OPTIMASI SUHU DAN VOLUME ETANOL PADA PROSES …repository.usd.ac.id/16980/2/058114045_Full.pdf ·...
Transcript of OPTIMASI SUHU DAN VOLUME ETANOL PADA PROSES …repository.usd.ac.id/16980/2/058114045_Full.pdf ·...
ii
OPTIMASI SUHU DAN VOLUME ETANOL DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii. M.) DENGAN
APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Diana Erosita Pramesthi
NIM : 058114045
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2008
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
Kita tidak pernah diberi impian tanpa kemampuan untuk mewujudkannya.
Kupersembahkan Skripsi ini bagi :
Jesus Christ
Papa Mamaku
Adik-adikku
Teman-teman angkatan 2005
Almamaterku Tercinta
Janganlah takut, sebab Aku menyertai engkau,
janganlah bimbang, sebab Aku ini Allahmu; Aku akan meneguhkan, bahkan akan
menolong engkau; Aku akan memegang engkau dengan tangan
kananKu yang membawa kemenangan. Yesaya 41 : 10
vii
PRAKATA
Puji Syukur kepada Tuhan Yang Maha Pengasih dan Penyayang atas
semua berkat dan penyertaan-Nya kepada penulis, sehingga penulis dapat
menyelesaikan laporan akhir ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk
memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S.Farm).
Penulis banyak mengalami kesulitan dan hambatan dalam menyelesaikan
laporan akhir ini. Namun dengan bantuan dari banyak pihak, akhirnya penulis
dapat menyelesaikan laporan akhir tersebut. Dengan kerendahan hati penulis ingin
mengucapkan terimakasih atas bantuan yang telah diberikan kepada :
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta.
2. PHKA3 atas bantuan dan kesempatan yang diberikan.
3. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat
Tradisional atas batuannya dalam pengadaan bahan baku dalam penelitian
ini.
4. Yohanes Dwiatmaka M.Si., selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan bimbingan dan arahan kepada penulis.
5. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan bimbingan dan arahan kepada penulis.
6. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku dosen penguji atas kesediaannya
meluangkan waktu untuk menjadi dosen penguji, serta kritik dan saran yang
diberikan.
viii
7. Ign. Yulius Kristio Budiasmoro M.Si., selaku dosen penguji yang telah
menguji sekaligus memberikan kritik, saran, dan arahan kepada penulis.
8. Yohanes Martono, S.Si. atas arahan dan masukan yang diberikan.
9. Papa, mama, dan adik-adik atas dukungan, kasih sayang, dan cintanya.
10. Teman-teman payung Steviosida sebagai teman satu tim atas bantuan,
kerjasama, dan dukungannya.
11. Teman-teman angkatan 2005 terutama kelompok E atas suka dan duka yang
kita lewati bersama.
12. Teman-teman Kost Wisma Surya atas bantuan doa dan dukungannya.
13. Pak Kasiran, Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Ottok, serta laboran-laboran
yang lain atas bantuannya selama penulis menyelesaikan laporan akhir.
14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah
membantu penulis dalam menyelesaikan laporan akhir ini.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan laporan akhir ini banyak
kekurangan mengingat adanya keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis.
Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua
pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.
Penulis
x
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL.........................................................................................i
HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................ iii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .............................................. vi
PRAKATA ........................................................................................................ vii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................ ix
DAFTAR ISI ....................................................................................................... x
DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv
INTISARI ......................................................................................................... xvi
ABSTRACT ...................................................................................................... xvii
BAB I. PENGANTAR.........................................................................................1
A. Latar Belakang...........................................................................................1
B. Perumusan Masalah...................................................................................3
C. Keaslian Penelitian....................................................................................3
D. Manfaat Penelitian.....................................................................................3
E. Tujuan Penelitian.......................................................................................4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.................................................................5
A. Stevia rebaudiana Bertoni. M...................................................................5
1. Keterangan botani.............................................................................5
2. Deskripsi tanaman............................................................................5
B. Glikosida Steviol.......................................................................................6
C. Maserasi....................................................................................................9
D. Etanol 96%................................................................................................10
E. Sokletasi....................................................................................................10
xi
F. Ekstrak.........................................................................................................11
G. Kromatografi Lapis Tipis............................................................................11
H. KLT Densitometri.......................................................................................13
I. . Image J........................................................................................................14
J. Desain Faktorial............................................................................................15
K. Landasan Teori............................................................................................17
L. Hipotesis......................................................................................................18
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN.............................................................19
A. Jenis Rancangan Penelitian.........................................................................19
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.............................................19
1. Variabel Penelitian.........................................................................19
2. Definisi Operasional......................................................................20
C. Materi Penelitian.........................................................................................21
D. Instrumen Penelitian....................................................................................22
E. Tahap-tahap Penelitian................................................................................22
1. Determinasi Tanaman Stevia rebaudiana Bertonii.M...................22
2. Pembuatan Simplisia Daun Stevia rebaudiana Bertonii.M..........22
a. Pengumpulan bahan............................................................22
b. Sortasi Kering.....................................................................22
c. Pengeringan........................................................................23
d. Pembuatan Serbuk..............................................................23
e. Pembuatan Ekstrak.............................................................23
1. Defatisasi Serbuk Simplisia....................................23
2. Ekstraksi Serbuk Simplisia....................................23
3. Analisis Kualitatif Ekstrak Tanaman Stevia..................................24
4. Analisis Kuantitatif Ekstrak Tanaman Stevia ...............................25
a. Pembuatan Kurva Baku dan analisis sampel ...................25
b. Analisis Hasil....................................................................26
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN.............................................................28
A. Determinasi Tanaman Stevia.....................................................................28
B. Pemilihan Simplisia dan Pembuatan Serbuk.............................................28
xii
C. Pembuatan Ekstrak Stevia Secara Maserasi...............................................32
D. Analisis Kualitatif Bercak Maserat Tanaman Stevia..................................35
E. Analisis Kuantitatif Bercak Maserat Tanaman Stevia................................39
1. Pembuatan Kurva Baku.................................................................39
2. Penetapan Kadar Sampel……………………………………………..42
3. Analisis Kadar Secara Desain Faktorial……………………...........44
4. Analisis Yate’s Treatment…………………………………………….46
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN...............................................................49
A. Kesimpulan.................................................................................................49
B. Saran...........................................................................................................49
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................... ...................50
LAMPIRAN ......................................................................................................... 56
BIOGRAFI PENULIS ......................................................................................... 80
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Notasi Formula Desain Faktorial ......................................................... 16
Tabel II. Variasi Kondisi Suhu dan Volume Etanol 96% ................................. 24
Tabel III. Rf Sampel dan Baku Steviosida ........................................................ 37
Tabel IV. Hubungan Jumlah Steviosida (µg) dengan AUC pada seri Baku ..... 41
Tabel V. Kadar Steviosida dalam ekstrak yang dibuat dari masing-masing kondisi
dan replikasi ........................................................................................ 42
Tabel VI. Kondisi Desain Faktorial dan Respon yang dihasilkan ................... 44
Tabel VII. Nilai Efek dari faktor Suhu, Etanol 96%, dan Interaksinya ............ 44
Tabel VIII. Hasil Perhitungan Yate’s Treatment pada respon kadar Steviosida47
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur komponen glikosida Steviol ................................................ 8
Gambar 2. Struktur komponen glikosida Steviol ................................................ 8
Gambar 3. Tampilan bercak sampel dan baku untuk perhitungan Rf ............... 38
Gambar 4. Tampilan bercak sampel dan baku untuk perhitungan Rf setelah di
Image J .............................................................................................. 40
Gambar 5. Grafik Kurva Baku .......................................................................... 41
Gambar 6. Grafik hubungan suhu maserasi (a) dan volume etanol (b) terhadap
kadar steviosida ................................................................................... 45
Gambar 7. Contour Plot Daerah Optimum ....................................................... 46
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Kurva Baku Steviosida ................................................................. 56
Lampiran 2. Data Sampel .................................................................................. 57
Lampiran 3. Perhitungan Data Sampel ............................................................. 58
Lampiran 4. Perhitungan Desain Faktorial ...................................................... 63
Lampiran 5. Grafik Contour Plot ...................................................................... 66
Lampiran 6. Perhitungan Yate’s Treatment ...................................................... 67
Lampiran 7. Gambar Tanaman dan simplisia kering ........................................ 71
Lampiran 8. Gambar pereaksi semprot ............................................................ 72
Lampiran 9. Tampilan Baku dan sampel pada lempeng KLT .......................... 73
Lampiran 10. Tampilan Baku dan Sampel dalam Tahapan Image J ................ 74
Lampiran 11. Tampilan Ekstrak.........................................................................75
Lampiran12. Lampiran Surat Determinasi ........................................................ 76
Lampiran 13. Langkah-langkah Analisis Image J..............................................78
xvi
OPTIMASI SUHU DAN VOLUME ETANOL DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii .M.) DENGAN
APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
INTISARI
Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii. M.) merupakan tanaman yang banyak dimanfaatkan sebagai pemanis alami tidak berkalori berupa steviosida. Karena tidak berkalori maka pemanis ini sesuai untuk dikonsumsi bagi para penderita diabetes. Steviosida banyak terkandung pada daun tanaman stevia. Salah satu tahapan dalam proses isolasi steviosida adalah ekstraksi. Pada penelitian ini digunakan metode ekstraksi secara maserasi terhadap serbuk daun stevia dengan perbedaan suhu dan jumlah volume cairan penyari. Penelitian ini ditujukan untuk mengetahui faktor yang dominan mempengaruhi proses maserasi serbuk daun tanaman stevia agar dihasilkan kadar steviosida yang optimal. Cairan penyari yang digunakan adalah etanol 96%.
Penetapan kadar steviosida menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis dengan Fase diam silika gel dan fase Gerak kloroform : metanol : air (10 : 15: 2 v/v ) yang selanjutnya dihitung luas bercak yang muncul secara densitometri dengan menggunakan software Image J. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental menggunakan metode desain faktorial, dengan 2 faktor yaitu suhu-volume etanol dan 2 level, yaitu level tinggi-level rendah. Analisis data secara statistik menggunakan Yate’s Treatment dengan taraf kepercayaan 95%.
Diperoleh hasil bahwa suhu maserasi, volume etanol 96%, dan interaksinya mempengaruhi kadar steviosida yang dihasilkan. Volume etanol 96% berpengaruh dominan terhadap respon kadar steviosida yang dihasilkan, sedangkan suhu maserasi dan interaksi antara suhu maserasi dan volume etanol 96% tidak berpengaruh dalam menentukan kadar steviosida yang dihasilkan. Berdasarkan contour plot diperoleh area optimum untuk kadar steviosida yang dihasilkan yang diperkirakan sebagai proses maserasi optimum pada level yang diteliti. Kata kunci : Stevia rebaudiana Bertonii. M., steviosida, maserasi, suhu, volume pelarut etanol 96%, Kromatografi Lapis Tipis, Image J, Desain Faktorial.
xvii
ABSTRACT
Stevia is a plant which used as a sweeterner that have zero calorie so it’s suitable for diabetic patient. Stevioside is much contains in leaves. One step in isolation process of stevioside is extraction. In this experiment used maceration method of extraction stevia leaves powder with different of temperature and ethanol 96% volume. In this experiment used to know the dominant factor influence in maceration process of stevia leaves powder which produced optimum concentration of stevioside. Solvent that use in this process is ethanol 96%.
Determination of concentration stevioside use the Thin Layer Chromatography with stationary phase is silica gel and mobile phase is cloroform : methanol : water (10 : 15: 2 v/v ) and than the wide of spot analysed with Image J software. This study was experimental research use factorial design method with two factor maceration temperature-volume of etanol 96% and two level high level-low level. The maceration process were optimized on their concentration of stevioside. The data were analyzed statistically using Yate’s treatment with 95% level of confidence.
The result show that the maceration temperature, volume of ethanol 96%, and its interaction influence with concentration of stevioside. Volume of ethanol 96% was dominant on determining concentration of stevioside, while maceration temperature and the interaction between maceration temperature and volume of ethanol 96% not influence on determining concentration of stevioside. The contour plot showed the optimum area of concentration of stevioside. The area was estimated as optimum maceration process of stevia extract on the level studied. Keyword : Stevia rebaudiana Bertonii. M., stevioside, maceration, Temperature, volume of ethanol 96%, Thin Layer Chromatography, Image J, Factorial Design.
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Pada jaman sekarang ini jumlah penderita penyakit diabetes semakin
meningkat, hal ini membawa kesadaran akan pentingnya pencegahan penyakit
tersebut sehingga membawa dampak berupa peningkatan jumlah konsumsi gula
tidak berkalori sebagai pemanis (Anonim, 2004). Sebagai alternatif digunakan
bahan pemanis buatan dengan kalori yang lebih rendah yang terbuat dari senyawa-
senyawa kimia, sebagai contoh natrium sakarin, natrium siklamat, dan lain
sebagainya. Pemanis pengganti tersebut memiliki rasa yang mirip dengan sukrosa
(Moraes dan Machado, 2001), akan tetapi ternyata penggunaan dalam jumlah
yang besar akan menimbulkan rasa pahit (Achyar, 2005) dan penggunaan dalam
jangka waktu lama dapat bersifat karsinogen (Mudjajanto, 2005).
Oleh karena itu digunakan alternatif pemanis lainnya, yang berupa bahan
pemanis alami yang berasal dari ekstrak tanaman. Salah satu tanaman yang
potensial dapat dikembangkan sebagai pemanis adalah stevia. Pada tanaman
stevia terkandung steviosida yang berperan menimbulkan rasa manis yang
besarnya kurang lebih 200-300 kali kemanisan gula jika dilarutkan dalam air
(Wallin, 2007) dan tidak berkalori (Moraes dan Machado, 2001). Selain itu dari
beberapa penelitian telah menyebutkan bahwa steviosida tidak mempunyai
aktivitas toksik yang berarti bagi sistem biologi. Ekstrak yang mengandung
steviosida tidak mempunyai efek mutagenik dan genotoksik (Nabors, 1986).
2
Oleh karena itu, untuk mendapatkan ekstrak yang mengandung kadar
steviosida yang optimum maka perlu dicari kondisi optimum dalam maserasi.
Pemilihan ekstraksi dengan metode maserasi memiliki kelebihan yaitu cara
pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah dilakukan
(Anonim, 1986). Dalam penelitian ini akan dioptimasi faktor suhu dan faktor
volume etanol 96% pada proses maserasi daun stevia, dimana suhu dan volume
penyari (etanol 96%) berpengaruh terhadap efektivitas penyarian. Selain itu
menurut Wallin (2007), steviosida mudah larut dalam etanol. Berdasarkan hasil
penelitian terungkap juga bahwa dengan peningkatan suhu dalam penyarian
steviosida menggunakan penyari etanol dihasilkan peningkatan kadar steviosida
(Alupului dan Lavric, 2008). Hal ini juga didukung dari data menurut Pasquel
A.(2008) yang menyebutkan bahwa dengan adanya peningkatan suhu dari 16°C
menjadi 45°C dihasilkan peningkatan massa glikosida yang dihasilkan dari 0,1 x
103 kg menjadi 0,15 x 103 kg. Penggunaan etanol sebagai cairan penyari akan
lebih baik kemampuannya dalam mengisolasi steviosida dibanding penyari
dengan air (Jaroslav Pol. dkk , 2007).
Dalam Penelitian ini akan dicari area optimum kondisi proses maserasi
dengan variasi suhu dan volume etanol 96% yang digunakan sehingga dapat
memberi solusi dalam pengadaan ekstrak yang memiliki kandungan steviosida
yang optimum.
3
1. Perumusan masalah
Permasalahan dalam penelitian ini dapat dirumuskan dalam pertanyaan
sebagai berikut :
1. Apakah perbedaan suhu dan volume etanol 96% yang digunakan pada
proses maserasi daun stevia berpengaruh terhadap kadar steviosida yang
diperoleh ?
2. Berapakah kadar steviosida yang optimum yang dapat diperoleh pada
proses maserasi daun stevia dengan variasi suhu dan volume etanol
96%?
3. Manakah faktor antara suhu dan volume etanol 96% yang paling
dominan berpengaruh pada proses maserasi daun stevia sehingga
diperoleh kadar steviosida yang optimum?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh yang diketahui penulis, penelitian tentang optimasi proses maserasi
dengan melihat pengaruh suhu dan volume etanol 96% terhadap kadar
steviosida dengan aplikasi desain faktorial belum pernah dilakukan oleh
peneliti lain.
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Teoritis
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan
informasi bagi perkembangan ilmu pengetahuan di bidang farmasi
Sains Teknologi khususnya mengenai pengaruh perbedaan suhu dan
4
volume etanol 96% terhadap kadar steviosida yang dihasilkan pada
proses maserasi serbuk daun tanaman stevia.
b. Manfaat Praktis
Dari penelitian ini akan diketahui kondisi suhu dan volume pelarut
etanol 96% dalam proses maserasi yang paling optimal untuk
menghasilkan ekstrak tanaman stevia dengan kadar steviosida yang
paling optimum.
4. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk menambah khasanah ilmu
pengetahuan mengenai kondisi proses maserasi yang optimal untuk
memperoleh kadar steviosida yang paling optimum dari tanaman
stevia.
2. Tujuan khusus
1. Membuktikan ada tidaknya pengaruh perbedaan suhu dan
volume etanol 96% terhadap kadar steviosida yang dihasilkan
pada proses maserasi serbuk daun stevia.
2. Mengetahui kadar steviosida yang optimum yang dihasilkan
dalam proses maserasi serbuk daun stevia dengan variasi suhu
dan volume etanol 96%.
3. Mengetahui faktor yang dominan antara suhu dan volume
etanol 96% yang berpengaruh dalam memperoleh maserat
dengan kadar steviosida yang optimal.
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Stevia
a. Keterangan botani
Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii. M.) merupakan anggota dari famili
Compositae. Stevia merupakan tanaman perenial bersemak kecil, yang dapat
tumbuh hingga ketinggian 65 cm. (Brandle dan Rosa, 1992). Tanaman Stevia
telah sukses ditanam di Jepang, Korea, Taiwan dan di negara-negara lain di dunia.
Ketika tanaman ini tumbuh maksimal maka tingginya mencapai 80 cm (Nabors,
1986).
Stevia ditemukan oleh orang Eropa Dr. M.S. Bertoni pada tahun 1898 di
daerah Paraguay, selanjutnya Dr. Rebaudi mendeskripsikan dan memberi nama
pada tanaman tersebut. Terdapat lebih dari 150 spesies yang telah dikenal tetapi
hanya satu yang secara signifikan mempunyai rasa manis (Midmore D.J., and
Rank A.H., 2002).
Stevia rebaudiana Bertonii.M. merupakan spesies yang paling manis
diantara 150 spesies lain yang ada. Stevia mengandung seluruh glikosida di
daunnya berupa steviosida yang merupakan komponen yang paling banyak
terkandung yaitu 3% - 10% dari berat serbuk kering daunnya (Gardana, Simonetti,
Canzi, Zanchi, Pietta, 2003).
b. Deskripsi tanaman
Habitus: semak, semusim, tinggi 30-90 cm. Batang: bulat, berbulu,
beruas, bercabang, hijau. Daun; tunggal, berhadapan, bulat telur, ujung tumpul,
6
pangkal runcing, tepi rata, panjang 2-4 cm, lebar 1-3 cm, pertulangan meyirip,
berbulu, tangkai pendek, hijau. Bunga: majemuk, bentuk malai, di ujung dan di
ketiak daun, bentuk cawan, kelopak bentuk tabung, berbulu, berbagi lima, hijau,
tangkai benang sari dan tangkai putik pendek, kepala sari kuning, putik bentuk
silindris, putih. Buah: kotak, berambut, coklat. Biji; bentuk jarum, putih kotor.
Akar: tunggang, putih kotor (Backer dan bakhuizen van de Brink Jr., 1968).
B. Glikosida Steviol
Glikosida merupakan senyawa yang menyusun satu atau lebih gula.
Glikosida tersusun dari dua macam bagian yaitu gula yang disebut glikon dan non
gula yang disebut aglikon (Tyler, 1988). Terdapat dua kelas glikosida, yaitu C-
glikosida dimana gula yang terikat pada aglikon melalui ikatan karbon-karbon dan
O-glikosida dimana gula yang terikat pada aglikon melalui ikatan oksigen-karbon
(Trease and Evan’s, 2002).
Ekstrak stevia mengandung glikosida diterpen dalam jumlah tinggi yang
berupa glikosida steviol. Komponen glikosida steviol yang terdapat dalam
tanaman stevia antara lain: steviol, steviolbiosida, steviosida, rebaudiosida A,
rebaudiosida B, rebaudiosida C, rebaudiosida D, rebaudiosida E, rebaudiosida F,
rubusodida, dan dulcoside A. Di antara kandungan-kandungan senyawa tersebut,
steviosida dan rebaudiosida A merupakan komponen pemanis utama pada stevia
(Wallin, 2007).
Wujud dari glikosida steviol ini berupa serbuk berwarna putih atau putih
kekuningan yang mudah larut dalam air dan etanol. Tingkat kemanisan dalam air
dari glikosida steviol ini 200 sampai 300 kali kemanisan sukrosa (Wallin, 2007).
7
Menurut anonim (1995) untuk istilah mudah larut diartikan bahwa untuk
melarutkan 1 bagian zat diperlukan 1 sampai 10 bagian pelarut.
Rasa manis yang ditimbulkan karena terjadi ikatan molekul dengan
reseptor protein spesifik pada sel di lidah yaitu T1r3. T1r3 mempunyai “
kantong”, dimana molekul kecil dapat masuk dan mungkin berikatan. Ikatan yang
terjadi berhubungan dengan bentuk molekul yang sesuai dan adanya gugus fungsi
yang berinteraksi untuk menstabilkan ikatan. Rasa manis yang ditimbulkan tidak
ada hubungannya dengan metabolisme suatu molekul (Purves, 2006)
Larutan steviosida stabil dalam pH 3-9 dan pada pH tersebut serta pada
suhu 1000C stabil selama 1 jam. Selain itu apabila disimpan pada suhu 800C
selama 5 jam maka tidak akan ditemukan dekomposisi dari senyawa ini. Senyawa
ini akan terdekomposisi pada pH 10, sedangkan dalam larutan asam akan
memiliki kestabilan yang tinggi (Nabors, 1986). Berikut ini adalah rumus molekul
dari komponen glikosida steviol dalam stevia (Mantovaneli, 2004):
Glikosida Diterpen R1 R2 Tingkat Kemanisan (Sukrosa = 1)
Steviosida Glu Glu - Glu 150 – 300
Rebausida Glu Glu 100 – 120
Steviolbiosida H Glu – Glu 100 – 125
8
Rebaudiosida A Glu Glu – Glu
Glu
250 – 450
Rebaudiosida B H Glu – Glu
Glu
300 – 350
Rebaudiosida C
(Dulkosida B)
Ram Glu – Ram
Glu
50 – 120
Rebaudiosida D Glu – Glu Glu – Glu
Glu
250 – 450
Rebaudiosida E Glu – Glu Glu – Glu 150 – 300
Dulkosida A Glu Glu – Ram 50 – 120
Glu = β-D-Glukopironasil Ram = α-L-Ramnopironasil
Gambar 1. Struktur komponen glikosida steviol (Mantovaneli, 2004)
Gambar 2. Struktur Steviosida
Kalorie merupakan pengukuran energi yang dihasilkan ketika makanan
dimetabolisme. Substansi yang tidak dimetabolisme, tidak menghasilkan energy
atau non kalori (Purves, 2006).
Steviosida tidak diserap usus dan tidak dimetabolisme oleh enzim
pada saluran pencernaan karena ikatan glukosa pada steviosida adalah ikatan b-
glukosidik. Steviosida didegradasi menjadi steviol dan glukosa oleh bakteri pada
kolon manusia. Sebanyak 400 mg steviosida hanya dihasilkan 240 mg glukosa
9
pada kolon. Glukosa yang dihasilkan ini, sepertiga bagian dimetabolisme oleh
bakteri kolon, sepertiga bagian diekskresi, dan sepertiga bagian (± 80 mg) diserap
sehingga jumlah glukosa tersebut dapat diabaikan. Steviol yang dihasilkan dari
400 mg steviosida adalah sebanyak 160 mg. sekitar 90% dari bentuk steviol ini
diekskressi bersama dengan feses. Sejumlah kecil steviol diserap kolon dan
dikonjugasikan agar dapat dieksresi dalam urine (Perret, 2006).
C. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan
dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari
akan menembus dinding sel dan akan masuk ke dalam rongga sel yang
mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan
konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel, maka
larutan encer masuk ke dalam sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim,
1986).
Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau
pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya
kapang, dapat ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan pada awal penyarian
(Anonim, 1986).
Proses ekstraksi maserasi serbuk daun tanaman stevia dapat
menggunakan air panas atau alkohol. Serbuk daun stevia sebelum diekstraksi
dilakukan perlakuan dengan menggunakan pelarut non polar seperti kloroform
atau heksan yang bertujuan untuk mengurangi kandungan minyak atsiri, lipid,
10
klorofil, dan senyawa non polar lainnya (Wallin, 2007). Berdasarkan hasil
penelitian terungkap bahwa dengan peningkatan suhu dalam penyarian steviosida
menggunakan penyari etanol akan dihasilkan peningkatan kadar steviosida
(Alupului and Lavric, 2008). Selain itu juga disebutkan bahwa peningkatan
volume pelarut akan meningkatkan jumlah steviosida yang terekstrak (Alupului
and Lavric, 2008).
D. Etanol 96%
Etanol mengandung tidak kurang dari 92,3% b/b dan tidak lebih dari
93,8%b/b, setara dengan tidak kurang dari 94,9%v/v dan tidak lebih dari 96%v/v
,C2H5OH, pada suhu 15,560C. Pemerian: Cairan mudah menguap, jernih, tidak
berwarna. Bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada lidah. Mudah menguap
walaupun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 780C. Bercampur dengan air
dan praktis larut dengan semua pelarut organik (Anonim, 1995).
Etanol dapat dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena alasan-
alasan berikut, antara lain: lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam
etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol dapat
bercampur dengan air dalam segala perbandingan, panas yang diperlukan untuk
pemekatan lebih sedikit (Anonim, 1986). Penggunaan etanol sebagai cairan
penyari akan lebih baik kemampuannya dalam mengisolasi steviosida dibanding
penyari dengan air (Jaroslav Pol. dkk , 2007).
E. Sokletasi
Sokletasi merupakan salah satu metode ekstraksi. Dalam metode
sokletasi, cairan penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan pada tabung
11
dari kertas saring atau tabung yang berlubang-lubang dari gelas, baja tahan karat
atau bahan lain yang cocok. Cairan penyari akan dipanaskan hingga mendidih.
Uap penyari akan naik ke atas melalui serbuk simplisia. Uap penyari mengembun
karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun turun melalui serbuk simplisia
sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu. Cairan akan menguap
kembali berulang proses sebelumnya, uap penyari akan naik ke atas melalui
serbuk simplisia, kemudian uap penyari mengembun dan embun turun melalui
serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu. (Anonim,
1986). Kelebihan dari sokletasi adalah jumlah pelarut yang dibutuhkan sedikit,
dan penyarian terjadi dengan pelarut yang selalu baru secara terus-menerus.
Kekurangan dari sokletasi adalah membutuhkan waktu ekstraksi yang lama
(beberapa jam) sehingga dibutuhkan energi listrik yang tinggi (Voigt, 1994).
F. Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kering, kental, atau cair dibuat dengan menyari
tanaman atau hewani menurut cara yang cocok di luar pengaruh cahaya matahari
langsung. Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter, atau campuran air
dan etanol. Penyarian simplisia dengan air dapat dilakukan dengan cara maserasi,
perkolasi, atau peyeduhan dengan air mendidih.(Anonim, 1979).
G. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis merupakan metode pemisahan komponen-
komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi atas fase diam di bawah
gerakan pelarut atau pelarut pengembang yang berupa campuran. Pemilihan
pelarut pengembangan atau pelarut pengembangan yang berupa campuran sangat
12
dipengaruhi oleh macam dan polaritas zat-zat kimia yang dipisahkan. Fase diam
yang umum dan banyak dipakai adalah silika gel, sedangkan jenis yang lain dapat
dipakai alumina, kieselguhr, celite, serbuk sellulosa, serbuk poliamida, kanji, dan
sephadex. Penyangga untuk fase diam dapat berupa plastik, logam, ataupun kaca.
(Mulja, 1995).
Lempeng KLT biasanya dilapisi adsorbent dengan indikator fluorescens
(F254) sehingga senyawa alam yang mengabsorbsi sinar UV dekat (254 nm) akan
menampakkan spot hitam dengan background lempeng hijau. Untuk senyawa
alam yang tidak nampak dengan deteksi UV membutuhkan reagent semprot,
seperti vanillin-asam sulfat, reagent Dragendorff, asam fosfomolibdat atau
antimony triklorida (Heinrich dkk, 2004).
Fase diam yang berupa silika gel dapat digunakan untuk memisahkan
senyawa-senyawa yang termasuk golongan asam amino, alkaloid, gula, asam
lemak, anion dan kation anorganik, dan terpenoid melalui mekanisme pemisahan
secara partisi (Stock, 1974). Baik silika gel, kieselguhr maupun alumina,
semuanya bersifat polar, dengan adanya atom O dan gugus hidroksi pada
permukaan (Gritter, 1985).
Untuk identifikasi senyawa yang dipisahkan menggunakan perbandingan
rambatan senyawa dibandingkan dengan rambatan zat pelarutnya dikenal dengan
harga Rf.
Rf = Jarak titik pusat bercak dari penotolan Jarak rambat fase gerak
13
Angka Rf berjarak antara 0,00 sampai 1,00 dan hanya dapat ditentukan
dua desimal, sedangkan hRf ialah angka Rf dikalikan faktor 100 dan
menghasilkan nilai berjarak antara 0-100 (Stahl, 1985).
H. KLT Densitometri
KLT Densitometri merupakan salah satu dari metode analisis KLT
Kuantitatif. Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan
mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada
umumnya pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan
bercak standar yang dielusi bersama-sama. Syarat-syarat untuk senyawa standar
adalah murni, inert, dan stabil (Sastrohamidjojo, 1985). Instrument modern
memungkinkan pengukuran cepat dalam berbagai keadaan serapan atau pendaran,
baik dengan cara penerusan atau pemantulan. Teknik ini memungkinkan
pengukuran panjang gelombang serapan maksimum untuk mencapai kepekaan
yang lebih besar (Munson, 1991)
Ada dua cara penetapan kadar dengan alat densitometer, pertama, setiap
kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan
dielusi bersama dalam suatu lempeng, kemudian AUC (luas daerah di bawah
kurva) sampel dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Yang kedua, dengan
membuat kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku
diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermcam-
macam konsentrasi (minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh
dicari AUCnya dengan alat densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan
14
garis lurus Y=Bx+A, dimana x adalah kadar zat yang ditotolkan dan Y adalah
AUC (Supardjan, 1987).
I. Image J
Image J merupakan suatu program berbasis Java yang berguna untuk
memproses gambar. Program ini dikembangkan pada Institusi Kesehatan
Nasional. Program ini memungkinkan pengguna untuk dapat menganalisis dan
memproses banyak gambar mulai dari bentuk 3 dimensi sel hidup hingga
memproses gambar radiologis, berbagai perbandingan data gambar sampai sistem
hematologi (Anonim, 2008). Program ini dapat diaplikasikan pada Microsoft
Windows, Mac OS, Mac OS X, Linux, dan Sharp Zaurus PDA (Jahnen, 2008).
Kromatogram pada lempeng KLT dapat dihitung intensitas bercaknya
dengan menggunakan software Image J (Zeligs and Bradlow, 2006). Menurut
Patnark (2004), dijelaskan mengenai langkah – langkah penggunaan Image J
untuk Densitometri antara lain:
1. Buat gambar dalam format JPEG, TIFF, GIF, atau BMP.
2. Bercak harus dibuat berwarna putih atau hitam (Warna gambar
dapat diatur dalam photoshop)
3. Gambar harus vertikal ( putar gambar jika diperlukan dapat
menggunakan photoshop atau Image J)
4. Buka software Image J
5. Buka file gambar yang akan diukur
6. Pilih menu analyze-calibrate-function-lalu pilih uncalibrate OD
15
7. Gunakan rectangular marquee tool untuk memilih gambar yang
pertama akan diukur, pengukuran sebaiknya tinggi kotak untuk
gambar yang dipilih lebih besar dari lebarnya.
8. Pilih menu analyze-gels-pilih first lane
9. Klik dan pindahkan pada gambar selanjutnya yang dipilih,
kemudian analyze-gels-pilih next lane
10. Kemudian pilih analyze-gels-plot lane
11. Akan dihasilkan plot lane
12. Daerah dari plot lane kemudian diukur dengan magic wand tool,
akan terukur luas daerah kurva tertutup.
J. Desain Faktorial
Desain faktorial merupakan metode rasional untuk menyimpulkan dan
mengevaluasi secara obyektif efek dari besaran yang berpengaruh terhadap
kualitas produk (Voigt, 1984).
Penelitian desain faktorial dimulai dengan menentukan faktor dan level
yang diteliti. Penelitian desain faktorial yang paling sederhana adalah penelitian
dengan dua faktor dan dua level (Amstrong, 1996).
Jumlah percobaan untuk penelitian desain faktorial dihitung dari jumlah
level yang digunakan dalam penelitian, dipangkatkan dengan jumlah faktor yang
digunakan. Jumlah percobaan untuk penelitian dengan 2 level dan 2 faktor adalah
22 = 4. Penamaan formula untuk jumlah percobaan = 4 adalah formula (1)untuk
percobaan I, formula a untuk percobaan II , formula b untuk percobaan III, dan
formula ab untuk percobaan IV (Bolton, 1990).
16
Pada desain faktorial dua level dan dua faktor diperlukan empat
percobaan (2n = 4, dengan 2 menunjukkan level dan n menunjukkan jumlah
faktor), yaitu (1) A dan B masing-masing pada level rendah, (a) A pada level
tinggi dan B pada level rendah, (b) A pada level rendah dan B pada level tinggi,
(ab) A dan B masing-masing pada level tinggi (Tabel I.) :
Tabel I. Notasi Formula Desain Faktorial Formula Faktor A Faktor B Interaksi
1 - - + A + - - B - + -
Ab + + +
Persamaan umum desain faktorial adalah sebagai berikut :
Y = b0 + b1 (A) + b2 (B) +b12 (A) (B).......................................................(1)
Berdasarkan persamaan di atas, dengan substitusi secara matematis dapat
dihitung besarnya efek masing-masing faktor, maupun efek interaksinya.
Besarnya efek dapat dicari dengan menghitung selisih antara rata-rata respon pada
level tinggi dan rata-rata respon pada level rendah. Konsep perhitungan efek
menurut Bolton (1990) sebagai berikut :
Efek faktor A = ((a-(1)+(ab-b))/2
Efek faktor B = ((b-(1)+(ab-a))/2
Efek interaksi = ((ab-b)+(a-1))/2
Menurut hasil eksperimen yang telah tersedia, efek dan antaraksi
dihitung menurut skema semu menggunakan Yate’s treatment.
17
Desain faktorial memiliki beberapa keuntungan. Metode ini memiliki
efisiensi yang maksimum untuk memperkirakan efek yang dominan dalam
menentukan respon. Keuntungan utama desain faktorial adalah bahwa metode ini
memungkinkan untuk mengidentifikasi efek masing-masing faktor, maupun efek
interaksi antar faktor. Metode ini ekonomis dapat mengurangi jumlah penelitian
jika dibandingkan dengan meneliti metode secara terpisah (Muth, 1999).
K. Landasan Teori
Tanaman stevia memiliki kandungan kimia utama yang berupa gula
steviosida atau yang disebut glikosida steviol yang berguna sebagai pemanis
alami. Steviosida sangat mudah larut dalam etanol (Wallin, 2007). Oleh karena itu
gula steviosida dapat diperoleh dengan penyarian secara maserasi menggunakan
etanol. Serbuk steviosida tidak/sedikit berbau dan memiliki tingkat kemanisan
sekitar 200-300 kali dari kemanisan sukrosa (Wallin, 2007).
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan
dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari
akan menembus dinding sel dan akan masuk ke dalam rongga sel yang
mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan
konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel, maka
larutan encer masuk ke dalam sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel .
Optimasi dalam penelitian ini pada faktor suhu maserasi dan faktor
volume etanol 96% yang digunakan sebagai cairan penyari, hal ini karena kedua
faktor tersebut merupakan faktor yang berpengaruh dan dapat dikendalikan dalam
18
proses maserasi untuk mendapatkan maserat dengan kadar steviosida yang
optimum. Hal ini juga didukung dari data menurut Pasquel A. (2008) yang
menyebutkan bahwa dengan adanya peningkatan suhu dari 16°C menjadi 45°C
akan dihasilkan peningkatan massa glikosida yang dihasilkan dari 0,1 x 103 kg
menjadi 0,15 x 103 kg. Menurut Jaroslav Pol. dkk (2007), penggunaan etanol
sebagai cairan penyari lebih baik kemampuannya dalam mengisolasi steviosida
dibandingkan dengan air. Selain itu juga disebutkan bahwa peningkatan volume
pelarut akan meningkatkan jumlah steviosida yang terekstrak (Alupului and
Lavric, 2008).
L. Hipotesis
Hipotesis yang dapat diajukan dalam penelitian ini antara lain:
1. Dengan semakin meningkatnya suhu akan semakin meningkatkan kadar
steviosida dalam ekstrak.
2. Dengan semakin meningkatnya volume etanol 96% yang digunakan
sebagai cairan penyari maka akan semakin meningkatkan kadar steviosida
dalam ekstrak.
19
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena ada
intervensi atau perlakuan terhadap fenomena yang diamati.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Klasifikasi Variabel
a. Variabel Bebas
suhu (300C dan 500C) dan volume etanol 96% (20 ml dan 50 ml)
b. Variabel Tergantung
Kadar Steviosida yang diperoleh dari pembuatan ekstrak tanaman
Stevia secara maserasi dengan adanya perbedaan suhu dan volume
etanol.
c. Variabel Pengacau Terkendali
Yang termasuk variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini
antara lain: spesies tanaman, asal tanaman, umur tanaman, dan
suhu saat defatisasi (sokhlet).
20
d. Variabel Pengacau Tak Terkendali
Yang termasuk variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini
adalah cara pemanenan.
e. Definisi Operasional
a. Maserasi adalah suatu metode penyarian dengan cara
merendam serbuk daun tanaman stevia dalam cairan penyari
selama 6 jam dengan menggunakan variasi suhu dan volume
etanol 96% dan menggunakan penyari air sebanyak 20 ml pada
setiap kondisi variasi serta dengan penggojogan setiap 15
menit.
b. Ekstrak steviosida merupakan ekstrak cair yang diperoleh dari
penyarian serbuk simplisia secara maserasi dengan adanya
variasi suhu dan volume etanol yang digunakan yang berasal
dari tanaman Stevia.
c. Sampel steviosida yang dimaksud dalam penelitian ini adalah
steviosida sebagai senyawa yang dinyatakan setara dengan
stevosida baku dari Wako Jepang 196-08131 (99,2%).
d. Faktor besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian
ini digunakan 2 faktor, yaitu suhu dan volume etanol 96%.
e. Kromatografi Lapis Tipis merupakan suatu metode Pemisahan
secara cepat dengan menggunakan penjerap (silica gel 60 F254)
yang dilapiskan secara merata pada lempeng penyangga dan
21
dielusi menggunakan fase gerak yang sesuai yaitu kloroform:
metanol: air (10:15:2 v/v).
f. Penetapan kadar steviosida dilakukan terhadap ekstrak stevia
dengan menggunakan software image J secara densitometri,
kemudian dilanjutkan dengan perhitungan desain faktorial dan
analisis Yate’s Treatment.
g. Respon adalah besaran yang akan diamati perubahan efeknya.
Dalam penelitian ini respon yang diamati adalah kadar
steviosida yang diperoleh dari proses maserasi.
h. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level
dan faktor.
C. Materi Penelitian
Bahan atau materi yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:
Simplisia berupa tanaman Stevia rebaudiana (Bert.) diambil dari B2P2TOOT
(Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional)
Tawangmangu, Baku Steviosida Wako Jepang 196-08131 (99,2%), Kloroform p.a
(Merck), Metanol p.a (Merck), Etanol 96% teknis (Brataco Chemika), n-hexan
teknis (Brataco Chemika), Aquabidest (aqua bidestilata steril) pro injection 500ml
(PT. Ikapharmindo Putramas), Kalium Iodida (MKRChemical’s), Iodium Crystal
(MKRChemical’s), Vanilin asam sulfat, Kieselgel 60 F254 (Merck), Aquadest
Produksi USD, Kertas saring.
22
D. Instrumen Penelitian
Alat atau Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:
Oven (Memmert), Labu Ukur (10 ml,25 ml,50 ml, 100 ml,500 ml,1 lt) (Pyrex-
Fortuna), Mikropipet IntraEND, Oven untuk suhu penyimpanan serbuk hasil
soklet Termak’s, Manttell Heater (Toshniwal), Hotplate Magnetic Stirer (Cenco
Instrumen.b.v), Alat Soxhlet (Quickfit) (1 set), Waterbath (Emerson), Waterbath
(Boom.B.V. Meppel), Pipa kapiler 1 µl (Einmal- Mikropipetten), Ayakan dengan
no mesh 50, Timbangan Analitik (Metler Toledo), Alat Scanner (Canon MP 160),
Software Image J.
E. Tahap-tahap Penelitian
1. Determinasi Tanaman Stevia rebaudiana Bertonii. M.
Determinasi tanaman Stevia rebaudiana (Bert.) dilakukan dengan
mencocokan ciri-ciri tanaman Stevia dengan kunci determinasi menurut buku
Flora of Java oleh B2P2TOOT.
2. Pembuatan Ekstrak Tanaman Stevia rebaudiana Bertonii. M.
a. Pengumpulan bahan
Bahan diperoleh dari B2P2TOOT Tawangmangu.
b. Sortasi Kering
Sortasi kering dilakukan dengan cara di pisahkan dari benda-benda asing seperti
bagian tanaman yang tidak diinginkan dan juga dari pengotor lain yang masih
tertinggal.
23
c. Pengeringan
Pengeringan dilakukan dengan dengan menggunakan oven dengan suhu 40°C
selama 1 hari.
d. Pembuatan serbuk
Pembuatan serbuk dilakukan dengan menggunakan mesin penyerbuk (grinder),
serbuk yang telah jadi diayak dengan ayakan nomer mesh 50.
e. Pembuatan Ekstrak Tanaman Stevia
a. Defatisasi serbuk simplisia
Sebanyak 50 g serbuk yang telah halus yang terbungkus dalam
kertas saring, dipisahkan dari senyawa – senyawa non polar
menggunakan pelarut heksan dengan sokhlet selama 2 x 8 jam
(Martono. dkk, 2007), dengan jumlah sirkulasi sebanyak 4 sirkulasi
setiap 10 menit dengan range suhu pelarut heksan pada Labu Alas
Bulat saat perkolasi antara 550C-660C. Residu sampel kemudian
dioven pada suhu 500C untuk menguapkan heksan, kemudian
residu sampel yang telah kering siap untuk diekstraksi.
b. Ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi dengan adanya variasi
suhu dan volume Etanol 96% yang digunakan.
Residu sampel sebanyak 4 gram yang telah dipisahkan dari
senyawa non polar diekstraksi dengan menggunakan campuran air-
etanol, dengan perbandingan volume air tetap sebanyak 20 ml dan
variasi suhu dan volume etanol 96% (Tabel II.):
24
Tabel II. Variasi kondisi suhu dan volume etanol 96%. Suhu (0C) Etanol 96% (mL)
30 20 50 20 30 50 50 50
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi selama
6 jam menggunakan waterbath, dengan penggojogan setiap 15
menit, setiap penggojogan dilakukan 1 menit. Masing-masing
ekstraksi dengan variasi suhu dan jumlah volume pelarut etanol
tersebut dilakukan replikasi sebanyak 2 kali. Maserat yang didapat
kemudian diperas dengan kain. Kemudian ditambah dengan cairan
penyari yang sesuai hingga volume labu ukur yang mendekati.
Kemudian maserat didiamkan selama 30 menit untuk tujuan
pengendapan.
4. Analisis Kualitatif Ekstrak Tanaman Stevia
Maserat yang diperoleh kemudian ditotolkan pada lempeng KLT
(Kieselgel 60 F254 atau silika gel 60 F254) begitu juga dengan baku
Steviosida dan dielusi menggunakan fase gerak kloroform:metanol:air (10
: 15 : 2) (Martono. dkk, 2007). Setelah elusi selesai, lempeng disemprot
dengan larutan Iodium kemudian setelah kering dilanjutkan dengan
disemprot larutan vanilin-asam sulfat pekat. Lempeng lalu dipanaskan
pada plat panas untuk menampakkan bercak dan dihitung harga Rf untuk
masing-masing bercak. Harga Rf sampel yang diperoleh kemudian
dibandingkan dengan harga Rf baku steviosida. Lempeng KLT sebelum
digunakan dioven terlebih dahulu pada suhu 1000C selama 1-3 jam.
25
5. Analisis Kuantitatif Ekstrak Tanaman Stevia
a. Pembuatan kurva baku dan Analisis Sampel
Larutan induk standar steviosida (2 mg/ml) ditotolkan pada lempeng Silika
gel 60 F254 dengan Mikrokapiler dengan deret jumlah totolan masing-
masing 2µl, 3µL, 4µL, 5µL, 6µL, dan 7µL dimana masing-masing totolan
tersebut mengandung seri jumlah baku Steviosida sebanyak 4µg, 6µg,
8µg, 10µg, 12µg, dan 14µg. Pada lempeng yang sama ditotolkan pula
maserat sampel dari masing-masing kondisi dan replikasi. Kemudian
lempeng dielusi dengan fase gerak kloroform:metanol: air (10:15:2).
Setelah elusi selesai, lempeng disemprot dengan larutan Iodium kemudian
setelah kering dilanjutkan dengan disemprot larutan vanilin-asam sulfat
pekat. Lempeng lalu dipanaskan pada plat panas untuk menampakkan
bercak. Bercak yang diperoleh dianalisis secara densitometri dengan
menggunakan software Image J dengan menghitung luas bercak yang
muncul. Dari luas bercak yang diperoleh (sebagai nilai Y) dan jumlah seri
baku steviosida (sebagai nilai x) kemudian dibuat persamaan kurva baku.
Dan nilai AUC dari bercak sampel dimasukan sebagai nilai Y dalam
persamaan kurva baku yang diperoleh sebelumnya untuk mendapatkan
jumlah steviosida (µg) dalam maserat. Dari jumlah steviosida (µg) yang
diperoleh kemudian dapat dicari kadar steviosida (%b/b) yang terdapat
dalam sampel.
26
b. Analisis Hasil
Kadar steviosida (%b/b) dalam sampel dari setiap kondisi dan setiap
replikasi yang didapat kemudian dianalisis dengan menggunakan aplikasi
Desain faktorial untuk melihat pengaruh suhu dan volume etanol 96%
manakah yang paling dominan dalam menghasilkan ekstrak dengan kadar
steviosida (%b/b) yang optimum. Pendekatan Factorial Design yang
digunakan untuk menghitung koefisien a, b, ab sehingga didapatkan
persamaan Y = b0 + b1(XA) + b2(XB) + b12(XA)(XB). Dari persamaan ini
kemudian dapat dibuat suatu profil yang menggambarkan profil kadar
steviosida (%b/b) dari maserat tanaman stevia dengan adanya perbedaan
kondisi perlakuan antara suhu dan volume etanol 96% yang digunakan.
Hasil profil yang diperoleh berdasarkan rumus digunakan untuk
menentukan kombinasi antara suhu dan volume etanol 96% manakah yang
optimal akan menghasilkan kadar Steviosida (%b/b) yang paling optimum.
Setelah dianalisis dengan metode desain faktorial, dilakukan analisis
menggunakan metode Yate’s Treatment untuk mengetahui perbedaan dari
setiap faktor dan interaksi dalam mempengaruhi respon. Berdasarkan
analisis statistik ini maka dapat ditentukan ada tidaknya hubungan dari
setiap faktor dan interaksi terhadap respon . Hal ini dapat dilihat dari harga
F hitung dan F tabel. Sebelumnya ditentukan hipotesis terlebih dahulu,
hipotesis alternatif (Hi) menyatakan adanya regresi atau hubungan antara
faktor dengan respon, sedangkan Ho merupakan negasi dari Hi yang
menyatakan tidak adanya regresi (hubungan antara faktor dan respon). Hi
27
diterima dan Ho ditolak apabila harga F hitung lebih besar dari F tabel,
yang berarti faktor berpengaruh terhadap respon. F tabel diperoleh dari Fa
(numerator, denominator) dengan taraf kepercayaan 95%.
28
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman Stevia
Determinasi tanaman dilakukan untuk mendapatkan kepastian kebenaran
tanaman yang diselidiki sesuai dengan yang dimaksud dalam penelitian.
Determinasi dilakukan oleh B2P2TOOT (Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Tawangmangu) dengan
mencocokkan ciri-ciri yang ada pada tanaman dengan kunci determinasi yang ada
dalam buku acuan menurut Backer (1968). Hasil determinasi menunjukkan bahwa
tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Stevia rebaudiana
Bertonii.M. (Lampiran 12.).
B. Pemilihan Simplisia dan Pembuatan Serbuk
Stevia yang digunakan sebagai bahan penelitian ini diambil pada bulan
juli dari hasil panen para petani di daerah Tawangmangu yang telah diserahkan
pada Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat
Tradisional Tawangmangu yang berperan sebagai pengumpul hasil panen. Alasan
pemilihan sampel di daerah tersebut adalah karena stevia yang dihasilkan
merupakan tanaman hasil budidaya sehingga faktor-faktor seperti umur, asal, dan
tingkat kematangan stevia dapat dikendalikan. Stevia yang digunakan adalah
stevia hasil panen setelah berumur ± 2 bulan. Sampel stevia yang diperoleh
berupa simplisia kering, yang kemudian dilakukan sortasi kering terhadap sampel
tersebut, adapun tujuan dari sortasi kering ini adalah untuk memisahkan benda-
29
benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotor-
pengotor lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering.
Selanjutnya dilakukan pengeringan kembali menggunakan oven dengan
suhu 400C selama 1 hari yang bertujuan untuk mendapatkan simplisia yang tidak
mudah rusak sehingga dapat disimpan dalam jangka waktu yang lebih lama
(Anonim, 1985).
Simplisia yang telah dioven kemudian diserbuk dengan menggunakan
grinder. Penyerbukan akan memperbesar luas permukaan spesifik sehingga
kontak antara cairan penyari dengan serbuk juga akan bertambah. Pada umumnya,
penyarian akan semakin baik jika permukaan serbuk simplisia yang kontak
dengan cairan penyari semakin luas (Anonim, 1986), sehingga semakin halus
serbuk simplisia maka penyarian akan semakin baik. Serbuk yang diperoleh
kemudian diayak dengan menggunakan ayakan dengan nomer mesh 50. Menurut
Matsushita (1979), range ukuran mesh penyerbukan daun Stevia rebaudiana
Bertonii. M. antara 50-400.
Tujuan pengayakan adalah agar diperoleh partikel-partikel serbuk
dengan distribusi ukuran yang kurang lebih mendekati seragam. Menurut
penelitian Alupului dan Lavric (2008), diketahui bahwa dengan diameter ukuran
serbuk sebesar 0,315 mm dapat menghasilkan kadar steviosida yang lebih tinggi
dibandingkan dengan diameter ukuran serbuk sebesar 2 mm dan 6,3 mm. Dari
hasil perhitungan, diameter ukuran serbuk sebesar 0,315 mm dapat dicapai dengan
pengayak mesh 50.
30
Serbuk yang telah diayak kemudian dilakukan proses defatisasi dengan
metode sokletasi. Proses defatisasi ini bertujuan untuk mengurangi senyawa-
senyawa yang bersifat non polar yang dapat mengganggu proses ekstraksi, karena
secara teori etanol dapat melarutkan senyawa non polar (Anonim, 1986). Adapun
senyawa non polar yang terkandung dalam tanaman stevia dapat berupa: minyak
atsiri, asam dekanoat, pentacosane, octacosane, stigmasterol, lupeol, dan
pentacyclic triterpene (Wallin, 2007). Serbuk setelah didefatisasi jumlah senyawa
non polarnya akan berkurang dan serbuk inilah yang kemudian akan diekstraksi
untuk mendapatkan maserat steviosida.
Proses defatisasi serbuk stevia menggunakan pelarut heksan karena
heksan merupakan pelarut organik yang bersifat sangat non polar (Cannel, 1998),
sehingga proses penarikan senyawa non polar pada serbuk stevia dapat optimal.
Alat yang digunakan dalam defatisasi ini adalah sokhlet yang dapat menyari
secara berkesinambungan. Metode sokhletasi merupakan proses ekstraksi
menggunakan pelarut yang selalu baru sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan
jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
Sebanyak 50 gram serbuk dibungkus didalam kertas saring berbentuk
kantung, kemudian di soklet menggunakan cairan penyari heksan selama 2x8 jam
(Martono dkk., 2007), dimana setiap 8 jam, dilakukan pergantian penyari yang
digunakan. Pergantian penyari bertujuan untuk mencegah terjadinya kejenuhan
dalam cairan penyari dalam mengekstrak senyawa-senyawa yang bersifat non
polar. Sedangkan waktu 2x8 jam diperoleh berdasarkan hasil orientasi yang
dilakukan pada penelitian sebelumnya (Martono dkk., 2007), dimana dengan
31
waktu tersebut sudah cukup untuk mengurangi sebagian besar senyawa non polar
yang terkandung dalam tanaman.
Dalam proses sokletasi ini digunakan volume pelarut heksan sebanyak 2
kali sirkulasi, hal ini bertujuan untuk mencegah habisnya pelarut dalam Labu Alas
Bulat sehingga LAB tersebut ketika terus dipanaskan tidak pecah dan juga agar
proses ekstraksi dapat berjalan terus tanpa adanya penambahan pelarut lagi.
Sokletasi merupakan salah satu metode penyarian dengan menggunakan
panas, maka faktor suhu hendaknya perlu diperhatikan. Hal ini karena steviosida
yang terkandung dalam serbuk dapat dengan mudah terdekomposisi pada suhu
yang tinggi (±1000C, hanya stabil selama 1 jam, dan pada suhu 80°C stabil selama
5 jam) (Nabors, 1986). Dalam penelitian suhu pelarut heksan yang dipanaskan
pada Labu Alas Bulat saat soklet diatur pada rentang suhu antara 550C-660C
sehingga steviosida yang terkandung dalam serbuk simplisia tidak
terdekomposisi. Hal ini karena ketika suhu pelarut heksan yang dipanaskan pada
LAB berkisar pada range 550C-660C, maka suhu pada tabung soklet dimana
terdapat serbuk daun stevia akan berada dibawah range suhu tersebut.
Setelah proses defatisasi selesai, kemudian dikeringkan dengan oven
pada suhu 500C untuk menguapkan semua sisa pelarut heksan agar diperoleh
serbuk kering. Heksan yang masih tersisa dalam serbuk dapat mengganggu proses
penyarian selanjutnya sehingga perlu dilakukan penguapan heksan terlebih
dahulu.
32
C. Pembuatan Ekstrak Stevia Secara Maserasi
Metode maserasi yang digunakan adalah metode maserasi sederhana
selama 6 jam terhadap 4 gram serbuk dengan cairan penyari menggunakan
campuran air dan etanol. Air yang digunakan dengan volume sama untuk setiap
kondisi yaitu sebanyak 20 ml. Tujuan penggunaan volume air dalam jumlah kecil
karena air dapat berperan sebagai media untuk pertumbuhan mikroorganisme
(Anonim, 1986), sehingga untuk meminimalisir hal tersebut maka digunakan air
dalam jumlah sedikit. Penggunaan cairan penyari dalam penelitian ini berupa
campuran air dan etanol, karena campuran tersebut bersifat polar yang sesuai
dengan zat aktif steviosida yang juga bersifat polar, campuran tersebut juga umum
digunakan dalam ekstraksi.
Adapun penggunaan waktu maserasi selama 6 jam karena pada waktu
tersebut sudah cukup optimal untuk mengekstraksi steviosida yang terkandung
dalam tanaman Stevia rebaudiana Bertonii. M., hal ini karena dalam penyarian
secara maserasi dalam penelitian ini dilakukan dengan modifikasi pemanasan
yaitu pada suhu 300C dan 500C serta adanya penggojogan, itu semua akan
membantu mempercepat proses penyarian steviosida. Menurut Masushita (1979)
disebutkan bahwa penyarian dengan menggunakan pemanasan dapat dilakukan 1
sampai 2 jam atau lebih.
Adanya pemanasan saat ekstraksi maka akan menurunkan kekentalan
dari pelarut sehingga mengakibatkan berkurangnya lapisan-lapisan batas.
Pemanasan juga akan meningkatkan daya melarutkan cairan penyari sehingga
33
pemanasan tersebut mempunyai pengaruh yang sama dengan pengadukan.
Koefisien difusi juga berbanding lurus dengan suhu absolut dan berbanding
terbalik dengan kekentalan, hingga kenaikan suhu akan berpengaruh pada
kecepatan difusi. Umumnya kelarutan zat aktif akan meningkat bila suhu dinaikan
(Anonim, 1986).
Proses maserasi dilakukan terhadap 4 gram serbuk dengan 4 macam
variasi kondisi yaitu suhu dan volume etanol 96% yang digunakan. Setiap kondisi
dilakukan replikasi sebanyak 2 kali. Variasi kondisi suhu dan volume etanol yang
digunakan seperti yang tertera dalam cara kerja.
Pemilihan variasi suhu saat ekstraksi yaitu 300C dan 500C bertujuan
untuk melihat pengaruhnya dalam level tinggi dan level rendah pada proses
ekstraksi steviosida yang diperlukan untuk analisis desain faktorial untuk
mendapatkan daerah optimun kondisi maserasi agar dapat menghasilkan ekstrak
dengan kadar steviosida yang optimum. Pemilihan suhu 500C dikarenakan pada
maserasi dalam penelitian ini dilakukan modifikasi maserasi yaitu secara digesti
yang merupakan metode maserasi dengan pemanasan pada range suhu 400C-500C,
dari situ maka dipilih suhu 500C sebagai level tinggi. Sedangkan pemilihan suhu
yaitu 300C adalah karena suhu tersebut dapat diasumsikan sebagai suhu kamar
dimana untuk proses maserasi secara konvensional umumnya menggunakan suhu
kamar, dan dengan pemilihan suhu 300C maka akan memudahkan dalam
pengontrolannya.
34
Sedangkan pemilihan variasi jumlah volume etanol yaitu 20 ml dan 50
ml begitu juga dengan variasi suhu, bertujuan untuk melihat pengaruhnya dalam
level tinggi dan level rendah pada proses ekstraksi steviosida yang diperlukan
untuk analisis desain faktorial untuk mendapatkan daerah optimun kadar
steviosida pada proses maserasi dengan variasi suhu dan volume etanol 96%.
Selain itu dengan 20 ml etanol 96% dan adanya air 20 ml sudah cukup membuat
serbuk terendam, hal ini sesuai dengan prinsip maserasi yang berupa perendaman
serbuk dalam cairan penyari (Anonim, 1986). Sedangkan pemilihan level tinggi
sebesar 50 ml diharapkan bahwa dengan peningkatan volume etanol 96%
sebanyak 2,5 kali dari volume etanol yang ditentukan sebelumnya dapat menyari
semua steviosida yang terkandung dalam tanaman stevia.
Metode maserasi dilakukan dengan bantuan alat waterbath dengan
pengaturan suhu, dan dilakukan penggojogan setiap 15 menit, dimana setiap
penggojogan dilakukan selama 1 menit. Pada metode maserasi ini serbuk
simplisia terendam dalam cairan penyari. Perendaman ini akan memudahkan
cairan penyari untuk menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang
mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan
konsentrasi antara zat aktif di dalam sel dan di luar sel maka larutan yang terpekat
terdesak keluar. Peristiwa ini berulang hingga terjadi keseimbangan konsentrasi
antara larutan didalam dan diluar sel. Selain perendaman dilakukan juga proses
penggojogan, tujuannya adalah untuk meratakan distribusi larutan diluar butir
serbuk simplisia, sehingga konsentrasinya akan tetap terjaga karena adanya
derajat perbedaan konsentrasi sebesar-besarnya antara larutan didalam sel dan
35
larutan diluar sel (Anonim, 1986). Setelah 6 jam maserasi dilakukan proses
pemerasan untuk memperoleh maserat cair. Kemudian ditambahkan dengan
cairan penyari yang sesuai sampai batas labu ukur yang mendekati. Maserat cair
tersebut kemudian dibiarkan selama beberapa waktu tertentu (±30 menit). Waktu
tersebut diperlukan untuk mengendapkan zat-zat yang tidak diperlukan tetapi ikut
terdispersi dalam cairan penyari.
D. Analisis Kualitatif Bercak Maserat Tanaman Stevia
Maserat cair tanpa endapan yang diperoleh kemudian dianalisis secara
kualitatif bercak dengan menggunakan metode KLT melalui perbandingan nilai
Rf yang dihasilkan antara bercak sampel dan baku. Tujuan dilakukan KLT adalah
untuk mengetahui dan memastikan bahwa ekstrak yang diperoleh mengandung
steviosida. Cara penghitungan Rf adalah dengan membandingkan jarak titik pusat
bercak dari titik awal penotolan bercak dengan jarak rambat/elusi fase gerak,
Penelitian dilakukan dengan menotolkan ekstrak hasil maserasi dan baku
steviosida pada lempeng Silika gel 60 F254 dengan penyangga logam.
Penggunaan lempeng tersebut karena lempeng tersebut dapat memisahkan
senyawa yang termasuk golongan terpen, gula (Stock, 1974). Pada penelitian
digunakan penyangga logam dengan tujuan agar lempeng KLT tersebut tahan
terhadap pemanasan pada plat panas untuk langkah pendeteksian bercak.
Sebelum digunakan lempeng KLT tersebut harus di oven terlebih
dahulu selama ± 1-3 jam pada suhu 1000C, hal ini bertujuan untuk mengaktifkan
penjerap pada lempeng KLT. Dilakukan pengaktifan menggunakan oven hal ini
36
karena dalam penjerap normal yang tidak diaktifkan, maka pada permukaan
lempeng penjerap diduduki oleh molekul air yang sangat polar dan membentuk
ikatan hidrogen. Molekul air tersebut harus dihilangkan dengan pemanasan agar
tidak mengganggu dalam pengelusian bercak, biasanya pengaktifan dilakukan
pada suhu 100-1100C paling sedikit 1 jam (Gritter, 1985).
Lempeng KLT kemudian dimasukkan dalam bejana yang telah jenuh
dengan fase gerak yaitu kloroform : metanol : Air (10 :15: 2 v/v) kemudian
dikembangkan hingga mencapai batas jarak elusi yang telah ditentukan yaitu
sebesar 15cm. Dengan jarak elusi tersebut maka zat steviosida yang terkandung
dalam sampel sudah dapat terpisah dan dapat dielusi. Penggunaan perbandingan
fase gerak tersebut karena sifat fase gerak yang polar yang sesuai dengan sifat
steviosida yang diteliti, sehingga dengan sistem tersebut sampel dapat terelusi.
Fase gerak yang digunakan harus mempunyai kepolaran yang relatif sama dengan
senyawa yang akan dipisahkan, tetapi memiliki sifat yang tidak saling campur
dengan fase diam (Sastrohamidjojo, 1991).
Kemudian untuk pendeteksian bercak sampel maupun baku pada
lempeng dilakukan terhadap (a) disemprot dengan larutan Iodium yang
mengasilkan bercak berwarna kuning kecokelatan (b) disemprot dengan vanilin
asam sulfat (c) dan dilakukan pemanasan pada lempeng hingga bercak muncul.
Bercak yang dihasilkan akhirnya berwarna hitam, hal ini karena steviosida yang
terkandung dalam bercak mengalami pengarangan dengan adanya pereaksi
semprot dan juga dengan adanya pemanasan. Dengan pereaksi semprot iodium,
maka akan dihasilkan bercak berwarna cokelat yang menunjukan bahwa pada
37
senyawa organik mengandung atom O (Gritter, 1985). Warna bercak cokelat lama
kelamaan akan menghilang karena iodium menyublim (Gritter, 1985). Sedangkan
untuk pereaksi semprot vanilin asam sulfat yang dilanjutkan dengan pemanasan
akan menghasilkan bercak berwarna hitam, yang menandakan terjadinya
pengarangan menjadi karbon pada senyawa organik yang diuji (Gritter, 1985).
Selain itu penggunaan pereaksi semprot vanilin asam sulfat juga dapat digunakan
untuk mendeteksi senyawa spesifik berupa golongan diterpen (Wagner, 1984).
Bercak yang dihasilkan antara sampel dan baku kemudian dibandingkan
harga Rf nya. Dalam penelitian dihasilkan rata-rata harga Rf antara sampel dan
baku yang mendekati (Tabel III), maka dapat dipastikan bahwa dalam sampel
terkandung steviosida.
Tabel III. Rf Sampel dan Baku Steviosida Sampel Baku
Nomor Suhu (°C) Etanol (ml) Rf Nomor Rf
A 30 20 0,76 I 0,80 B 30 20 0,76 J 0,76 C 50 20 0,79 K 0,78 D 50 20 0,79 L 0,78 E 30 50 0,78 M 0,78 F 30 50 0,80 N 0,77 G 50 50 0,79 O 0,76 H 50 50 0,80
Rata-rata 0,78 Rata-rata± SD 0,77±0,01
38
Gambar 3. Kromatogram KLT sampel dan baku untuk perhitungan Rf Keterangan Gambar:
A = sampel (30°C-20ml), replikasi 1
B = sampel (30°C-20ml), replikasi 2
C = sampel (50°C-20ml), replikasi 1
D = sampel (50°C-20ml), replikasi 2
E = sampel (30°C-50ml), replikasi 1
F = sampel (30°C-50ml), replikasi 2
G = sampel (50°C-50ml), replikasi 1
H = sampel (50°C-50ml), replikasi 2
I = Baku Steviosida (14µg)
J = Baku Steviosida (12µg)
K = Baku Steviosida (10µg)
L = Baku Steviosida (8µg)
M = Baku Steviosida (6µg)
N = Baku Steviosida (4µg)
O = Baku Steviosida (2µg)
Keterangan KLT:
Fase diam : Silika Gel 60 F254
Fase Gerak : Kloroform : methanol : air
(10:15:2)
Jarak elusi : 15 cm
Deteksi :
a. Reagen semprot Iodium
b. Reagen semprot Vanilin-asam sulfat
c. Pemanasan pada plat panas
A B C D E F G H I J K L M N O
39
E. Analisis Kuantitatif Steviosida dalam Ekstrak Tanaman Stevia
1. Pembuatan Kurva Baku
Kurva baku steviosida dibuat dengan cara menotolkan suatu deret kadar
steviosida baku (dalam µg) melalui deret jumlah totolan pada plat Silika gel 60
F254 dan dikembangkan dalam fase gerak kloroform : metanol : air (10:15:2v/v).
Kadar larutan induk dari baku steviosida yang digunakan sebesar 2,028 mg/ml.
Dari larutan induk tersebut dibuat seri kurva baku dengan menggunakan deret
jumlah totolan (Gritter, 1985), sehingga didapatkan seri baku sebesar 4,056 µg;
6,084 µg; 8,112 µg; 10,14 µg; 12,168 µg; dan 14,196 µg. Selanjutnya, dilakukan
langkah-langkah pendeteksian bercak seperti pada analisis kualitatif sebelumnya.
Kemudian plat yang telah terdapat bercak baik dari sampel maupun baku discan,
kemudian dianalisis secara densitometri dengan menggunakan Software Image J
melalui perhitungan luas bercak yang tergambar dalam luas bercak dibawah kurva
(AUC). Adapun langkah-langkah Image J secara umum dimulai dengan membuat
tampilan kromatogram baik sampel dan baku sebagai bercak yang jelas dan
memisah sehingga akan didapatkan tepi bercak yang lebih tegas (lampiran 10a).
Latar belakang dari kromatogram dibersihkan sehingga yang didapat hanyalah
kromatogram baik dari sampel maupun baku (lampiran 10b). Kemudian masing-
masing kromatogram yang diperoleh disamakan intensitas warnanya dengan
fasilitas binary (hasil pada lampiran 10b), kemudian dihitung luasnya dengan
membuat plot kurva dari setiap kromatogram. Plot kurva yang dihasilkan
kemudian diukur luasnya (sebagai nilai AUC atau sebagai nilai luas area dibawah
kurva). Pengukuran luas hanya dapat dilakukan pada plot kurva tertutup.
40
Gambar 4. Tampilan bercak baku dan sampel setelah di Image J
Keterangan Gambar:
A = sampel (30°C-20ml), replikasi 1
B = sampel (30°C-20ml), replikasi 2
C = sampel (50°C-20ml), replikasi 1
D = sampel (50°C-20ml), replikasi 2
E = sampel (30°C-50ml), replikasi 1
F = sampel (30°C-20ml), replikasi 2
G = sampel (50°C-50ml), replikasi 1
H = sampel (50°C-50ml), replikasi 2
I = Baku Steviosida (14µg)
J = Baku Steviosida (12µg)
K = Baku Steviosida (10µg)
L = Baku Steviosida (8µg
M = Baku Steviosida (6µg)
N = Baku Steviosida (4µg)
O = Baku Steviosida (2µg)
Keterangan KLT:
Fase diam : Silika Gel 60 F254
Fase Gerak : Kloroform : methanol : air
(10:15:2)
Jarak elusi : 15 cm
Deteksi :
d. Reagen semprot Iodium
e. Reagen semprot Vanilin-asam sulfat
f. Pemanasan pada plat panas
A B C D E F G H I J K L M N O
41
Tabel IV. Hubungan Jumlah Steviosida (µg) dengan AUC pada Seri Baku
Persamaan Kurva Baku A= -5,7459 B= 3,6796 r = 0,9911
Y= 3,6796 x-5,7459
Gambar 5. Grafik Kurva Baku Steviosida
Dari persamaan tersebut diperoleh nilai koefisien korelasi (rhitung) yang
lebih besar dari harga rtabel. Harga rtabel dengan taraf kepercayaan 95%, df=4
adalah 0,811. Karena nilai r hitung > nilai r tabel, maka menunjukan bahwa ada
hubungan yang linear antara jumlah steviosida (µg) dan AUC yang dihasilkan.
Jumlah Totolan
AUC Jumlah (µg)
2 11,188 4,056 3 15,927 6,084 4 23,61 8,112 5 28,539 10,14 6 39,371 12,168 7 48,372 14,196
42
2. Penetapan Kadar sampel
Pada sampel ekstrak cair dilakukan analisis kuantitatif dengan metode
yang sama dengan baku Steviosida yaitu dengan menggunakan metode
Kromatografi Lapis Tipis dengan sistem KLT yang sama, sehingga antara totolan
sampel dari masing-masing kondisi dan setiap replikasi dan juga totolan seri baku
dibuat pada 1 lempeng KLT yang sama. Hal ini bertujuan agar saat dianalisis
dengan software Image J antara sampel dan seri baku mendapat perlakuan yang
sama, sehingga akan mengurangi variabilitas dalam pengukuran. Setelah
didapatkan AUC sampel, maka untuk menentukan kadar sampel dilakukan dengan
memasukan nilai AUC sampel sebagai nilai Y ke dalam persamaan kurva baku
yang telah diperoleh sebelumnya, yaitu Y= 3,6796x-5,7459. Sehingga akan
didapatkan kadar steviosida dalam sampel.
Tabel V. Kadar Steviosida dalam ekstrak yang dibuat dari masing-masing kondisi dan replikasi
Kondisi Replikasi
Kadar steviosida dalam sampel(mg/4gram serbuk)
Kadar steviosida dalam sampel (gram/4gram serbuk)
Kadar steviosida dalam sampel (gram/100 gram serbuk) (%b/b)
Rata-rata (%b/b)
30°C-20ml 1 106,5917491 0,1066 2,6648
2,7575 ± 0,1311
30°C-20ml 2 114,0110338 0,1140 2,8503
50°C-20ml 1 120,4338334 0,1204 3,0108
2,8198 ± 0,2701
50°C-20ml 2 105,1468457 0,1051 2,6287
30°C-50ml 1 257,0379027 0,2570 6,4259
6,2469 ± 0,2531
30°C-50ml 2 242,7156937 0,2427 6,0679
50°C-50ml 1 344,9369497 0,3449 8,6234
7,9355 ± 0,9728
50°C-50ml 2 289,9037939 0,2899 7,2476
43
Pada kondisi volume etanol 96% 50 ml (level tinggi) dan suhu 500C (level
tinggi) dihasilkan rata-rata kadar steviosida yang paling besar, yaitu sebesar
7,9355 %b/b (Tabel V). Sedangkan pada kondisi lainnya dihasilkan kadar
steviosida yang lebih rendah. Hal ini dikarenakan sifat steviosida yang mudah
larut dalam etanol (Wallin, 2007). Etanol 96% yang menghasilkan kadar
steviosida paling besar adalah dengan volume paling tinggi (50 ml),hal ini dapat
disebabkan karena pada jumlah pelarut yang besar membuat proses penyarian
menjadi lebih efektif. Proses penyarian terkait dengan penembusan cairan penyari
melewati dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel (Anonim, 1986). Peristiwa
ini akan berlangsung terus-menerus sepanjang proses penyarian sehingga jumlah
cairan penyari yang digunakan akan mempengaruhi keberlangsungan proses
penyarian. Jumlah cairan penyari yang besar dapat mencegah terjadinya
kejenuhan sehingga senyawa yang dapat terekstrak akan menjadi semakin besar,
hal ini karena dengan jumlah penyari yang besar dapat menyediakan perbedaan
konsentrasi yang sebesar-besarnya antara larutan zat aktif di dalam sel dengan
yang diluar sel sehingga proses penyarian akan tetap berlangsung sampai terjadi
keseimbangan konsentrasi.
Selain itu juga dengan adanya suhu yang tinggi (500C) maka akan
meningkatkan energi kinetik selama penyarian, sehingga akan meningkatkan
efektivitas penyarian sehingga membuat kadar steviosida yang tersari meningkat.
44
3. Analisis Kuantitatif Sampel Dengan Aplikasi Desain faktorial
Data kuantitatif yang diperoleh berupa kadar rata-rata sampel dari setiap
kondisi kemudian dianalisis menggunakan metode Desain faktorial.
Tabel VI. Kondisi desain faktorial dan respon yang dihasilkan Kondisi Suhu (0C) Volume Etanol Rata-rata
kadar sampel (%b/b)
(1) 30 20ml 2,7575 ± 0,1311 a 50 20ml 2,8198 ± 0,2701 b 30 50ml 6,2469 ± 0,2531 ab 50 50ml 7,9355 ± 0,9728
Dari analisis tersebut akan diperoleh suatu persamaan desain faktorial
yaitu y = 1,9662 -0,0511A + 0,0349 B +0,00271AB. Dari analisis dengan
menggunakan desain faktorial dapat dilihat bahwa faktor B yaitu etanol 96%
memberikan pengaruh yang paling besar. Hal ini ditunjukkan pada nilai efek
faktor B bernilai positif dan nilainya paling besar bila dibandingkan nilai efek
faktor A (suhu) dan faktor AB (interaksi). Hal tersebut dapat dilihat dari tabel
dibawah ini (Tabel IX)yang menunjukan nilai efek dari masing-masing faktor.
Tabel VII. Nilai efek dari faktor suhu, etanol 96%, dan interaksinya Efek Respon
Suhu 1,7509
Volume etanol 96% 8,6051
Interaksinya 1,6263
Hal ini berarti etanol 96% yang berperan sebagai cairan penyari
memberikan efek paling besar dalam melarutkan steviosida yang terkandung
dalam sampel, hal ini dikarenakan sifat steviosida yang mudah larut dalam etanol
45
(Wallin, 2007). Dan dengan penggunaan etanol maka lebih baik kemampuannya
dalam mengisolasi steviosida dibanding dengan air (Jaroslav Pol. dkk, 2007).
Gambar 6a Gambar 6b
Gambar 6. Grafik hubungan suhu maserasi (a) dan volume Etanol 96%(b) terhadap kadar Steviosida
Dari grafik hubungan antara suhu maserasi dan kadar steviosida diatas
(Gambar 6), maka didapatkan bahwa dengan semakin meningkatnya suhu pada
volume etanol 96% level rendah akan terjadi peningkatan kadar steviosida. Begitu
pula dengan semakin meningkatnya suhu pada volume etanol 96% level tinggi
akan terjadi peningkatan kadar steviosida. Sedangkan dari grafik hubungan antara
volume etanol dan kadar steviosida maka didapatkan bahwa dengan semakin
meningkatnya jumlah volume etanol 96% pada suhu maserasi level rendah akan
terjadi peningkatan kadar steviosida. Begitu pula dengan semakin meningkatnya
jumlah volume etanol 96% pada suhu maserasi level tinggi akan terjadi
peningkatan kadar steviosida. Pada grafik suhu maserasi dan kadar Steviosida
(Gambar. 6a) dan grafik volume Etanol 96% dan Kadar Steviosida (Gambar. 6b)
garis yang terbentuk tidak sejajar yang berarti terjadi interaksi antara suhu
46
maserasi dan volume etanol 96%, namun hal ini masih harus dibuktikan dengan
perhitungan Yate’s treatment. Dari persamaan desain faktorial yang diperoleh
kemudian dibuat grafik Contour Plot. Dari grafik Contour plot yang didapat
kemudian dibuat daerah optimumnya. Daerah optimum tersebut mencerminkan
kondisi optimum baik dari faktor suhu maupun faktor jumlah volume etanol 96%
untuk mendapatkan ekstrak yang mengandung kadar steviosida yang optimal.
Gambar 7. Grafik Contour Plot Daerah Optimum hubungan antara suhu dan volume etanol 96%
Dari gambar tersebut (Gambar. 7) dapat dilihat bahwa rentang kadar
steviosida optimum yang dapat diperoleh yaitu 3%b/b –7,935%b/b. Rentang
kadar ini masuk dalam rentang kadar yang steviosida yang secara teoritis terdapat
dalam tanaman Stevia rebaudiana Bertoni. M. yaitu sebesar 3%-10% dari berat
kering daunnya (Gardana, Simonetti, Canzi, Zanchi, Pietta, 2003).
47
4. Analisis Yate’s Treatment
Perhitungan harga F yang diperoleh dari Yate’s treatment (Tabel VIII)
untuk respon kadar steviosida dalam sampel memperlihatkan bahwa volume
etanol 96% memberikan pengaruh yang bermakna secara statistik dalam hal
meningkatkan kadar steviosida. Hi (Hipotesis alternatif) diterima jika harga F
hitung lebih besar dari F tabel. Harga F hitung volume etanol 96% lebih besar dari
F tabel (1,3) yaitu 10,128, oleh karena itu Hi2 statistik (lampiran 6) diterima
sehingga terbukti bahwa faktor volume etanol 96% memberikan perbedaan respon
kadar steviosida yang dihasilkan (tabel VIII). Artinya, perbedaan volume etanol
96% yang digunakan pada level rendah (20 ml) dan level tinggi (50 ml)
memberikan respon kadar steviosida yang berbeda. Volume etanol 96% yang
digunakan dalam proses maserasi meningkatkan kadar steviosida yang
terekstraksi (gambar 6b). Harga F hitung dari faktor volume etanol 96% adalah
paling besar, hal ini menegaskan bahwa etanol 96% merupakan faktor yang
dominan dalam menentukan respon kadar steviosida dalam sampel.
Tabel VIII. Hasil perhitungan Yate’s Treatment pada respon kadar steviosida
Source of variation Degrees of
freedom Sum of Squares
Mean Squares
F hitung F tabel (1,3)
Replicates 1 0,465806 0,465806
Treatment 3 39,87911 13,29304
a (suhu) 1 1,53265 1,53265 7,242069 10,128
b (vol etanol 96%) 1 37,02387 37,02387 174,945 10,128
ab Interaksi 1 1,322588 1,322588 6,249487 10,128
Experimental error 3 0,634895 0,211632
Total 7 40,97981
48
Sedangkan harga F hitung suhu dan interaksi lebih kecil dari F tabel (1,3)
yaitu 10,128, oleh karena itu H01 dan H03 statistik (lampiran 6) diterima sehingga
terbukti bahwa faktor suhu dan interaksi tidak memberikan perbedaan respon
kadar steviosida yang dihasilkan (tabel VIII).
49
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Perbedaan suhu dan jumlah volume pelarut etanol 96% yang digunakan
dalam proses maserasi daun tanaman stevia berpengaruh terhadap kadar
steviosida yang dihasilkan.
2. Kadar steviosida optimum yang dapat diperoleh pada proses maserasi
daun stevia dengan variasi suhu dan volume etanol 96% adalah berkisar
pada rentang 3%b/b hingga 7,935%b/b.
3. Volume etanol 96% berpengaruh paling dominan terhadap proses maserasi
daun tanaman stevia.
B. Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai optimasi lama maserasi
serbuk daun tanaman stevia.
.
50
DAFTAR PUSTAKA
Achyar, 2005, Zat Aditif Pada Makanan, http://www.pppgtertulis.or.id/index.php?id=16, diakses pada tanggal 23 oktober 2008
Alupului. A., Vasile Lavric, 2008, Ultrasound Extraction of Active Principles
with Hypoglycaemic Activity from Medical Plants, 1-8, University Politehnica of Bucharest, Chemical Engineering Department, Romania
Amstrong, N.A., James, K.C., 1996, Pharmaceutical Experimental Design and
Interpretation, Taylor and Francis, USA: , 131 – 165 Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Ed III, 4, Departemen Kesehatan RI,
Jakarta Anonim,1985, Cara Pembuatan Simplisia, 7-15,105-123, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta Anonim,1986. Sediaan Galenik, 25-26, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta Anonim,1995, Farmakope Indonesia, Ed IV, 63, Departemen Kesehatan RI,
Jakarta Anonim, 2004, Stevia; 0% Calorie, 100% Sweet, 100% Nature, 1-7, Source
Science Tech, Entrepreneur, Vol. 12/ No. 10 Anonim, 2008, Image J, http://en.wikipedia.org/wiki/ImageJ, diakses tanggal 6
November 2008
Ansel, H.C., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, 605-612, Edisi III, Universitas Indonesia Press, Jakarta
Backer, C.A, and Van de Brink, 1968, Flora of Java, Volume I&II, Wolters
Noordhff, N.N, Groningen, the Nedherlands
Brandle, J.E., dan Rosa, N. 1992. Heritability for yield, leaf:stem ratio and stevioside concentration estimated from a landrace cultivar of Stevia rebaudiana. Can. J. Plant Sci. 72: 1263-1266
Bolton, 1997, Pharmaceutical Statistic Practical and Clinical Aplications, 3rd Ed, Marcel Dekker Inc., New York, p.611-614
51
Cannel, Richard J.P, 1998, Methods in Biotecnology Natural Products Isolation, 54-66, Humana Press, Totowa New Jersey
Gardana, C., Simonetti, P., Canzi, E., Zanchi, R., Pietta, P., 2003, Metabolism of
Stevioside and Rebaudioside A from Stevia rebaudiana Extracts by Human Microflora, http:/www.steviainfo.com/research_articles/Gardana , diakses tanggal 6 Desember 2008.
Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., and Schwarting, A.E., 1985, Introduction to
Chromatography, 2rd ed, 84-85, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Holden-day inc, USA
Heinrich, M., Barnes, J., Gibbons, S., Williamson, E.M., 2004, Fundamentals of
Pharmacognosy and Phytotherapy, 91-92, 107, 111-112, Churchill
Livingstone, United Kingdom
Jahnen, and Andreas, 2008, Image J software in ophthalmic research of retina
with optical coherence tomography,
http://imagejconf.tudor.lu/programme/posters/imageJ-software-in-
ophthalmic-research%20of%20retina%20with-optical-coherence-
tomography, diakses tanggal 6 November 2008
Kumar J.K, N.W Megeji, Virendra Singh, V.K Kaul, P.S Ahuja, 2005,
Introducing Stevia rebaudiana; a Natural Zero-Calorie Sweeterner, Current
Science Vol. 88 No. 10, Institute of Himalayan Bioresource Technology, 1-
4, Palumpiur, India
Mantovaneli, I.C.C., Ferretti, E.C., M. R. Simões, M.R., dan C. Ferreira da Silva.
2004. The effect of temperature and flow rate on the clarification of the
aqueous stevia-extract in a fixed-bed column with zeolites. Braz. J. Chem.
Eng. São Paulo . vol.21 no.3: 449-458
Martono, Y., Kristopo, H., dan Sihasale, L.R., 2007, Recovery Produk Ekstrak
Steviosida sebagai Bahan Alternatif, Pengganti Gula dari Stevia rebaudiana
(Bert.), Laporan Penelitian, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas
Satya Wacana, Salatiga
52
Matshushita, 1979, 1-5, Separation of Sweet Component from Natural Sweet Extracts
Midmore, D.J., and Rank, A.H.,2002, A New Rural Industry- Stevia to Replace
Imported Chemical Sweeterners, RIRDC Rural Industries Research &
Development Corporation
Moraes, Ĕlida de Paula., Machado, and Nádia Regina Camargo Fernandes, 2001,
Clarification of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in
modified zeolites. Maringá, v. 23, n. 6, p. 1375-1380
Mudjajanto, E.S., 2005, Keamanan Jajanan Tradisional.
http://www.kompas.com/kompas-cetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm,
diakses pada tanggal 3 November 2008
Mulja, H. Muhammad, dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 223-224,
Universitas Airlangga Press, Surabaya.
Munson, J.W., 1991, Analisis Farmasi Metode Modern, 36-38, Airlangga University Press, Yogyakarta.
Muth, J.E, 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Statistical Application, 265-
294, Marcel Dekker. Inc, All Right Revised, Madnison Avenue, New York
Nabors, Lyn’O Brien, and Robert C.Gelardi, 1986, Alternative Sweeteners, edited
by Abraham I. Bakal, 296-297, 302, Marcel Dekker. Inc, New York, USA
Pasquel, A., 2008, Extraction of Stevia Glycosides with CO2 + Water, CO2 + Etanol, and CO2 + Water +Etanol, 1-15, Brazilian Journal of Chemical Engineering, Brazil
Patnark, Santosh, 2004, Using Image J for Densitometry, http://stanxterm.aecom.yu.edu/wiki/index.php?page=Using_ImageJ , diakses pada tanggal 5 Mei 2008
53
Perret, .J, Berthon, .J, Moreno, .C, Tenin, .M, 2006, Frequently Asked Questions and Answers (FAQs), http://www.greensweet/stevia.com/publication/index.php?page=page&pere=5 , diakses tanggal 28 Januari 2009
Pol,. Jaroslav, Elena Varadova Ostra, Pavel Karasek, Michal Roth, Karolinka
Benesova, Pavla Kotlarikova, and Josef Caslavsky, 2007, Comparison of
Two Different Solvents Employed for Pressurised Fluid Extraction of
Stevioside from Stevia rebaudiana : methanol versus water, Anal Bioanal
Chem, Czech Republic, 388: 1847-1857
Purves, W.K., 2006, How Can an Artificial Sweeterner Contain No Calorie?,
http://www.sciam.com/artikel.csm?id=how-can-an-artificial-swe, diakses
tanggal 28 Januari 2009
Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, Ed I, 26 – 30, Liberty, Yogyakarta
Silva, Flavia Ficira. dkk., 2007, Purification Process of Stevioside Using Zeolites
and Membranes, 1-7, International Journal of Chemical Reactor
Engineering, Vol 5 Article A40
Stahl, Egon, 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microssopy,
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 3-18, Penerbit ITB, Bandung
Stock, R., and C.B.F. Rice, 1974, Chromatographic Methods, Third Edition, 283,
Chapman and Hall and Science Paper Backs, Great, Britain
Supardjan, A.M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Uraiannya dalam
Sediaan Tetrasiklin secara KLT Densitometri, 57, Lembaga Penelitian
UGM, Yogyakarta.
Trease, William, and Charles Evan’s, 2002, Pharmacognosy 15th edition, 92,
W.B. Saunders, Nottingham, UK
Tyler, Varro E., Lynn R. Brady, and James E. Robbers, 1988, Pharmacognosy 9th
edition, Lea & Febiger, Philadelphia
54
Voigt, 1984, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, 165-169, Gadjah Mada
University Press, Yogyakarta.
Wagner H., S. Bladt, and E.M. Zgainski, 1984, Plant Drug Analysis; Thin Layer
Cromatography Atlas, diterjemahkan oleh Th. A. Scott, 125,304, Springer-
Verlag, New York.
Wallin. Harriet, 2007, Steviol Glycosides Chemical and Technical Assesment, 1,
revised by Paul M. Kuznesof Ph.D, 68th, JECFA
Zeligs, Michael A., and H. Leon Bradlow, Diindolylmethane (DIM), formed
spontaneously from Indole-3-carbinol (I3C), is the dominant anti-
proliferative indole in cell culture media after adding I3C,
http://www.aidic.it/IBIC2008/webpapers/86Alupului.pdf, diakses pada
tanggal 22 Desember 2008.
55
LAMPIRAN DATA
56
Lampiran 1. Kurva Baku Steviosida
Data Penimbangan Baku Steviosida
Berat Cawan = 13,3605 g
Berat Cawan + Zat = 13,37079 g
Berat Zat = 0,01014 g
= 10,14 mg add 5 ml
Konsentrasi Baku Steviosida = 2,028 mg/ml
Kadar Steviosida dalam 1µl (1 totolan ) = 2,028 µg
Kurva Baku Steviosida Jumlah Totolan AUC Kadar (µg)
2 11,188 4,056
3 15,927 6,084
4 23,61 8,112
5 28,539 10,14
6 39,371 12,168
7 48,372 14,196
Persamaan Kurva Baku
A= -5,7459
B= 3,6796
r = 0,9911
Y= 3,6796 X-5,7459
57
Lampiran 2. Data Sampel
1. Data Sampel Replikasi Air Suhu Etanol AUC
Sampel Kadar (µg/3µl) Kadar Sampel
(mg/vol ekstrak)
Rata-rata kadar sampel(mg/4gram serbuk)
1 20ml 300C 20ml 17,787 6,395504946 106,5917491
2 20ml 300C 20ml 19,425 6,840662028 114,0110338
110,3014 ± 5,2462
1 20ml 500C 20ml 20,843 7,226030003 120,4338334
2 20ml 500C 20ml
17,468 6,30881074 105,1468457
112,7903 ± 10,8095
1 20ml 300C 50ml 22,628 7,71113708 257,0379027
2 20ml 300C 50ml 21,047 7,281470812 242,7156937
249,8768 ± 10,1273
1 20ml 500C 50ml 32,331 10,34810849 344,9369497
2 20ml 500C 50ml 26,256 8,697113817 289,9037939
317,4204 ± 38,9143
Rata-rata Kadar Sampel dalam (%b/b)
Kondisi Rata-rata kadar
sampel (mg/4 gram
serbuk)
Rata-rata kadar
sampel (gram/4
gram serbuk)
Rata-rata kadar
sampel (gram/100
gram serbuk)
(%b/b)
(1) 110,3014 0,1103 2,7575 ± 0,1311
a 112,7903 0,1128 2,8198 ± 0,2701
b 249,8768 0,2499 6,2469 ± 0,2531
ab 317,4204 0, 3174 7,9355 ± 0,9728
58
Lampiran 3. Perhitungan Data Sampel
Perhitungan Data Sampel
Persamaan kurva baku = Y= 3,6796 x-5,7459
1. Sampel (300C dan etanol 20 ml)
a. Replikasi 1 (AUC = 17,787)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
17,787 = 3,6796 x-5,7459
23,5329 = 3,6796 x
x = 6,395504946 µg/3µl
x = 106,5917491mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 106,5917491mg/4gram serbuk
= 0,1066 gram/4 gram serbuk
= 2,6648 gram/100 gram serbuk (%b/b)
b. Replikasi 2 (AUC= 19,425)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
19,425 = 3,6796 x-5,7459
25,1709 = 3,6796 x
x = 6,840662028 µg/3µl
x = 114,0110338 mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 114,0110338 mg/4gram serbuk
59
= 0,1140 gram/4 gram serbuk
= 2,8503 gram/100 gram serbuk (%b/b)
2. Sampel (500C dan etanol 20 ml)
a. Replikasi 1 (AUC= 20,843)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
20,843 = 3,6796 x-5,7459
26,5889 = 3,6796 x
x = 7,226030003 µg/3µl
x = 120,4338334 mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 120,4338334 mg/4gram serbuk
= 0,1204 gram/4 gram serbuk
= 3,0108 gram/100 gram serbuk (%b/b)
b. Replikasi 2 (AUC=17,468)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
17,468 = 3,6796 x-5,7459
23,2139 = 3,6796 x
x = 6,30881074 µg/3µl
x = 105,1468457 mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 85,27339928 mg/4gram serbuk
60
= 0,0853 gram/4 gram serbuk
= 2,1318 gram/100 gram serbuk (%b/b)
3. Sampel (300C dan etanol 20 ml)
a. Replikasi 1(AUC=22,628)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
22,628 = 3,6796 x-5,7459
28,3739 = 3,6796 x
x = 7,71113708µg/3µl
x = 257,0379027mg/100 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 257,0379027 mg/4gram serbuk
= 0,2570 gram/4 gram serbuk
= 6,4259 gram/100 gram serbuk (%b/b)
b. Replikasi 2(AUC= 21,047)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
21,047 = 3,6796 x-5,7459
26,7929 = 3,6796 x
x = 7,281470812 µg/3µl
x = 242,7156937 mg/40 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 242,7156937mg/4gram serbuk
61
= 0,2427 gram/4 gram serbuk
= 6,0679 gram/100 gram serbuk (%b/b)
4. Sampel (300C dan etanol 20 ml)
a. Replikasi 1 (AUC = 32,331)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
32,331 = 3,6796 x-5,7459
38,0769 = 3,6796 x
x = 10,34810849 µg/3µl
x = 344,9369497 mg/40 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 344,9369497 mg/4gram serbuk
= 0,3449 gram/4 gram serbuk
= 8,6234 gram/100 gram serbuk (%b/b)
b. Replikasi 2 (AUC = 26,256)
- Jumlah steviosida dalam sampel
Y = 3,6796 x-5,7459
26,256 = 3,6796 x-5,7459
32,0019 = 3,6796 x
x = 8,697113817µg/3µl
x = 289,9037939 mg/40 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk
- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)
Jumlah Steviosida = 289,9037939 mg/4gram serbuk
62
= 0,2899 gram/4 gram serbuk
= 7,2476 gram/100 gram serbuk (%b/b)
Kondisi Replikasi Kadar steviosida dalam sampel(mg/4gram serbuk)
Kadar steviosida dalam sampel (gram/4gram serbuk)
Kadar steviosida dalam sampel (gram/100 gram serbuk) (%b/b)
Rata-rata (%b/b)
(1) 1 106,5917491 0,1066 2,6648 2,7575 ± 0,1311 (1) 2 114,0110338 0,1140 2,8503
a 1 120,4338334 0,1204 3,0108 2,8198 ± 0,2701 a 2 105,1468457 0,1051 2,6287
b 1 257,0379027 0,2570 6,4259 6,2469 ± 0,2531 b 2 242,7156937 0,2427 6,0679
ab 1 344,9369497 0,3449 8,6234 7,9355 ± 0,9728 ab 2 289,9037939 0,2899 7,2476
63
Lampiran 4. Perhitungan Desain Faktorial
Perhitungan Desain Faktorial Kondisi Suhu (0C) Volume Etanol Interaksi Rata-rata
kadar sampel (%b/b)
(1) - - + 2,7575
a + - - 2,8198
b - + - 6,2469
ab + + + 7,9355
Perhitungan nilai efek masing-masing faktor
Efek Etanol =
Efek Suhu =
Efek Interaksi =
Perhitungan mencari persamaan Faktorial Design
Persamaan Umum = Y = b0 + b1.X1 + b2.X2 + b12.X1X2
X1= faktor suhu X2 = faktor volume etanol
(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 + 20 b2 + (30x20) b12
2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12
(a) 2,8198 = b0 +50 b1+20 b2+ (50x20)b12
2,8198 = b0 +50 b1+20b2+1000 b12
(b) 6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 +(30x50)b12
6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 + 1500 b12
64
(ab) 7,9355 = b0 + 50 b1+ 50 b2 + (50x50) b12
7,9355 = b0 + 50 b1 +50 b2 + 2500 b12
Eliminasi (1) dan (a)
(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12
(a) 2,8198 = b0 +50 b1+20b2+1000 b12 _
-0,0623= -20 b1 – 400 b12……………(I)
Eliminasi (b) dan (ab)
(b) 6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 + 1500 b12
(ab) 7,9355 = b0 + 50 b1 +50 b2 + 2500 b12
-1,6886 = -20 b1 – 1000 b12………………(II)
Eliminasi (I) dan (II)
(I) -0,0623 = -20 b1 – 400 b12
(II) -1,6886 = -20 b1 – 1000 b12
1,6263 = 600 b12
b12 = 2,7105x10-3
substitusi b12 ke (I)
(I) -0,0623 = -20 b1 – 400 b12
-0,0623 = -20 b1 – 400 (2,7105x10-3)
-0,0623 = -20 b1 – 1,0842
1,0219 = -20 b1
b1 = -0,0511
65
eliminasi (1) dan (b)
(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12
(b) 6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 + 1500 b12
-3,4894= -30 b2 – 900 b12………………,(III)
Substitusi b12 ke (III)
(III) -3,4894 = -30 b2 – 900 b12
-3,4894 = -30 b2 – 900 (2,7105x10-3)
-3,4894 = -30 b2 – 2,4395
-1,0499 = -30 b2
b2 = 0,0349
substitusi b1,b2,b12 ke (1)
(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12
2,7575 = b0 + 30 (-0,0511) +20 (0,0349) + 600 (2,7105x10-3)
2,7575 = b0 – 1,533 + 0,6980 + 1,6263
2,7575 = b0 + 0,7913
b0 = 1,9662
Persamaan Desain Faktorial
y = 1,9662 -0,0511A + 0,0349 B +0,0027105AB
66
Lampiran 5. Grafik Contour Plot
67
Lampiran 6. Perhitungan Yate’s Treatment
Perhitungan Yate’s Treatment
Kondisi Replikasi Kadar steviosida dalam sampel(mg/4gram serbuk)
Kadar steviosida dalam sampel (gram/4gram serbuk)
Kadar steviosida dalam sampel (gram/100 gram serbuk) (%b/b)
(1) 1 106,5917491 0,1066 2,6648
(1) 2 114,0110338 0,1140 2,8503
a 1 120,4338334 0,1204 3,0108
a 2 105,1468457 0,1051 2,6287
b 1 257,0379027 0,2570 6,4259
b 2 242,7156937 0,2427 6,0679
ab 1 344,9369497 0,3449 8,6234
ab 2 289,9037939 0,2899 7,2476
Faktor Suhu
A1(rendah) A1(rendah) A2(tinggi) A2(tinggi)
Replikasi B1(rendah) B2(tinggi) B1(rendah) B2(tinggi)
1 2,6648 6,4259 3,0108 8,6234
2 2,8503 6,0679 2,6287 7,2476
68
Kadar Steviosida (Perhitungan Yates Treatment)
2yΣ = total sum of squares
2yΣ = (2,6648)2 + (2,8503)2 +(6,4259)2 + (6,0679)2 +( 3,0108)2 + (2,6287)2 +
(8,6234)2 + (7,2476)2 – 8
2)5194,39(
= 40,97981
Ryy = replicate sum of square
Ryy = ( ) ( ) ( )
85194,39
418,794520,7249 222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +
= 0,465806
Tyy = treatment sum of squares
Tyy = ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
85194,39
215,8715,639512,49385,5151 22222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +++
= 39,87911
Eyy = experiment al error sum of squares
= 40,97981– 0,465806– 39,87911
= 0,634895
Ayy = sum of squares associated with teh different level of a
= ( ) ( ) ( )
85194,39
421,510518,0089 222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +
= 1,53265
69
Byy = sum of squares associated with teh different level of b
= ( ) ( ) ( )
85194,39
428,364811,1546 222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +
= 37,02387
Source of variation
Degrees of freedom Sum of Squares Mean Squares
F
Replicates 1 0,465806 0,465806
Treatment 3 39,87911 13,29304
a 1 1,53265 1,53265 7,242069
b 1 37,02387 37,02387 174,945
ab 1 1,322588 1,322588 6,249487
Experimental error 3 0,634895 0,211632
Total 7 40,97981
F tabel (1,3) dengan tingkat kepercayaan 95% adalah 10,128
Hipotesis Statistik:
H01 = kadar steviosida pada suhu level tinggi tidak berbeda dengan suhu level
rendah.
Hi1= kadar steviosida pada suhu level tinggi berbeda dengan suhu level rendah.
H02 = kadar steviosida pada volume etanol 96% level tinggi tidak berbeda dengan
volume etanol 96% level rendah.
Hi2= kadar steviosida pada volume etanol 96% level tinggi berbeda dengan
volume etanol 96% level rendah.
.
70
H03 = kadar steviosida pada suhu level tinggi dan volume etanol 96% level tinggi
dan rendah tidak berbeda dengan respon kadar steviosida pada suhu level rendah
dan volume etanol 96% level tinggi dan rendah .
Hi3 = kadar steviosida pada suhu level tinggi dan volume etanol 96% level tinggi
dan rendah berbeda dengan respon kadar steviosida pada suhu level rendah dan
volume etanol 96% level tinggi dan rendah .
71
Lampiran 7. Gambar Tanaman dan Simplisia Kering
72
Lampiran 8. Gambar Pereaksi Semprot
Pereaksi Semprot
a. Larutan Iodium
b. Larutan Vanilin-asam sulfat
73
Lampiran 9. Tampilan Baku dan Sampel pada Lempeng KLT
74
Lampiran 10. Tampilan Baku dan Sampel dalam Tahapan Image
a. Saat di Auto 3 kali
b. Saat setelah di Image J
75
Lampiran 11. Tampilan Ekstrak
a. Suhu 300C dan Etanol 20 ml
b. Suhu 500C dan Etanol 20 ml
c. Suhu 300C dan Etanol 50 ml
d. Suhu 500C dan Etanol 50 ml
78
Lampiran 13. Langkah-langkah Analisis Image J
a. Hasil scan gambar kromatogram dari sampel maupun baku di atur dalam
hal contrast/brightness gambar menggunakan fasilitas Image > Adjust >
Brightness/Contrast > Auto pada software Image J, sehingga bercak akan
tampak lebih jelas dan memisah. Lalu file disimpan.
b. Membuka program Adobe Photoshop, lalu buka file yang telah disimpan
pada (a) (Open > File). Gambar kromatogram tersebut dihitamkan dengan
menggunakan fasilitas Magic Wand Tool dan Paint Bucket Tool. Dengan
fasilitas yang sama, maka sisi luar dari kromatogram diputihkan.
Kemudian file disimpan kembali.
c. File yang telah disimpan pada (4) dibuka pada Image j (Open > File)
d. Gambar diperbesar (Image > Zoom Out)
e. Hapus background gambar dan titik-titik pengotor dengan menggunakan
fasilitas Eraser Tool dan fasilitas perbesaran Magnifying Glass, sehingga
yang tampak hanya bercak baik dari baku maupun sampel.
f. Kromatogram yang diperoleh tersebut kemudian disamakan intensitas
warna bercak dengan menggunakan fasilitas Binary (Process > Binary).
g. Setelah itu dibuat kurva kalibrasi dengan unit Gray value (Analyze >
Calibrate > Uncalibrate OD).
h. Selanjutnya, masing-masing kromatogram dihitung luasnya dengan
membuat Plot Kurva dengan menggunakan fasilitas Rectangular
79
Selections untuk memberi kotak dengan ukuran sama pada setiap
kromatogram dan pemberian nomer (Analyze > Gels > Select First Lane),
penomeran selanjutnya (Analyze > Gels > Select Next Lane). Lalu pilih
fasilitas Plot Lanes.
i. Setelah plot kurva dari masing-masing kromatogram muncul, kemudian
dicari luas daerah dibawah kurva (AUC) yang menggambarkan luas
bercak dengan menggunakan fasilitas Wand (tracing) Tool. Nilai AUC
dari setiap kromatogram akan muncul.
j. Setelah kurva dari masing-masing bercak muncul, kemudian dicari luas
daerah dibawah kurva (AUC) yang menggambarkan luas bercak dengan
menggunakan fasilitas Wand (tracing) Tool.
80
BIOGRAFI PENULIS
Diana Erosita Pramesthi, lahir di Cirebon pada hari Selasa pon tanggal 22 Maret 1987,
merupakan anak sulung dari pasangan Anton Budiono dan Helena Usiati, memiliki 2 orang Adik
laki-laki bernama Daniel Ugik Permana dan David Irwan Prabowo. Pernah menempuh
pendidikan di TK Santa Maria Cirebon tahun ajaran 1990/1991 hingga 1992/1993, SD Santa
Maria Cirebon tahun ajaran 1993/1994 hingga 1998/1999, kemudian melanjutkan pendidikan di
SLTP Santa Maria Cirebon tahun ajaran 1999/2000 hingga 2001/2002, selanjutnya melanjutkan
pendidikan di SMA Santa Maria I pada tahun ajaran 2002/2003 hingga 2004/2005. Setamat dari
SMA, penulis memilih untuk melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta. Selama jadi mahasiswa, penulis aktif mengikuti berbagai kegiatan
kemahasiswaan, diantaranya menjadi panitia Donor Darah JMKI (2006), panitia Sumpahan
Apoteker (2007), panitia Dies Natalis (2007). Selain itu penulis juga pernah menjadi asisten
Praktikum Botani Dasar (2007) dan asisten Praktikum Farmakologi (2007).