Proteasas alcalinas

12
Genetica recombinante Resumen Las tecnologías de ADN recombinante y herramientas de biología molecular, están mostrando un desarrollo acelerado actualmente en el campo de la biotecnología; ya que son ampliamente usadas en diferentes industrias como la alimenticia, farmacéutica y la petrolera, en busca de la mejora de los procesos productivos. Dentro de este campo se pueden reconocer procesos de amplificación de secuencias, clonación, transformación genética y expresión de genes específicos. Una de las industrias que ha hecho uso de estas tecnologías es la industria detergente, que utiliza proteasas alcalinas en detergentes de lavandería para mejorar su efectividad de limpieza, por medio de la degradación proteica. Existen gran variedad de microorganismos que producen este tipo de enzimas, tales como bacterias y hongos (unicelulares y multicelulares). En el artículo en estudio la proteasa alcalina alpES1 de la especie de hongo Aspergillus Clavatus fue el objeto de investigación. Dicho estudio se basó principalmente en el aislamiento de esta enzima y en la determinación de la estabilidad de la proteasa en temperaturas altas y pH. El proceso clonación se realizó mediante un vector plasmidico pCRII-TOPO y en la expresión del gen se utilizó el vector pET-30b (+) en cepas de E. coli. Después del proceso de purificación se encontró que la enzima tenía un peso de 32 KDa poseía una relación significante con otras proteasas del genero A.Clavatus [1]. Introducción: El desarrollo exponencial de las industrias (farmacéutica, alimenticia, cosmética, etc.) y su gran inversión monetaria en investigación y desarrollo de nuevos productos ha llevado que técnicas de ADN recombinante planteados por la biología molecular como PCR (reacción de polimerasa en cadena), secuenciación genómica y clonación de vectores con ayuda de enzimas de restricción sean procesos diarios de rutina. Por un lado se tiene la PCR; método in vitro utilizado para sintetizar enzimáticamente secuencias definidas de ADN y tiene como principal objetivo la obtención de un gran número de copias de un fragmento de ADN específico, partiendo de una pequeña cantidad de este fragmento (molde). Por otro lado están las técnicas de separación de fragmentos de ADN según su tamaño como la electroforesis, que pueden servir como un paso previo a la secuenciación de estos fragmentos. Los vectores de clonación son muy útiles en la modificación del material genético, esto con el fin que un

description

proyecto de aplicación biotecnológica en la industria de los detergentes

Transcript of Proteasas alcalinas

Genetica recombinante

Resumen Las tecnologas de ADN recombinante y herramientas de biologa molecular, estn mostrando un desarrollo acelerado actualmente en el campo de la biotecnologa; ya que son ampliamente usadas en diferentes industrias como la alimenticia, farmacutica y la petrolera, en busca de la mejora de los procesos productivos. Dentro de este campo se pueden reconocer procesos de amplificacin de secuencias, clonacin, transformacin gentica y expresin de genes especficos. Una de las industrias que ha hecho uso de estas tecnologas es la industria detergente, que utiliza proteasas alcalinas en detergentes de lavandera para mejorar su efectividad de limpieza, por medio de la degradacin proteica. Existen gran variedad de microorganismos que producen este tipo de enzimas, tales como bacterias y hongos (unicelulares y multicelulares). En el artculo en estudio la proteasa alcalina alpES1 de la especie de hongo Aspergillus Clavatus fue el objeto de investigacin. Dicho estudio se bas principalmente en el aislamiento de esta enzima y en la determinacin de la estabilidad de la proteasa en temperaturas altas y pH. El proceso clonacin se realiz mediante un vector plasmidico pCRII-TOPO y en la expresin del gen se utiliz el vector pET-30b (+) en cepas de E. coli. Despus del proceso de purificacin se encontr que la enzima tena un peso de 32 KDa posea una relacin significante con otras proteasas del genero A.Clavatus [1].

Introduccin:

El desarrollo exponencial de las industrias (farmacutica, alimenticia, cosmtica, etc.) y su gran inversin monetaria en investigacin y desarrollo de nuevos productos ha llevado que tcnicas de ADN recombinante planteados por la biologa molecular como PCR (reaccin de polimerasa en cadena), secuenciacin genmica y clonacin de vectores con ayuda de enzimas de restriccin sean procesos diarios de rutina. Por un lado se tiene la PCR; mtodo in vitro utilizado para sintetizar enzimticamente secuencias definidas de ADN y tiene como principal objetivo la obtencin de un gran nmero de copias de un fragmento de ADN especfico, partiendo de una pequea cantidad de este fragmento (molde). Por otro lado estn las tcnicas de separacin de fragmentos de ADN segn su tamao como la electroforesis, que pueden servir como un paso previo a la secuenciacin de estos fragmentos. Los vectores de clonacin son muy tiles en la modificacin del material gentico, esto con el fin que un organismo que genticamente sea incapaz de producir una biomolcula, luego de una modificacin, tenga la maquinaria gentica para generar dicha biomolcula. Esta modificacin gentica se basa en el uso de enzimas de restriccin para seleccionar el fragmento de ADN y luego insertar este fragmento en el organismo a modificar.Todas estas metodologas establecidas por la biologa molecular tienen un potencial enorme, por ejemplo; se tiene una persona que padece de una enfermedad basada en la deficiencia de una protena o enzima especfica, hay grandes posibilidades que se pueda modificar genticamente un organismo (ejemplo comn: bacteria) para que produzca esta protena o enzima especifica que despus puede ser aislada y usada para tratar este dficit de la misma. Estas metodologas no son solo usadas para la industria farmacutica, algunas enzimas como las proteasas son muy estudiadas por la bioingeniera. Estas enzimas son capaces de hidrolizar los enlaces peptdicos presentes en las protenas convirtiendo molculas de mayor tamao en otras de menor en medios cuyo pH es mayor a 7. Su mayor aplicacin es en la industria de detergentes, donde son un componente muy eficaz, sin embargo, en estudios anteriores se presentaron incompatibilidades con algunos tipos de surfactantes en la formulacin y problemas de estabilidad a ciertas temperaturas, esto gnero que el centro de varios estudios sea generar proteasas cada vez ms estables. Las proteasas son enzimas que usualmente se encuentran en Hongos, por lo que algunos estudios se centran en tratar de expresar estas enzimas en otros organismos con una tasa de replicacin ms alta. En el presente artculo se presentan estudios sobre proteasas alcalinas provenientes de Aspergillus Clavatus, donde de manera general; se tom un fragmento de DNA, se amplific y secuenci para que posteriormente fuera insertado como vector y expresado por E. Coli.

Materiales y mtodos:

Cepas, plsmidos y condiciones de crecimiento Inicialmente se aisl la enzima ES1, proteasa alcalina de A. clavatus proveniente de aguas residuales. En un cultivo en placas de agar de dextrosa de papa a 30 C se realiz la propagacin de la cepa. Posteriormente se extrajo la produccin de proteasa y se llev a un medio con maltosa, extracto de levadura, fosfato de potasio, cloruro de calcio, sulfato de magnesio y cloruro de sodio, a un pH de 8. El medio de cultivo se inocul y se incubo en un agitador rotativo por 72 horas a 30 C. Para el cultivo del hospedero para la propagacin de plsmidos, se utiliz la especie E.coli, sembrada en un medio de Luria Bertani a 37C, adicionalmente se le agreg un sustrato llamado gal(LandaD3) para promover la expresin de la cepa. Respecto a la clonacin de genes se utiliz un plsmido denominado pCR II-TOPO, y para la expresin se requiri un vector pET-30b(+). La extraccin del ADN genmico se realiz de A. clavatus ES1 y se purific de acuerdo con los mtodos estndar de Sambrook et al [2]. Aislamiento de ARN y transcripcin reversa.A. clavatus ES1 fue cultivada en el medio anteriormente mencionado, despus de 48 horas, se cosecho por filtracin, se realiz un lavado con agua destilada estril e inmediatamente se congel con nitrgeno lquido. Dicha muestra fue triturada y el ARN total se extrajo con el reactivo Trizol. El pellet de RNA fue recolectado despus de la centrifugacin y lavado dos veces con etanol al 75%.La preparacin de RNA fue re suspendida en agua tratada DEPC y se estim la concentracin y pureza de la preparacin, calculando la relacin de absorbancia A260nm/A280nm. Se realiz una RT-PCR utilizando un sistema de transcripcin reversa SuperScriptTM. La reaccin se incub a una temperatura de 50 C por 50 min finalmente se inactivo la enzima a 70 C por 15 min.Clonacin y secuenciacin del ADN de los genes de ADNc alpES1 y alpES1 De acuerdo con la secuencia del gen Apl1 de A. clavatus NRRL1 (XM 001272037), se disearon dos cebadores oligonucleotidos para el proceso de aislamiento, secuenciacin y clonacin del marco abierto de lectura ORF que codifica para la proteasa alcalina extracelular. Para la amplificacin del ADN, se realiz una PCR en un termociclador Thermo Hybaid PCR Express. Se modificaron los dos cebadores requeridos con sitios de reconocimiento para las ER Ndel y Xhol; esto con el fin de facilitar la clonacin en el vector de expresin. EL producto se analiz en un gel de agarosa con bromuro de etidio y purific con el kit de purificacin de Invintrogen. Los productos de la purificacin fueron ligados al vector pCRII-TOPO de acuerdo al protocolo del fabricante y posteriormente se realiz la transformacin en clulas competentes de E.coli TOP10. Se hizo la purificacin de los plsmidos recombinantes y se comprob el inserto mediante PCR y anlisis de digestin con Ndel y Xhol. LA secuenciacin de los dos genes DNAc alpES1 and alp1ES1 fue determinada por el mtodo de terminacin de cadena dideoxi por medio de un secuenciador automtico, utilizando cebadores M13 [3]. Para confirmar y dar fidelidad a la secuenciacin, se realiz el procedimiento anterior por triplicado de diferentes clones.Expresin de ADNc alpES1 Para la expresin del gen de ADNc alpES1 en E. coli se procedi a realizar una digestin con enzimas de restriccin y se transfiri al vector de expresin pET-30b (+), que fue incorporado a las cepas de E.Coli. Se hizo la inoculacin de las cepas transformadas en un medio LB fresco, en condiciones aerobias a 37C, y se expres la proteasa con ayuda de IPTG. Despus de la incubacin de 8 horas se centrifug y se re suspendi en una solucin tampn. Se realiz lisis celular por sonicacin y se volvi a centrifugar para separar el sobrenadante, el cual contiene las proteasas.La purificacin de la proteasa recombinantes se hizo por medio de una electroforesis SDS-PAGE, y se utilizaron patrones de pesos entre 66 y 14 KDa para la estimacin del peso molecular de la enzima.ResultadosLos genes que codifican para la proteasa alcalina son ADNc alpES1 y alpES1 los cuales se amplificaron por PCR a partir de ADNc y ADN genmico, obteniendo fragmentos de 1,2 y 1,4 Kb respectivamente. Luego se procedi a clonar los productos de la PCR en el vector (Plsmido) pCR II-TOPO, para ser trasferido a la bacteria E. Coli.En la figura 1 se aprecia la secuenciacin nucleotdica de los genes de ADNc alpES1 y alpES1. Al analizar la secuenciacin del gen alpES1 se apreci un marco abierto de lectura de 1376 pb, mientras que en la secuenciacin del gen ADNc alpS1 se pudo evidenciar la presencia de un marco abierto de lectura de 1212 pb, que se encarga de codificar para una pre-proteasa. Al alinear estas dos secuencias se encontr que el gen cromosmico fue interrumpido por tres intrones de 53, 54 y 57 pb.El ORF codificante para la protena con masa de 41.814 Da y 403 residuos aminoacdicos es el mismo. Mientras el gen codificante de la proteasa alpES1 codifica desde el residuo nmero 15 de la secuencia de aminocidos de la proteasa purificada que se empareja de forma adecuada con el aminocido 15 deducido de la enzima madura, lo cual permite afirmar que s codifica para la enzima purificada. La alineacin de la secuencia deducida de ADNc con las de otras proteasas alcalinas de Aspergillus que presentan concordancia con otras proteasas de origen fngico. Adicionalmente, se encontr que la secuencia de aminocidos de la proteasa alpES1 no contiene residuos de cistina y cistena. Expresin y purificacin de AlpES1El gen de ADNc alpES1 fue subclonado en un plsmido de expresin, mientras que el vector fue transformado en una bacteria E.Coli BL2. La expresin de la proteasa del gen alpES1 en un transformante positivo se llev a cabo a diferentes concentraciones de IPTG. Por tcnicas de interrupcin y eliminacin de restos celulares de E. Coli, fue posible cuantificar las fracciones solubles e insolubles, lo que permiti determinar que la actividad se centr en la fraccin soluble. No se encontr actividad en la proteasa transformada en E. Coli BL21 no inducida que se us como control. Finalmente, se evidenci que en una concentracin de 0,4 mM IPTG a 37C se daba la mayor expresin. La proteasa recombinante alpES1 fue purificada por precipitacin, filtracin y posterior cromatografa de intercambio inico (Figura 3).

Discusin

Las proteasas alcalinas son enzimas de importancia en la industria de los detergentes de lavanderia, ya que hacen parte de la formulacin de dichos productos. Se tena presente la estabilidad de la proteasa alcalina proveniente de A. clavatus ES1. Basndose en lo anterior el reporte en caso se enfoc en aislar los genes codificantes para la proteasa alcalina del ADNc de alpES1 y alpES1 por medio de RT-PCR a partir de ARN total y PCR para ADN genmico de A. clavatus ES1 respectivamente. Que fueron clonados y expresados correctamente en vectores plasmidicos especficos.

Utilizando los dos tipos de ADN de alpES1, se realiz una comparacin de las secuencias, que mostr la presencia de tres intrones de 53,57 y 54 bp en longitud, fragmentos que son comunes en las proteasas alcalinas provenientes de hongos, como Alp1 A.clavatus, tambin en proteasas de serina alcalinas de A. fumigatus, A. nidulans y A. oryzae. Es importante hacer una comparacin de la secuencia de nucletidos en busca de un porcentaje de homologa con las proteasas pertenecientes a las especies ya mencionadas de algunos hongos. La secuencia del gen alpES1 mostr una homologa del 97%, 79%, y 75% con los genes de la proteasa alcalina de A. clavatus, N. fischeri y A. flavus respectivamente. Siendo la ms similar la correspondiente al gen Alp1.

Despus de conocer las caractersticas del ADN incorporado en los vectores, se llev a cabo una transformacin de clulas de la especie de bacteria E.coli BL21, en cultivo se observ que el ptimo nivel de expresin respecto a un control fue a 37 C y a una concentracin de 0,4mM de IPTG, en comparacin con otras concentraciones de IPTG.

Se logr encontrar que la proteasa alcalina perteneciente al gen AlpES1 tiene una buena estabilidad con surfactantes, a pH alcalino y temperaturas moderadas. Con los resultados anteriores se pudo estimar un uso potencial de la enzima, haciendo parte de la formulacin de detergentes innovadores, ya que puede permanecer estable en presencia de los componentes primordiales de estos productos de aseo. Sin embargo la estabilidad de la enzima con surfactantes anionicos se vio disminuida y sera recomendable estudios ms profundos en busca de mejorar dicha estabilidad.

Bibliografa

[1] Hajji M, Hmidet N, Jellouli K, Vallaeys T, Nasri M, Sellami-Kamoun A. (2010). Gene cloning and expression of a detergent stable alkaline protease from Aspergillus clavatus ES1. Process Biochemistry. vol. 45.

[2] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. A laboratory manual. 2nd edition Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory; 1989.

[3] Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990;215:40310.

Anexos

Fig. 1. Secuencia de nucletidos del gen de alpES1 y la secuencia de aminocidos deducida de la proteasa alcalina de A. clavatus ES1. Los nmeros en el lado izquierdo de las secuencias de aminocidos y de nucletidos indican posiciones de aminocidos y nucletidos, respectivamente. La secuencia de nucletidos estan numerados desde el primer codn de iniciacin. El primer aminocido Met de la enzima se cuenta como +1. Los residuos iniciales putativos de la pre-protena (pre), pro-protena (pro) y la protena madura (maduro) estn indicados. El asterisco (*) indica un codn de parada. La secuencia de ADN de los intrones se muestra en cursiva.

Fig. 2 Secuencia de aminocidos de alineacin de pre-pro-enzima AlpES1 con proteasas alcalinas de A. clavatus NRRL1 (XM 001272037), N. fischeri NRRl181 (XM 001266851), A. oryzae RIB40 (XP 001820144) y A. nidulans FGSC A4 [29] . El asterisco (*) significa que los residuos de esa columna son idnticos en todas las secuencias en la alineacin. (:) Significa que se han observado sustituciones conservativas. (.) Significa que se observan sustituciones semi-conservativas. (X) muestra los cambios de aminocidos entre AlpES1 y otras proteasas fngicas. (?) Indica sitios actif del residuo.

Fig. 3 Pagina SDS para la expresin de AlpES1 recombinante. Los carriles 1 y 8: marcadores de peso molecular. Carril 2: E. coli BL21 (pET30b (+) / alpES1no inducida. Carril 3: E. coli BL21 (pET30b (+)). Carriles 4-7: E. coli BL21 (pET30b (+) / alpES1) inducida con 0,2, 0,4, 0,6 y 1,0 mM IPTG. Carril 9: la AlpES1 recombinante purificada.