8 de Leishmania mexicana induce una fuerte respuesta de tipo Th2 asociada a la progresión de la enfermedad

Enfermedad de Chagas

• Causada por el flagelado Trypanosoma cruzi

• Parásito heteroxeno• 3 formas: Forma

replicativa intracelular obligatoria amastigote, forma tripomastigote circulante y forma epimastigota replicativa en el insecto vector

Proteasas de Trypanosoma cruzi

Cisteína proteasas

– Cruzipaína (cruzaína, GP57/51)

– Catepsina B-like proteinasas

– CAAX Prenyl proteasa

Proteasas de Trypanosoma cruzi

Serina proteasas

– Oligopeptidasa B

– Prolil Endopeptidasa Tc80 (colagenasa)

– Serina carboxipeptidasa

Proteasas de Trypanosoma cruzi

Metaloproteasas

– Genes pertenecientes a la familia gp63 de Leishmania, una metaloproteasa asociada a membrana celular han sido descritos en T. cruzi.

CruzipaínaCruzipaínaResponsable de la actividad cisteína proteasa más promienente de T. Cruzi

Se expresa en todos los estadíos parasitarios

La mayoría tiene localización lisosomal, pero hay isoformas asociadas a membrana plasmática y habría alguna secretada

Endoproteasa, digiere proteínas como caseína, SAP, hemoglobina y sustratos sintéticos a pH 7-9.

Prefiere Arg o Lys en P1 y un hidrofóbico o con carga + en P2 (Leu>Tyr>Phe>Val)

Cruzipaína

Especificidad intermediaria entre Catepsinas L y B en función de AA en P2

Inhibida por organomercuriales, E-64, leupeptin, TLCK, cistatina, stefina, chagasina y derivados peptidil fluorometanos

Peptidos con secuencia YHNGAA del pro-dominio también la inhiben

E-64

Z-Phe-Ala-fluorometilketona

CruzipaínaCorte de subclases de IgG

CruzipaínaCruzipaínaCorte de subclases de IgGCorte de subclases de IgG

CruzipaínaCorte de subclases de IgG

Malaria

• Causada por protozoarios apicomplexa del género Plasmodium

• 300 millones de infectados, más de un millón de muertes anuales

• Ciclo complejo, transmitidos por vector invertebrado (mosquito Anopheles)

Proteasas de Plasmodiumen la Digestión de la

HemoglobinaSe desarrolla en la vacuola alimenticia

Consume el 75% de la Hb

Se producen pequeños péptidos pero no AA por lo que existirían transportadores

Las Plasmepsinas I - IV son aspártico proteasas implicadas en la primera fase de la digestión

Las Falcipaínas I y II son cisteína proteasas que degradan los polipéptidos grandes generados

La Falcilysina, una metaloproteasa de la familia M16, degrada los pequeños péptidos

Una aminopeptidasa citosólica completaría el proceso produciendo AA libres

PlasmepsinasPlasmepsinasNutriciónNutrición

• Degradación inicial de Hb nativa (plasmepsina I)

• Clivan enlace Leu203-His204 en región bisagra de cadena α

PlasmepsinasInvasión

•Clivaje de espectrinas (CH3) del esqueleto de la membrana plasmática del GR

Amebiasis

• Infección intestinal o extraintestinal causada por Entamoeba histolytica

• 50 millones de infectados y 110 mil muertes anuales

• 2 especies reconocidas• Entamoeba histolytica –

patógena• Entamoeba dispar –

comensal (10% población mundial)

Cisteina Proteasas de Entamoeba histolytica y E. dispar

Proteasas en la Patogenia de la Amebiasis

Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de

CP• Peptidil diazometanos

basados en la secuencias LVG de las cistatinas

, , epoxi ketonas - > potencia que E-64c

• Bis-arylacylhydrazidas y aril ureas-reversibles

• Mercaptoetilketonas, algunas con Ki de 1nM

Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de

CP• La actividad de los inhibidores de CP contra T. Cruzi en cultivos

o modelos animales correlaciona con la inhibición directa de la CP.

• No se pueden descartar otras acciones.

• En su mayoría los inhibidores también actúan sobre las catepsinas de mamíferos.

• Las células no se ven afectadas por las concentraciones que matan los parásitos. Redundancia?.

• Los parásitos resistentes a los inhibidores de CP no se mostraron resistente a drogas establecidas como nifurtimox indicando mecanismos diferentes