UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE AGRONOMIA

“DIAGNOSTICO POR METODOS MODERNOS”CURSO : FITOPATOLOGIA TROPICAL

DOCENTE : CABEZAS HUAYLAS, Oscar

INTREGANTES : JARA ALVARADO, Alexander GUTIERREZ TITTO, YakelYn HUAMAN ALCEDO, David RENGIFO PÉREZ, Claudia

TINGO MARIA – PERÚ 2015

INTRODUCCIONLAS ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS TIENEN UNA NOTABLE IMPORTANCIA EN LA AGRICULTURA MODERNA, NO SÓLO PORQUE POSEEN EL POTENCIAL DE DESTRUIR ENTERAMENTE LAS COSECHAS ADEMÁS AFECTAN LA CALIDAD Y DURABILIDAD DE LOS PRODUCTOS COSECHADOS.

EL DESARROLLO ALCANZADO POR LA FITOPATOLOGÍA ENTRE LAS CIENCIAS AGRÍCOLAS, ADQUIERE EN LA ACTUALIDAD RELEVANTE IMPORTANCIA EN LA AGRICULTURA MODERNA, AL NIVEL DE PODER DIAGNOSTICAR ENFERMEDADES DE PLANTAS AUN CUANDO ESTAS NO PRESENTEN SINTOMAS; ASI COMO DIAGNOSTICO EN SEMILLAS.

ENTRE LAS MAS CONOCIDAS TENEMOS LAS PRUEBAS INMUNOSEROLÓGICAS Y LA REACCION DE CADENAS POLIMERASA LAS CUALES PERMITEN EVALUAR MUCHAS MUESTRAS EN POCO TIEMPO CON ALTO NIVEL DE CONFIANZA

DIAGNOSTICO POR METODOS MODERNOS

IDENTIFICACION CON PRUEBAS SEROLOGICAS

Esta técnica consiste en el reconocimiento especifico del anticuerpo (antisuero) al antígeno (partícula viral) que le dio origen. El antisuero es producido por sistema linfático de un animal de sangre caliente, el cual al ser inyectado partículas virales purificadas produce proteínas denominados inmunoglobulinas. Estas proteínas llevadas en el suero sanguíneo son conocidas colectivamente como anticuerpos. La serología es extremadamente sensible. Si se inyectara el virus purificado de la mancha anillada de la papaya (PRSV) a un conejo esta producirá anticuerpos específicos que sólo reconocerán a PRSV. (Cabezas, 2004).

REACCION ANTIGENO ANTICUERPO

• Método por precipitación:

Pueden ser en medios líquidos o en geles. Estos métodos han demostrado tener una notable eficacia para individualizar y purificar los antígenos dotados de diferencias particulares. La unión del Antigeno y Anticuerpo se traduce por la formación de un precipitado insoluble con la condición que los reactivos se encuentren a concentración equivalente.

Consiste en hacer reaccionar cantidades equivalentes de los reactantes (Ag y Ac). La formación de gránulos aglutinados o agregados indican una reacción positiva. Las reacciones de aglutinación son menos específicas pues tienen la desventaja de depender grandemente de los factores físico químicos, tales como, concentración de electrolitos, pH, temperatura y el tiempo.

Método por aglutinación:

Está basado en la prueba de aglutinación. Los Ac son adheridos a partículas de látex. Al enfrentarse el látex sensibilizado con el Ag específico se produce la agregación entre estas esferas y los Ag. Esta prueba ha sido usada principalmente en Virología, en Bacteriología la técnica ha sido usada con éxito para detectar Ralstonia solanacearum en papa y Xanthomonas albilineans en caña. El método es de 100 a 1000 veces más sensible que una aglutinación normal, la reacción aparece más rápida, generalmente no es necesario el microscopio para observar la reacción, se necesita muy poco inmunosuero, no requiere la clarificación de la savia.

Método del látex:

Técnica de Inmunofluorescencia:

• Esta técnica se basa en la conjugación de anticuerpos específicos con moléculas teñidas con productos, ejemplo, la fluoresceína, que produce un color verde amarillento. Es muy sensible para identificar bacterias fitopatógenas y útil para analizar un gran número de muestras. La técnica de inmunofluorescencia permite identificar un antígeno con la ayuda de un inmunosuero conocido, e investigar y titular un anticuerpo con la ayuda de un antígeno conocido.

Técnica inmunoenzimática ó Prueba de conjugados enzimaticos (ELISA).

El ensayo se basa en la interacción específica de un antígeno (patógeno) y un anticuerpo (proteínas inmuno-globulinas producidas en un vertebrado superior, usualmente conejos). La reacción se visualiza a través de la acción de un conjugado enzima-anticuerpo sobre un sustrato. Existen diferentes variantes de la técnica de ELISA, todas basadas en el mismo principio. El tipo de técnica y anticuerpo a emplear dependerá del objetivo de la aplicación (campo, laboratorio), tipo de muestra (suelo, agua tejido) y nivel de sensibilidad y rapidez requerida.Su amplia utilización como técnica de rutina debido a su sencillez y costo, está limitada en algunos casos por la disponibilidad de anticuerpos comerciales.

IDENTIFICACION POR TECNICAS MOLECULARES REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):

Reacción en cadena de la polimerasa

(PCR): Es uno de los métodos moleculares

de mayor eficiencia en el diagnóstico de

enfermedades vegetales. Es utilizada

en la detección de patógenos en semillas,

el cultivo de tejidos, detección de toxinas y residuos de pesticidas

(Flores-Olivas, et al ,1997).

La PCR es una técnica que permite

determinar relaciones

filogenéticos entre especies y

constituye una buena herramienta

de análisis de la biología de las

poblaciones (Baró, 1998).

Ventajas - No existe necesidad de cultivar los organismos para su detección - La técnica es rápida y versátil (2-3 hora) - Detecta moléculas simples en mezclas complejas. - Es 80 a 100 veces mas sensible de RLFP.

Desventajas - Para detectar virus y viroides existe un costo adicional para la transcripción reversa del ARN a ADNc, antes de ser amplificado.

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA SE BASA EN LA REPETICIÓN DE UN CICLO FORMADO POR TRES ETAPAS:

2ª Hibridación de los

iniciadores a la zona 3

específica de cada una de las hebras.

1ª Desnaturalización del ADN doble cadena.

3ª Extensión

del cebador

por actuación de la DNA polimerasa

.

PCR con transcripción inversa (RT-PCR)

La mayoría de los virus de las plantas y todos los viroides tienen un genoma ARN, lo que imposibilita utilizar la metodología original de la PCR para su detección. Debido a esto la PCR se realiza precedida por la transcripción inversa (RT), en la cual el ARN es convertido a ADNc, por medio de la enzima reverso transcriptasa, en presencia de cebadores. Luego de sintetizado el ADNc, se procede a su amplificación mediante el procedimiento clásico de PCR. 

PCR con inmunocaptura La técnica consiste en la captura o inmovilización de las partículas virales presentes en el extracto vegetal crudo sobre un soporte sólido (microtubos) que ha sido previamente recubierto o tapizado con anticuerpos específicos. Posteriormente, se añade la mezcla de la RT-PCR.

Nested-PCR

La PCR anidada o nested-PCR es otra variante que consiste en someter la misma muestra de ADN a dos reacciones consecutivas de PCR, la primera con iniciadores que amplifican una región más amplia, y la segunda con iniciadores específicos internos de la región primeramente amplificada. La PCR anidada resulta mucho más sensible que una reacción simple de PCR y su empleo se extiende a diferentes tipos de patógenos

PCR múltipleLa PCR múltiple fue originalmente usada para co-amplificar productos génicos en una única PCR, utilizando más de una pareja de iniciadores. . Este procedimiento está siendo utilizado en la actualidad para la detección de las diferentes especies de Candidatus Liberibacter causantes de HLB. (Lochy et. Al)

PCR en tiempo real

Esta técnica se ha aplicado exitosamente en la detección cuantitativa de numerosos patógenos, entre ellos CTV y las bacterias causantes de HLB. Sin embargo, solo se justifica en casos excepcionales, debido a que por el momento su costo es muy elevado para su empleo en el diagnóstico masivo. (Lochy et. Al)

Hibridación de ácidos nucleicosLa hibridación de ácidos nucleicos (NASH) se encuentra entre las técnicas más empleadas en los últimos años para la detección de patógenos, especialmente cuando se procesa un gran número de muestras

RFLP: Se trata de una técnica costosa y laboriosa que precisa de una gran cantidad de ADN y una información previa sobre su secuencia, además que usualmente involucra el uso de radioisótopos, por lo que está siendo des- plazada por los marcadores basados en la reacción en cadena de la polimerasa que ha contribuido a la simplificación de la tecnología y reducción de los costos (Chávez y González, 2000).

Técnica RAPD: Polimorfismo del ADN amplificado al azar. Es una PCR que utiliza un solo iniciador, cuyo tamaño es en general de 10 bases, e hibrida a secuencias repartidas aleatoriamente sobre el ADN. Provee patrones de bandas cuyo número y tamaño permiten el análisis de variaciones moleculares (Strigmam y Mackay, 1993 citados por Baró, 1998).

Técnica de microscopía óptica y electrónica: El empleo de estas técnicas se limita solamente a la observación directa de las estructuras del patógeno en cuestión (Pupiro y Malagón, 2003).

Otras Técnicas de Diagnostico

Las técnicas de diagnóstico de enfermedades son esenciales para poder combatirlas y controlarlas, en el mejor de los casos erradicarlas. A lo largo del tiempo estas han ido evolucionando y mejorado para poder hacer las determinaciones más precisas y en menor tiempo. Las técnicas modernas de diagnóstico de enfermedades en plantas más utilizadas son:

Las técnicas molecularesLas pruebas serológicas

De los 3 métodos de diagnóstico modernos mencionados el que se destaca por ser le mas usado es la reacción en cadena de la polimerasa. Pero por su disponibilidad, sencibilidad, y costo es suficiente las pruebas serológicas escepto para viroides y fitoplasmas.

CONCLUSION

ALGUNAS PRUEBAS USADAS

FRECUENTEMENTE

GRACIAS POR SU

ATENCION