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Rev. peru. biol. 11(2): 179-186 (2004)© Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Presentado: 14/07/2004Aceptado: 12/08/2004

Proteasas extracelulares producidas por bacterias marinas aisladas deaguas contaminadas con efluentes pesqueros

Extracellular proteases produced by marine bacteria isolated from sea watercontaminated with fishing effluents

Tito Sánchez1,3, Jorge León1, Juan Woolcott2, Katherine Arauco3

1 Laboratorio de Microbiología Ambiental yBiotecnología. Facultad de Ciencias Biológicas,Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Email: Jorge Leon jleonq@unmsm.edu.pe2 Laboratorio de Bioorgánica, Facultad de Química eIngeniería Química, Universidad Nacional Mayor deSan Marcos.3 Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Farmacia yBioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

ResumenUn total de 26 cepas de bacterias marinas con actividad proteolítica fueron aisladas de agua de

mar contaminadas con efluentes pesqueros; las mismas que se evaluaron en base al crecimiento yformación de halos de actividad en Agar Marino suplementados con caseína al 1%, pH 8,0 e incuba-dos a 25 ºC por 72 h. Cinco cepas, seleccionadas por presentar los mejores halos de actividad fueronevaluadas a su vez por su crecimiento y producción de proteasas a diferentes concentraciones deNaCl, rangos de temperatura y pH; siendo consideradas finalmente como bacterias halotolerantes,psicrotróficas y alcalófilas moderadas. Estas cepas también fueron evaluadas por su actividadproteolítica específica sobre la caseína, siendo la cepa CM48 (Pseudomonas sp.) la que presentó lamejor actividad específica (17,38 U/mg) a las 72 horas, y seguidas por las cepas CM45 (Alcaligenessp.) (12,09 U/mg) y tres cepas de Aeromonas sp. (CM43, CM44 y CM46) con valores de 12,02; 10,07y 10,10 U/mg respectivamente.

Palabras clave: Bacterias marinas, psicrotróficas, enzimas extracelulares, proteasas.

AbstractA total of 26 strains of marine bacteria with proteolytic activity was isolated from sea water contaminated

with fishing effluents; they were evaluated in basis of their growth and formation of activity halos inMarine Agar supplemented with casein to 1%, pH 8,0 and incubated to 25 ºC per 72 hours. Selectedfive strains were evaluated on the basis of displaying the best halos of activity as well by their growthand production of proteases at different concentrations of NaCl, temperature ranges and pH; beingfinally considered as moderate halotolerants bacteria, psicrotrophics and alkalophile. These strainsalso were evaluated by their specific proteolytic activity on the casein, being strain CM48 (Pseudomonassp.) the one that presented the best specific activity (17,38 U/mg) at 72 hours, and followed by strainCM45 (Alcaligenes sp.) (12,09 U/mg) and three strains of Aeromonas sp. (CM43, CM44 and CM46)with values of 12,02; 10,07 and 10,10 U/mg respectively.

Keywords: Marine bacteria, psicrotrophics, extracellular enzymes, proteases.

Introducción

Las bacterias marinas son por su naturale-za psicrotróficas y halotolerantes; poseen pro-cesos metabólicos adaptados a bajas tempe-raturas y realizan sus actividades en altas con-

centraciones de sales, elevadas presioneshidrostáticas, pH alcalinos e incluso condicio-nes anóxicas. Bajo estas condiciones mode-radamente «extremas» pueden producir unaserie de metabolitos, entre ellas las enzimasextracelulares (Féller et al., 1996). Entre lasenzimas extracelulares producidas por bacte-rias marinas se incluyen amilasas,glucamilasas, glucosaisomerasas, pectinasas(Stanley & Stanley, 1986) y otras comoagarasas, quitinasas, alginasas, lipasas,DNasas, esterasas y proteasas (Fenical &Jensen, 1993; León et al., 2000). En la actua-lidad, las bacterias productoras de proteasashan adquirido especial relevancia, ya que pue-

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den ser utilizadas en procesos productivoscomo la industria de los detergentes, alimen-tos y bebidas, así como la clarificación de cer-veza fría y otras bebidas, ablandamiento decarnes rojas, industria del cuero, entre otras(Schmidt, 1981).

Asimismo, la tecnología enzimáticamicrobiana ocupa un papel importante dentrode la biotecnología, específicamente en el sec-tor alimentario, farmacéutico y salud. Alrede-dor del 65% de las enzimas que se producenindustrialmente están de una u otra manerarelacionadas con la industria alimentaria. Sólolas proteasas alcalinas empleadas en la indus-tria de detergentes ocupan el 25% del total,las restantes corresponden a aplicaciones enlas áreas farmacéuticas, industrial y analítica(Bárzana & López-Murguía, 1995).

Una de las alternativas viables para mejo-rar la eficiencia, reducir los costos y aumen-tar la disponibilidad de algunas enzimas de in-terés industrial, es el de buscar y seleccionarmicroorganismos con altas capacidades de pro-ducción a partir de ambientes marinos. Asimis-mo, es de suma importancia evaluar sus condi-ciones óptimas de crecimiento, producción, acti-vidades enzimáticas y caracterización fenotípica.

El presente estudio tuvo como finalidad ais-lar y seleccionar bacterias con capacidad deproducir proteasas extracelulares de interés oaplicación biotecnológica procedentes de zo-nas marinas contaminadas con efluentespesqueros.

Materiales y métodosMuestras de efluentes

Las bacterias fueron aisladas de efluentespesqueros emitidos por la fábrica del consor-cio APROPISCO en Playa Lobería – Paracas,las fábricas pesqueras de Chancay (200 m alnorte del muelle de Chancay) y efluentes delTerminal Pesquero de Ventanilla (Callao).

Recolección de muestras

Un total de 30 muestras de agua de marcontaminadas por efluentes pesqueros se co-

lectaron en frascos estériles de 250 mL decapacidad a una distancia entre 5 a 50 metrosde la orilla. Las muestras fueron refrigeradasy transportadas al laboratorio de Microbiolo-gía Ambiental y Biotecnología de la Facultadde Ciencias Biológicas de la Universidad Na-cional Mayor de San Marcos.

Aislamiento de bacterias

Las muestras colectadas fueron procesa-das en el laboratorio realizando dilucionesseriadas al décimo (10-1, 10-2 ...10-5) y utilizan-do como diluyente agua de mar filtrada y es-terilizada. El aislamiento y el recuento de bac-terias marinas se realizó según la metodologíaindicada por León et al. (2000), sembrandoalícuotas de 0,1 mL de las diluciones en AgarMarino (AM) 2216 (Difco), a pH 8,0, e incu-bados a 25 ºC por 5 días.

Elección de cepas proteolíticas

Para determinar la capacidad proteolíticade las cepas se tomaron 10 mL de los cultivosde 48 h y se repicaron en AM suplementadocon caseína al 1%, pH 8,0. Los cultivos fue-ron incubados a 25 ºC hasta por 5 días. Lacapacidad hidrolítica de las cepas se reconociómediante la formación de halos transparentesalrededor de las colonias; los cuales se midieroncada 24 horas hasta por un periodo de 5 días.Las cepas fueron mantenidas en AM semisólidocon adición de 10% de glicerol para realizar laspruebas experimentales posteriores.

Optimización de los parámetros de cre-cimiento

La optimización de los parámetros de cre-cimiento se realizó utilizando las cinco cepasseleccionadas signadas como CM43, CM44,CM45, CM46 y CM48; las cuales fueron sem-bradas en Caldo Marino (CM) suplementa-dos con caseína 1% y sometidas al efecto dediferentes temperaturas (5, 8, 15, 25, 37 y 44°C), pH (5,0; 6,0; 8,0; 9,0 y 10,0) y concentra-ciones crecientes de NaCl (0, 3, 6, 9 y 10%).Los cultivos en todos los casos fueron incuba-dos hasta por 5 días.

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Evaluación de la actividad proteolítica.

Para estimular la actividad enzimática delas cepas aisladas, éstas se reactivaron en CMbajo las condiciones ya indicadas, y luego sesembraron 1 mL de estos cultivos (106 UFC/mL aproximadamente) en frascos contenien-do 100 mL de CM suplementados con caseí-na al 1%, a pH 8,0 e incubados a 25 ºC con

agitación constante de 120 rpm hasta por 96horas. La actividad enzimática (U/mL) y acti-vidad específica (U/mg de proteína) de lascepas fueron determinadas según la metodo-logía recomendada por Nieto y Ellis (1986) yTakahashi y Osaka (1970). Para ello, se to-maron los sobrenadantes de cultivos obteni-dos luego de una centrifugación a 2500 rpmpor 10 minutos a 4 °C. Estas pruebas se eje-cutaron cada 24 h hasta completar las 96 h.La mezcla de reacción se preparó en tubosconteniendo 1 mL de la solución de caseína(Difco) al 1%, pH 8,0 y agregando alicuotasde 0,2, 0,5 y 1 mL de los sobrenadantes. Lamezcla se incubó en baño maría por 20 minu-tos a 25 ºC agitando suavemente y se detuvodicha reacción adicionando 2 mL de ÁcidoTricloroacético (ATC) al 10% (p/v); luego secentrifugó a 2500 rpm por 10 minutos a tem-peratura ambiente, y a cada sobrenadante sele midió su Densidad Óptica a 280 nm compa-rándose los resultados con la curva estándardel aminoácido tirosina. Se realizó el mismoexperimento con las cinco cepas en estudio.

La unidad de actividad fue definida comola cantidad de enzima que libera un micromolde aminoácidos por minuto por mL o miligramode proteína. Por otro lado, el contenido proteicode los extractos obtenidos se realizó por el mé-todo de Lowry empleando el reactivo FolinCiocalteau (Sigma) y Seroalbúmina de bovino(mg/mL) (Sigma) como estándar.

Caracterización fenotípica de las bacte-rias aisladas

La caracterización fenotípica de las cepasCM43, CM44, CM45, CM46 y CM48 se realizómediante métodos convencionales en tubos yplacas. Como medio base para todas las prue-bas se utilizó el CM o AM a pH 8,0. La tempe-ratura de incubación fue en todos los casos a 25°C hasta por 5 días. Las cepas en estudio fue-ron sometidas a observaciones microscópicas ypruebas conducentes a la caracterizaciónmorfológica, fisiológica y bioquímica según pro-cedimientos descritos por Baumman et al. (1972),Oliver (1982), Ortigoso et al. (1994).

CEPAS 24h 48h 72h 96h 120h

CM3 + ++ +++ +++ +++CM5 + ++ +++ +++ +++CM9 + ++ +++ +++ +++CM16 ± + ++ ++ ++CM20 ± + ++ ++ ++CM22 ± + ++ ++ ++CM26 - + ++ ++ +++CM34 - - + ++ ++CM39 - - + + ++CM42 - - + + ++CM43 - + + ++ ++CM44 ± ++ +++ +++ +++CM45 - - + +++ +++CM46 - - + ++ ++CM48 + ++ +++ ++++ ++++CM58 ± ± + ++ ++CM61 ± ± + ++ ++CM63 ± ± + ++ +CM78 ± ± + ++ ++CM80 - ± + ++ ++CM85 - ± + ++ ++CM87 ± ± + ++ ++CM95 ± ± + + +CM98 ± ± + + +CM112 - ± + + +CM115 - ± ++ ++ ++

Tabla 1. Comportamiento proteolítico de las 26cepas de bacterias marinas seleccionadas se-gún el tamaño de los halos de actividad (mm dediámetro) en relación al tiempo de incubación.

Tamaño de los halos de actividad:- : no se evidencia halo± : tamaño del halo < a 2 mm+ : aproximado a 10 mm++ : aproximado a 15 mm+++ : aproximado a 20 mm++++ : aproximado a 25 mm

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Resultados y discusiónCepas con actividad proteolítica

El comportamiento proteolítico de las 26cepas aisladas a partir de muestras de aguade mar contaminadas con efluentes pesquerosse muestran en la Tabla 1. Como se puedeapreciar, es la cepa CM48 la que presentó elmayor halo de actividad (tamaño aproximadode 25 mm de diámetro) luego de 96 horas deincubación a 25 °C; sin embargo, el compor-tamiento de las demás cepas es algo homogé-neo. Estos resultados son coincidentes con losreportados por otros autores como Marty &Martín (1992) y Harris (1993), quienes anali-zaron la actividad enzimática de bacterias ais-

ladas de varias especies de invertebradosacuáticos, demostrando que una gran propor-ción de crustáceos y moluscos estudiados eranportadores de bacterias con actividadmultienzimática principalmente proteolítica.Por su parte, León et al. (2000) en estudiosrealizados sobre la microbiota bacteriana aso-ciada a invertebrados marinos de la costa cen-tral peruana encontraron que el 62,74% de lascepas aisladas mostraban actividad proteolíticasobre la caseína, sugiriendo la posibilidad deutilizar cepas nativas con propósitosbiotecnológicos. Ramírez et al. (1999), eva-luaron la actividad proteolítica extracelular delevaduras marinas aisladas en Agar Papa Dex-trosa enriquecida con caseína al 1%; sin em-bargo, las pruebas cualitativas de la actividadenzimática de 5 cepas seleccionadas mostra-ron halos de actividad inferiores a 11 mm dediámetro, en tanto la mayoría de las cepasdescritas en el presente trabajo en muchoscasos superan los 20 mm de diámetro.

Determinación de los parámetros óptimosde crecimiento

Los resultados de la evaluación de las cin-co cepas frente a diferentes parámetros físi-co-químicos, se muestran en la Tabla 2. Seobserva que la mayoría de las cepas crecenen un amplio rango de cloruro de sodio inclu-yendo la ausencia de esta sal en el medio(CM43, CM44, CM45 y CM46). Debido a estecomportamiento las bacterias de este tipo hansido consideradas por otros autores, como po-sibles cepas alóctonas que se adaptaron a lascondiciones marinas, tal vez bacterias de aguascontinentales o de origen terrestre (Ronald &Bartha, 1998). Las cepas CM43, CM45 yCM48 tuvieron un buen crecimiento en me-dios hasta con 10% de NaCl. Asimismo, to-das las cepas tuvieron buen crecimiento en elrango de 3 a 9% de NaCl, excepto la cepaCM48, la cual no creció en ausencia de NaCl,considerándose por lo tanto como una cepaautóctona de ambientes marinos. Onishi et al.(1965), realizaron estudios en ambientes ma-rinos encontrando a bacterias proteolíticas

CepasCM43 CM44 CM45 CM46 CM48

Parámetros

NaCl (%)0 ++ ++ + ++ -3 ++ ++ ++ ++ ++6 ++ ++ ++ ++ ++9 ++ + + + ++10 + - + - +

pH:5,0 + + + + +6,0 ++ ++ ++ ++ ++8,0 ++ ++ ++ ++ ++9,0 ++ ++ ++ ++ ++10,0 + + + + +

Temp. (°C )5 - - - - -8 ++ + ++ + +15 ++ ++ ++ + ++25 ++ ++ ++ ++ ++37 + ++ ++ ++ 044 - + ++ + ++

- : No crecimiento + : Crecimiento tenue++ : Buen crecimiento

Tabla 2. Efecto de los parámetros fisico-quími-cos en el crecimiento de 5 cepas de bacteriasseleccionadas por su mayor actividad proteolíticasobre caseína al 1%. En todos los casos loscultivos fueron incubados hasta por 5 días.

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halotolerantes inclusive a altas concentracio-nes de NaCl (3-20%), con un crecimiento óp-timo a 14% de NaCl, siendo las bacterias do-minantes pertenecientes a los génerosPseudomonas y Acinetobacter y un menorporcentaje a Flavobacterium y Caulobactery algunos Gram positivos como Bacillus yMicrococcus.

Las cepas evaluadas frente a diferentesvalores de pH mostraron buen crecimiento enel rango de 5,0 a 10,0; demostrando así su com-portamiento moderadamente alcalófilo propiode las bacterias de ecosistemas marinos. Encuanto al perfil térmico, cuatro de ellas (CM44,CM45, CM46 y CM48) crecieron óptimamenteentre 8 a 44 °C, excepto la cepa CM43 quetuvo como temperatura límite a 37 °C. Ningu-

na de las cepas creció a 5 °C. En relación connuestros resultados, Vázquez et al. (1999) ais-laron 8 cepas de Pseudomonas sp de biotoposcosteros antárticos, productoras de proteasascon una actividad óptima a 25 °C a pesar dehaber sido aisladas de ambientes con tempera-turas bajas. Estas temperaturas de crecimientoson características de los microorganismos con-siderados como psicrotróficos o psicrófilos mo-derados.

Evaluación de la actividad proteolítica

La evaluación de la actividad proteolíticade las 5 cepas en estudio, demostró que la cepaCM48 perteneciente al género Pseudomonassp. fue la que presentó mejor actividadenzimática frente a la caseína al 1% y a dife-rentes volúmenes de los crudos enzimáticos.

24h 48h 72h 96h

Cepas U/mL U/mg U/mL U/mg U/mL U/mg U/mL U/mg

CM43 3 11,6 4 11,64 7 12,02 7 12,17CM44 4 9,73 4 9,75 4 10,07 5 9,98CM45 2 8,57 3 9,76 7 12,09 7 12CM46 2 9,32 3 9,6 4 10,1 4 9,81CM48 4 13,7 6 15,43 10 17,38 10,37 17,76

Tabla 3. Actividad Enzimática (U/mL) y Actividad Específica (U/mg) de los crudos enzimáticosde cultivos de 5 cepas de bacterias proteolíticas sometidas a diferentes tiempos (h) de incubación.

Figura 1. Actividadproteolitica de la cepaCM48 en AM suplemen-tado con caseína al 1%.Obsérvese el halo trans-parente alrededor de lacolonia. Cultivo de 96 h.

CM48 CM481

CM432

CM431

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Asimismo, en evaluaciones posteriores concrudos tomados de cultivos de diferentes tiem-pos de incubación (desde 24 hasta 96 h) lasactividades enzimáticas más altas las registróla cepa CM48, con actividades enzimáticas de9,91 y de 10,37 U/mL y actividades específi-cas de 17,38 y 17,76 U/mg con crudosenzimáticos de 72 y 96 horas de incubaciónrespectivamente (Tabla 3 y Fig. 1). Al res-pecto, Velásquez et al. (1999) también encon-traron valores similares de actividad proteolíticade 33,65 U/mL, aunque dichos autores emplea-ron una cepa de Flavobacterium indolegenescultivadas en medio Horikoshi (inductor deproteasas) en agitación constante de 200 rpmy 30 °C de incubación, durante 72 horas. Porotro lado Vázquez et al. (1999) reportaron laactividad proteolítica de 8 cepas dePseudomonas aisladas de biotopos costerosantárticos. Las proteasas mostraron activida-des de 1700 U/L a 1x105 U/L en extractos decultivos de 48 a 72 h a 20 °C. Dichos autores

no presentan resultados de actividad específi-ca. Por otro lado, Ramírez et al. (1999), eva-luaron también la actividad proteolítica de cru-dos enzimáticos producidos por levaduras ma-rinas de los géneros Pichia y Debaromycescultivados en el medio Papa Dextrosa con ca-seína al 1% e incubados a temperatura am-biente por 4 días. Los resultados de esta eva-luación, a pesar que en nuestro caso no setrabajó con levaduras, son de alguna maneracomparables a los halos presentados por nues-tras cepas luego de 4 días de incubación enmedio AM suplementado con caseína al 1%,siendo la cepa CM48 una Pseudomonas sp.la que demostró mayor actividad, con un diá-metro superior a 20 mm de diámetro a las 96horas de incubación a 25 °C y a un pH de 8,0(Tabla 1). La actividad proteolítica de 5 cepasmarinas (CM43, CM44, CM45, CM46 yCM48) comparadas con otros trabajos men-cionados resultan ser interesantes para conti-nuar los estudios relacionados a mejorar las

Tabla 4. Caracterización fenotípica de 5 cepas de bacterias con actividad proteolítica sobrecaseína al 1%, aisladas de agua de mar contaminadas con efluentes pesqueros.

CEPASCM43 CM44 CM45 CM46 CM48

Caracteres y/o pruebas

Morfología celular/Gram B/(-) B/(-) CB/(-) B/(-) B/(-)Motilidad + + + + +Disposic. Flagelar Mon Mon Per Mon PolIndol - + - + -H2S - - + - -Luminiscencia - - - - -Catalasa + + + + +Oxidasa + + + + +Enzimas Extracelulares:DNasa + + - + -Celulasa - - - - -Amilasa + - + - -Lipasa + + + + +O/F (Glucosa) F F F F O

B : bacilos Mon : monotricosPol : polar CB : cocobacilosPer : peritricos O : oxidativoF : fermentativo

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condiciones de crecimiento y producción deenzimas proteolíticas extracelulares enmicroorganismos marinos.

Caracterización fenotípica

La caracterización fenotípica de las 5 ce-pas de bacterias previamente seleccionadasse muestra en la Tabla 4. Todas ellas resulta-ron tener formas bacilares o cocobacilares,Gram negativas, móviles, flagelares, catalasay oxidasa positivas. De acuerdo a las pruebasde caracterización morfológica, fisiológica ybioquímica las cepas en estudio pertenecen alos siguientes géneros: Aeromonas (cepasCM43, CM44 y CM46), Pseudomonas (cepaCM48) y Alcaligenes (cepa CM45). En granparte nuestros resultados corroboran los ha-llazgos de otros autores (Vásquez et al., 1999;Velásquez et al., 1999; León y García-Tello,1998; León et al., 2000), quienes trabajandocon muestras procedentes de ambientes ma-rinos tales como agua, organismos bentónicos,invertebrados de vida libre y en cultivos, lo-graron aislar bacterias con actividadproteolítica pertenecientes a los génerosPseudomonas, Vibrio, Flexibacter,Moraxella, Bacillus y Flavobacterium.Otros autores como Ramírez et al. (1999), ade-más de cepas bacterianas reportan también elhallazgo de levaduras marinas con actividadproteolítica sobre la caseína pertenecientes alos géneros Pichia y Debaromyces.

Conclusiones

Las bacterias marinas productoras deproteasas y otras exoenzimas pueden presen-tar mejores ventajas que las fuentes actualesutilizadas en la industria, ya que dichas cepaspresentan un buen crecimiento a bajas tem-peraturas, valores de pH variables (5,0 – 10,0)y un rango amplio de concentraciones de clo-ruro de sodio. En este sentido, las bacteriasmarinas son ideales para ser utilizadas en laproducción de enzimas de importancia indus-trial; asimismo, ofrecen alternativas en el tra-tamiento de aguas contaminadas con efluentespesqueros. Los resultados mostraron que la cepa

con mayor actividad proteolítica correspondió algénero Pseudomonas sp. considerada esta cepacomo autóctona de ambientes marinos por cre-cer óptimamente en pH alcalino y requerir decondiciones halófilas y psicrófilas moderadas.

Literatura citadaBárzana, E. y López-Murguía. 1995. La Tecnología

Enzimática. En: Biotecnología Alimentaria, pp.103-123. Limusa, México D.F.

Baumann, L.; M. Baumann, M. Mandel and R. Allen,1972. Taxonomy of aerobic marine Eubacteria.J. Bacteriol 110: 402-429.

Feller, G.; E. Narinx, J. A. Arpingny, M. Haleb, E. Baise,S. Genicot and Ch. Gerday. 1996. Enzymesfrom psychrophylic organism. FEMSMicrobiol. Rev. 18: 189-202.

Fenical, W. and PR. Jensen. 1993. Marinemicroorganisms: a new biomedical resource.In: Marine Biotechnology. Pharmaceutical andBioactive Natural Products. Ed. D. H. Attaway,O.R. Zaborsky. New York Plenum Press,1:419-457.

Harris, J.M. 1993. The presence, nature and role of gutmicroflora in aquatic invertebrates: a synthesis.Microb. Ecol. 25: 195-231.

León, J. y P. García –Tello. 1998. Cepas Nativas delBacteriomeuston Marino y su Actividadinhibitoria de Bacterias Ictiopatogenas. Rev.peru. biol. 5(1): 47-64.

León, J.; F. Pellón, V. Unda, J. David, C. Anaya, y V.Mendoza. 2000. Producción de enzimasextracelulares por bacterias aisladas de inverte-brados marinos. Rev. Peru. Biol. 7(2): 202-210.

Marty, P. & Y. Martín. 1992. Aerobic heterotrophicbacteria associated with some Mediterraneancoastal benthic invertebrates: characterizationof strains, exoenzyme and antibioticproduction. Mar Life 1(1): 1-8.

Nieto, T. & A. Ellis. 1986. Characterization ofextracelular metallo and serine proteases ofAeromonas hydrophila. Gem. Microbiol. 132:1975-1979.

Oliver, J. D. 1982. Taxonomic Scheme for theidentification of marine bacteria. Deep-Sea Res.29: 795-798.

Onishi, H; E. Mac Cane & E. Gibbons. 1965. A syntheticmedium for extremely halophilic bacteria. Can.J. Microbiol. 11: 365-373

Ortigoso, M.; E. Garay & M-J. Pujalte. 1994. NumericalTaxonomy of aerobic, Gram – negative bacte-ria associated with oysters and surroundingseawater of the Mediterranean coast System.Appl. Microbiol. 17: 589-600

Ramírez, O.; N. Hernández & J. Ochoa. 1999. Aprove-chamiento biotecnológico de levaduras mari-

186

Sánchez et al.

Rev. peru. biol. 11(2): 179-186 (2004)

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bib.

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e/B

VR

evist

as/b

iolo

gia/

biol

ogia

NEW

.htm

nas, Memorias del IV Congreso Latinoameri-cano de Biotecnología y Bioingeniería. P.III.68. México.

Ronald, M. & R. Bartha. 1998. Ecología microbiana ymicrobiología ambiental, 4ta. Edición. Edit.Pearson Educación, S. A. Madrid, España.

Stanley, I. T. & P. M. Stanley. 1986. Potentialcommercial applications in aquaticmicrobiology. Microb. Ecol., 12: 79-100.

Schmidt, H. 1981. Avances en ciencias y tecnología de losalimentos. Alfabeta Impresora, Santiago de Chile.

Takahashi, T. & A. Osaka. 1970. Purification andcharacterization of a protein in venom oftrimeresurus flavoviridis, complete separationof the enzyme from hemorrhagie activity.Biochem. Biophys. Acta. 198:293.

Vázquez, S.; W. Mac Cormack & E. Fraile. 1999. Carac-terización de proteasas producidas por bacte-rias psicrotróficas antárticas, IV CongresoLatinoamericano de Biotecnología yBioingeniería. P IV. 8. México.

Velásquez, R.; A. Monroy & R. Oliart. 1999. Purifica-ción y caracterización parcial de las proteasasalcalinas producidas por Flavobacteriumindolegenes. IV Congreso latinoamericano deBiotecnología y Bioingeniería P.I.49-México.