ProteasasBioquímica de Proteínas

2017

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Reacción no catalizada

• La reacción no catalizada consiste en un ataque nucleofílico por el

átomo de O del H2O sobre el carbono carbonílico del enlace peptídico

formando un intermediario tetraédrico.

• El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico hace que el

carbono carbonílico sea mucho menos reactivo que los carbonos

carbonílicos en los ésteres.

• La tarea catalítica de las proteasas consiste en transformar al carbono

carbonílico, normalmente no reactivo, en mucho más susceptible al

ataque nucleofílico por el agua.

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FUNCIONES DE LAS PROTEINASAS.

1) Función digestiva.

a) Extracelular.

b) Intracelular.

2) Turnover proteico.

3) Procesamiento post-traduccional de proteínas.

a) Proteasas del péptido señal.

b) Proteasas de procesamiento de pro-Hormonas

y otras proteínas.

c) Dominio pro- en muchas proteinasas.

4) Invasión de tejidos (parásitos, metástasis tumorales).

Proteasas: Endo y exo

•Las endopeptidasas hidrolizan unionespeptídicas internas en una cadenapolipeptídica, tendiendo a actuar lejos del N-terminal o del C-terminal.

•Las exopeptidasas requieren un aminoterminal, un carboxilo terminal, o ambos, libres,e hidrolizan una unión peptídica a no mas detres residuos desde el N terminal o del Cterminal. Según el extremo que cortan, seránaminopeptidasas o carboxipeptidasas.

Clasificación de Proteasas

• Por la reacción catalizada: son pocos los casos enque se conoce exactamente la reacción catalizada,en términos de qué unión es hidrolizada en elsubstrato. Se aplica sobre todo a exopeptidasas.

• Por el mecanismo catalítico: es la más usada,desde su propuesta por Brian Hartley hace más de50 años. Se basa en cuáles son los grupos queintervienen en la catálisis y en cómo actúan.

• Por su secuencia y estructura: es la clasificaciónmás moderna, propuesta por Alan Barrett, ycomplementa a la anterior.

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Exopeptidasas: clasificación por el tipo

de reacción catalizada• Aminopeptidase: liberates a single aa residue from

the unblocked N-t of its substrate

• Dipeptidyl-peptidase: hydrolyses an N-t dipeptide

from its substrate

• Tripeptidyl-peptidase: hydrolyses a tripeptide from

the N-t of its substrate

• Carboxypeptidase: hydrolyses a single residue from

the unblocked C-t of its substrate

• Peptidyl-dipeptidase: hydrolyses a dipeptide from the

C-t of its substrate

• Dipeptidase: hydrolyses a dipeptide, and typically

requires that both termini be free

• Omega-peptidases: have no requirement for a free N-t

or C-t in the substrate. They often act close to one

terminus or the other. Some hydrolyse peptide bonds

that are not alpha-bonds. Examples: ub hydrolases,

pyroglutamyl peptidases and gamma-glutamyl

hydrolase 6

Exopeptidasas: clasificación por el tipo

de reacción catalizada

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Endopeptidasas: clasificación por el tipo

de reacción catalizada

• Pueden ser denominadas en base a la preferencia

por un determinado residuo en P1 o en P1´ (por

ejemplo, glicil-endopeptidasa; peptidil-lisil

endopeptidasa). Si hay varias enzimas con igual

especificidad, hay que distinguirlas (glutamil

endopeptidasas I y II).

• En la gran mayoría de los casos, la especificidad es

demasiado compleja, y se usan nombres triviales

(pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína,

termolisina)

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Proteasas: Clases mecanísticas

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Aspartil proteasas

Cisteín proteasasSerín Proteasas

Metaloproteasas

Treonin proteasas

Asn proteasas

Asp/Asn

Glu proteasas

Glu/Gln

Proteasas: Clasificación por

relación evolutiva• Propuesta en 1993 por Alan J. Barrett y N.D. Rawlings (Cambridge, UK).

Comparación de secuencias proteicas y clasificación en:

• Familias, cuyos miembros derivarían de una misma proteína ancestralpor evolución divergente. Tienen homología estadísticamentesignificativa, al menos en el dominio catalítico (es decir, en el que tieneactividad de proteasa).

• Clanes, grupos de familias con una proteína ancestral común. Lahomología de secuencia entre ellas es mucho más baja, pero seconservan el orden lineal de los residuos del sitio activo y lospequeños grupos de residuos que los rodean; además, tienen unaestructura terciaria similar.

• La información, que se mantiene actualizada, está contenida en la basede datos MEROPS (merops.sanger.ac.uk). Se complementa con lanomenclatura de enzimas de la IUBMB (peptidasas, EC 3.4; lacruzipaína es EC 3.4.22.51 y C01.075 en MEROPS).

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Al 4/5/2017: 5 clanes A, 10 C, 2 G, 15 M, 5 N, 5 P y 12 S. 16 familias A, 71 C,

2 G, 72 M, 7 N, 44 P (incluyen 4 familias T), 36 S y desconocidas 10.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.

1.SUSTRATOS PROTEICOS.

1) Proteínas naturales como sustratos generales (hemoglobina, caseína)

a) Precipitación de proteína no digerida y determinación de A280 nm

en el sobrenadante.

b) Precipitación y reacción de Folin en el sobrenadante.

2) Derivados cromogénicos de proteínas naturales (azocaseína, azoalbúmina)

Precipitación y lectura de la A440 nm de los azopéptidos.

3) Derivados fluorogénicos de proteínas naturales: Caseína ligada a isotiocianato

de fluoresceína (FITC-caseína). Excitación a 490 nm y emisión a 525 nm.

4) Proteínas específicas.

a)Colágenos para colagenasas.

b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción in vitro de

su mRNA), para las proteinasas del péptido señal.

5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos (125I en Tyr).

Precipitación y determinación de radioactividad en el sobrenadante.

6) Separación de fragmentos grandes después de proteólisis limitada.

a) HPLC en fase reversa.

b) SDS-PAGE.

c) Filtración por gel.

7) Determinaciónes en fase sólida (proteinasa, o sustrato, o ambos,

inmovilizados).

a) Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Actividad determinada in situ después de la electroforesis.

- Métodos histoquímicos: b-naftilamidas y Fast Garnet.

- Proteína copolimerizada: Gelatina, fibrinógeno. Gel lavado para

eliminar el SDS, incubado al pH adecuado, teñido con Coomassie Blue.

Actividad detectada como zonas incoloras sobre fondo azul.

b) Ensayos de ELISA

Determinación de colagenasa. Ab anti-colágeno, revelado con Ab

contra la IgG usada conteniendo un cromóforo adecuado.

2. SUSTRATOS SINTETICOS:

Péptidos cromogénicos o fluorogénicos.

a) Sustratos de endopeptidasas (sin amino ni

carboxilo libres). Bz-L-Arg-NHNan, 400 nm.

b) Sustratos de aminopeptidasas (sólo el carboxilo

bloqueado). L-Arg-NHNan, 400 nm.

c) Sustratos de carboxipeptidasas (sólo el amino

bloqueado). {N-(3-[2-furyl]acryloyl)}-Ala-Lys (FA-Ala-

Lys), 340 nm.

Grupos bloqueantes del amino:

Benzoil (Bz); Benzoiloxicarbonil (Z); O-Aminobenzoil

(Abz); Acetil (Ac); Succinil (Suc); Furil-acrilol (FA).

Ensayos espectrofotométricos:

a) 4-nitroanilidas (NH-Nan):

Derivados N-acilados de la 4-nitroanilina. La A400 nm difiere en

aprox.10.000 M-1cm-1 entre las 4-nitroanilidas y la 4-nitroanilina

a pH 8.0.

Utilizables en determinaciones espectrofotométricas continuas.

b) 2-naftilamidas (NH-Nap):

La 2-naftilamina tiene su máximo de absorción a 340 nm, y difiere

de las 2-naftilamidas en aprox. 1.700 M-1cm-1. Esto depende del

pH: por debajo de 5.5 no hay diferencia.

Se puede aumentar la sensibilidad por diazotación de la naftilamina

libre con N(1-naftil) etilendiamina diclorhidrato, o por reacción con

una sal de diazonio estable, el Fast Garnet, que da un producto

insoluble (requiere un detergente para mantenerse en solución).

c) Amidas y ésteres:

La hidrólisis de amidas puede seguirse a 230 nm, o siguiendo

la liberación de aminoácidos con ninhidrina. Baja sensibilidad.

Ensayos fluorimétricos:

a) 2-naftilamidas:

3 ordenes de magnitud más sensible que la diazotación.

Sensible al pH. Excitación a 335 nm y emisión de 410 nm.

b) 7-amino-4-metil cumarilamidas (NH-Mec):

Fluoróforo libre, 500 a 700 veces más fluorescente que el

conjugado. Excitación a 380 nm, emisión a 460 nm.

c) Sustratos fluorogénicos “apagados“ intramolecularmente

(“quenching”):

Abz-gly-Phe(NO2)-Pro (sustrato de ACE). La proteólisis

libera Abz-Gly, fluorescente. Excitación a 310 nm, emisión a

410 nm.

Nomenclatura de Schechter y Berger (1967)

ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO

Determinación de la especificidad de sustrato

La tríada catalítica

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Serín Proteasas

Estructura de la quimotripsina (D. Blow, 1967)

Mecanismo de reacción

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Uniones que intervienen en la estabilización del intermediario

tetraédrico.

Especificidad de sustrato: el subsitio S1

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Subtilisina:

una proteasa bacteriana• No apparent evolutionary relationship

to mammalian chymotrypsin/trypsin

family (no primary structure or tertiary

structural resemblance)

• Same catalytic mechanism as

mammalian serine proteases: a

catalytic Ser assisted by a His and an

Asp residue (catalytic triad), in same

orientation, and an oxyanion hole to

stabilize oxyanion intermediates

(transition states)

• Example of convergent evolution:

independent evolution of same

catalytic strategy

• Chymotrypsin mechanism must be a

very effective hydrolytic mechanism!)

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Activación del tripsinógeno

• A variety of digestive proteases are synthesized in the pancreas as inactive

proenzymes, so that they don’t start to attack the cells that make them. Digestive

proenzymes are stored in the pancreatic cells as secretory granules, and empty

into the duodenum via the pancreatic duct.

• Trypsinogen is activated by proteolytic cleavage (hydrolysis) of the peptide bond

between Lys 6 and Ile 7. The oligopeptide with the first 6 amino acids is lost and Ile

7 becomes the new N-terminal. The positive charge associated with the N-terminal

is now in a new position -> correct organization of the catalytic site

• The reaction that activates trypsinogen is induced by the protease

enteropeptidase, which is a membrane protein exposed on the external surface of

the mucosal cells that line the duodenum. Enteropeptidase is specific for the

sequence Lys-Ile found in trypsinogen. The quantity of enteropeptidase present is

very small, and may only activate a small fraction of the total trypsinogen.

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La tripsina es el activador común de las

proenzimas pancreáticas

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R I

IK

Inhibidores de emergencia

• Trauma to the internal organs that damages the pancreas can cause pancreatitis,

an unpleasant and painful condition in which traces of trypsin leak out and attack

cells, activating their stored zymogen granules. The result is an escalating

tendency of the pancreas to digest itself and surrounding organs.

• To prevent premature activation of trypsinogen, pancreas also produces small

amounts of secretory pancreatic trypsin inhibitor. This is a small protein that

exposes a substrate-like loop that is attacked by trypsin. However,the inhibitor is

designed to bind trypsin extremely tightly(Ki=10–13 M),so the reaction product is

not released easily and continues to occupy the catalytic site. There is enough

inhibitor to control any traces of trypsin that might develop accidentally, and

prevent it from triggering the activation of the remaining trypsinogen while still in

the pancreas. Once the trypsinogen is secreted into the duodenum,

enteropeptidase can make enough trypsin to overcome the trace of inhibitor, and

self activation can proceed.

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SERPINAS

• SERPINS: Serine proteinase inhibitors.

• Representan la familia de inhibidores más grande y funcionalmentemás diversa (aprox. 1500 secuencias de serpinas se han identificadoen los 5 reinos, 36 genes en humanos, 60 en ratones).

• Proteínas en general monoméricas, MW 40-100 kDa. Incluyenproteínas como: α1-antitripsina, α1-antiquimotripsina, antitrombinaIII, cofactor II de la heparina, inhibidor de C1, α2-antiplasmina,inhibidores I y II del activador del plasminógeno, inhibidor de laproteína C, y proteasa nexina-1.

• Tienen una estructura secundaria conservada con un loop reactivo(RCL) que interacciona con el sitio activo de la proteasa inhibiéndola.

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• En muchos casos se forma un complejo tetraédrico con el

inhibidor, que es clivado por la proteinasa y se forman

complejos covalentes. Las serpinas clivadas tienen

estructuras conformacionalmente mas estables que las

nativas. El clivaje induce un cambio conformacional mayor, y

los dos residuos que formaban la unión reactiva quedan en

sitios opuestos de la molécula. 34

Serpinas asociadas con enfermedades

en humanos

• La Alfa 1-antitripsina protege a los tejidos de las

proteasas presentes principalmente en las células

inflamatorias, en especial la elastasa. La deficiencia

de alfa-1 antitripsina (trastorno hereditario) lleva a

una degradación tisular durante la inflamación. Esto

causa enfisema pulmonar y lleva a la cirrosis

hepática en casos severos.

• La deficiencia de antitrombina es una enfermedad

genética rara que generalmente sale a la luz cuando

el paciente sufre trombosis venosas recurrentes y

embolismo pulmonar

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Ovomucoide:

Inhibidor tipo

Kazal

Inhibidores de serín peptidasas

• Diisopropyl fluorophosphate (DIPF).

• Mimic tetrahedral intermediate/transition

state.

It combines with the amino acid serine at

the active site of the enzyme

acetylcholinesterase, an enzyme that

deactivates the neurotransmitter

acetylcholine. If the enzyme is inhibited,

acetylcholine accumulates and nerve

impulses cannot be stopped, causing

prolonged muscle contraction. Paralysis

occurs and death may result since the

respiratory muscles are affected.

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Fenil-metil-sulfonil fluoruro