LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Thanh Vân-

Trưởng phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng

dụng Công nghệ Nha Trang và TS. Phạm Thu Thủy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ

tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện

Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp

đỡ tôi để tôi có đủ điều kiện thực hiện đồ án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang,

Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và

sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và

hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã

quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để tôi hoàn thành đồ án này.

Nguyễn Thị Khánh Vy

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ

BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU....................................................................................................................1

PHẦN 1: TỔNG QUAN.............................................................................................4

1.1. Đặc điểm chung về rong biển...........................................................................4

1.2. Phân loại rong biển...........................................................................................4

1.3. Giới thiệu đặc điểm và sự phân bố của rong Nâu và rong Mơ (Sargassum)...5

1.4. Một số hợp chất polysaccharide từ rong Nâu...................................................6

1.4.1. Fucoidan.....................................................................................................6

1.4.2. Laminaran..................................................................................................9

1.4.3. Acid alginic..............................................................................................10

1.5. Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết từ rong biển......................11

1.5.1. Hoạt tính sinh học của Fucoidan..............................................................11

1.5.2. Hoạt tính sinh học của Laminaran...........................................................14

1.5.3. Hoạt tính sinh học của acid alginic..........................................................14

1.6. Tình hình nghiên cứu về enzyme cắt mạch polysaccharide có nguồn gốc

rong biển................................................................................................................15

1.6.1. Tình hình nghiên cứu fucoidanase...........................................................15

1.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme thuỷ phân laminaran................................17

1.7. Một số ứng dụng của oligosaccharide từ rong biển.......................................19

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................21

2.1. Nguyên vật liệu...............................................................................................21

2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................21

2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật...........................................21

2.2.2. Phương pháp lên men vi sinh vật.............................................................23

2.2.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật........................................24

2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme..............................................25

2.2.5 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp..........................27

2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Fucoidan.............................................27

2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nito...................................................28

2.2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH................................................................29

2.2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc......................................30

2.2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy........................................31

2.2.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme..................32

2.2.6.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme.....................................32

2.2.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme...................................33

2.3. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................33

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................34

3.1.Phân lập các chủng vi sinh vật từ bùn thải trong quá trình sản xuất fucoidan 34

3.2. Sàng lọc các chủng vi sinh vật theo định hướng sinh enzyme cắt mạch

polysaccharide.......................................................................................................35

3.3. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu để chủng SW21 phát triển và sinh

enzyme fucoidanase hoạt tính cao.........................................................................37

3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ fucoidan..............................................37

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Nitơ.....................................................38

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH.....................................................................39

3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc............................................40

3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cây quá trình sinh trưởng và tổng hợp

fucoidanase.........................................................................................................41

3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện xúc tác của enzyme.........................................43

3.4.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme..........................................43

3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme.........................................44

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................46

4.1. Kết luận...........................................................................................................46

4.2. Kiến nghị........................................................................................................46

PHỤ LỤC..................................................................................................................47

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số loài rong nâu có hàm lượng fucoidan cao......................................7

Bảng 1.2: Vi sinh vật biển và enzym của chúng [28]...............................................16

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan [2]...................................21

Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ bùn thải rong nâu.......................................34

Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh enzyme bẻ

ngắn mạch polysaccharite.........................................................................................35

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ fucoidan lên sự sinh tổng hợp fucoidanase của

chủng SW21..............................................................................................................37

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự phát triển và sinh tổng hợp

fucoidanase của chủng SW21...................................................................................38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus....................................8

Hình 1.2: Cấu trúc laminaran......................................................................................9

Hình 1.3: Cấu trúc acid alginic.................................................................................10

Hình 1.4: Sản phẩm MODIFILAN và FUCGASTRO..............................................20

Hình 2.1: Đường chuẩn fucose.................................................................................26

Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển và khả năng sinh enzyme fucoidanase

của chủng SW21........................................................................................39

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc lên khả năng sinh enzyme của chủng

SW21..........................................................................................................40

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cây quá trình sinh trưởng và tổng hợp

fucoidanase.................................................................................................41

Hình 3.4: pH tối ưu của fucoidanase chiết từ chủng SW21......................................43

Hình3. 5: Nhiệt độ tối ưu để enzyme fucoidanase từ chủng SW 21 hoạt động........44

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi khuẩn.............................24

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ fucoidan thích hợp................27

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nguồn nitơ thích hợp...........................28

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy thích hợp.........................29

Sơ đồ 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ nuôi cấy lắc thích hợp..............30

Sơ đồ 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp...............31

Sơ đồ 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính..........32

của enzyme................................................................................................................32

BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid

FDA Food and Drug Administration

Fuc Fucose

Gal Galactose

HCMV Human cytomegalo virus

HGF Human Hepatocyte Growth Factor

HIV Human immunodeficiency virus

Man Mannose

OD Optical Density (Mật độ quang)

RNA Ribonucleic acid

Xyl Xylose

1

MỞ ĐẦU

Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong Nâu là một trong

số các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất. Rong Nâu

chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là

các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose,…); 17 acid amin; các acid

béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các

polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự

do nguy hiểm; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu;alginat là chất giải độc

thiên nhiên; polyuronan có hoạt tính kháng u não[48]; laminaran có tác dụng rất tích

cực trong việc hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến mạch máu tim, chất kháng ung

thư, chất bảo vệ phóng xạ, kháng đông lạnh, chất kích thích hạt giống nảy mầm,

tăng trưởng cây trồng [3]và fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống

viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư.

Trong rong Nâu, hàm lượng polysaccharid chiếm khoảng từ 40-80% khối

lượng rong khô, là những chất có giá trị nhất và có ứng dụng hết sức rộng rãi nhờ

các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng. Theo các nhà khoa học Nga,

polysaccharide tồn tại trong rong nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong

kiềm là acid alginic, đã được nghiên cứu từ những năm 30 của thế kỷ trước và được

sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và

mỹ phẩm; nhóm tan trong nước bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan là

những chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá mới được nghiên cứu sử dụng trong

khoảng vài thập kỷ trở lại đây. Đặc biệt là fucoidan được tìm thấy trong vách tế bào

rong nâu là chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá: Hoạt tính chống đông máu và

chống đông tụ (Anticoagulant và Antithrombotic), hoạt tính kháng u, tăng cường

miễn dịch, hoạt tính kháng virus, trị bệnh dạ dày, bệnh về da [5]. Ngoài ra fucoidan

còn được sử dụng để điều trị các bệnh dị ứng, lão hóa, viêm khớp, suyễn, đái tháo

đường, tăng nhãn áp, huyết áp cao, cholesterol cao, bệnh tim, viêm gan C, HIV,

bệnh gan, loét dạ dày, đột quỵ, tuyến giáp, thiên đầu thống.

Nước ta có bờ biển dài hơn 3.200 km trải dài từ Bắc xuống Nam, bao bọc

toàn bộ phía Đông và phía Nam với diện tích mặt nước biển hơn 1.000.000 km 2,

2

được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong Nâu rất đa dạng và phong

phú, trong đó rong Mơ (Sargassum) đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng

khai thác ước tính đạt trên 10.000 tấn khô/năm. Mặc dù vậy cho đến nay các nghiên

cứu trong nước về chế biến rong Nâu mới chỉ quan tâm đến việc tách chiết các

thành phần đơn lẻ alginat, iodine, manitol, kích thích tố sinh trưởng cây trồng và

gần đây là laminaran nhưng đều ở một trình độ chưa cao, hiệu quả kinh tế còn thấp.

Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang

đã triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một hướng nghiên cứu

thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn.

Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của các polysacchrid rong Nâu

lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu thì việc xác định

cấu trúc hóa học của chúng là điều kiện tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của các

nhà khoa học trên thế giới. Các phương pháp sử dụng lý hóa trước khi phân tích

được sử dụng hiện tại (thủy phân đề-sulfat hóa, đề actyl hóa) thường đòi hỏi điều

kiên acid hoặc kiềm mạnh ở nhiệt độ cao, do đó có thể làm thay đổi cấu trúc của

polysaccharid và làm mất hoạt tính sinh học quý của chúng [7][8][9][10]. Do đó

enzyme là công cụ hữu hiệu nhất để thực hiện các phân tích này. Nguồn phân lập vi

sinh vật bẻ ngắn mạch polysaccharid là những nơi có sự hiện diện của nguồn cơ

chất như rong biển, hoặc môi trường xung quanh rong biển sinh sống như nước

biển, bùn biển [37].

Hiện nay Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã chiết xuất

thành công fucoidan, và đã đưa vào sản xuất ở quy mô pilot. Rong Nâu được dùng

để chiết xuất fucoidan, phần còn lại là các polysaccharid khác như alginate,

lamninaran, và một lượng nhỏ fucoidan nằm trong bả thải, thải xuống hầm cống. Bã

thải để lâu ngày, bị hệ vi sinh vật trong hầm phân hủy. Đây chính là nguồn phân lập

vi sinh vật bẻ ngắn mạch polysaccharide rất tốt vì nơi nào có sự hiện diện của cơ

chất thì nơi đó có khả năng tồn tại các vi sinh vật tiêu thụ nó.

Xuất phát từ những lý do nêu trên tôi quyết định chọn đề tài : “Phân lập và sàng

lọc vi sinh vật sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide từ bùn thải của pilot sản

xuất Fucoidan”

3

Nội dung luận văn bao gồm:

Phân lập vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide rong

nâu

Sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh enzyme hoạt tính cao

Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để vi khuẩn sinh enzyme hoạt tính cao

Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

4

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm chung về rong biển

Rong biển hay tảo biển là thực vật thủy sinh, chúng có thể là đơn bào, đa

bào, sống thành quần thể, sống ở biển hoặc vùng nước lợ ven biển. Rong biển có

kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài

hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay

hình thù rất đặc biệt

Rong biển Việt Nam rất phong phú và đa dạng, theo các kết quả nghiên cứu

thì hiện nay nước ta có khoảng 794 loài, phân bố ở miền Bắc 310 loài, miền Nam

484 loài, 156 loài tìm thấy ở cả hai miền.Nguồn rong biển mọc tự nhiên chủ yếu là

rong Nâu, trữ lượng khoảng 10000 tấn khô/năm, miền Trung và miền Nam là nơi có

trữ lượng rong Nâu lớn và chất lượng cao. Sản lượng hàng năm đại dương cung cấp

cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong. Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon

tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó có 20% do rong

biển tổng hợp nên.

Rong biển cung cấp đầy đủ các khoáng chất đặc biệt là các nguyên tố vi

lượng, các acid amin cần thiết cho cơ thể, các loại vitamin, các carbohydrat đặc

trưng và các chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thểm đồng thời có khả năng

phòng và trị bệnh. Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức

năng và ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới.

1.2. Phân loại rong biển

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà

rong biển được chia làm 9 ngành sau đây:

1) Ngành rong lục (Chlorophyta)

2) Ngành rong nâu (Phaeophyta)

3) Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

4) Ngành rong trần (Englenophyta)

5) Ngành rong giáp (Pyrophyta)

5

6) Ngành rong khuê (Bacillareonphyta)

7) Ngành rong kim (Chrysophyta)

8) Ngành rong vàng (Xantophyta)

9) Ngành rong lam (Cynophyta)

Trong đó, ba ngành rong có giá trị kinh tế cao là rong Đỏ, rong Nâu và rong

Lục Rong Đỏ và rong Nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và

được ứng dụng nhiều trong nghành công nghiệp và đời sống. Đối với rong Lục thì

loại tảo clorella được xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, đang

được nghiên cứu phục vụ cho đời sống con người [4].

1.3. Giới thiệu đặc điểm và sự phân bố của rong Nâu và rong Mơ (Sargassum)

Rong Nâu là tên gọi chung của các loài rong thuộc ngành Pheophyta,ngành

này chỉ có một lớp Phaeophycea, gồm 265 chi và khoảng 1500 – 2000 loài, phần

lớn sống ở biển, chỉ có một số loài sống ở nước ngọt.

Rong nâu có cấu tạo nhiều tế bào dạng mảng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn

giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành

dạng cây có gốc, rễ, thân, lá. Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa và ở gốc các lóng.

Rong Nâu sống bám vào các vật thể khác nhờ bàn bám, do đó rong Nâu

thường sống ở các vùng biển đá hoặc nơi có các vật bám khác như chân đập, cầu

cảng, san hô… Rong Nâu tại các vùng ôn đới, hàn đới có kích thước cá thể lớn, số

lượng cá thể nhiều, số loài ít. Còn ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, rong nâu có kích

thước cá thể nhỏ, số lượng loài phong phú

Rong Nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam,

Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile,

Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong

đó, bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ

Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận

nhiệt đới.

6

Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc

khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000

tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng

27.000 tấn.

Rong Mơ Sargassum là một giông Tảo lớn thuộc họ rong Mơ Sargassaceae

của ngành rong Nâu sống trôi nổi trong nước.Ở Việt Nam, các loài rong Mơ thuộc

chi Sargassum, họ Sargassaceae, bộ Fucales, ngành rong nâu là nguồn lợi rong

biển tự nhiên lớn nhất, chúng phân bố khá phổ biến ở ven biển và hải đảo phía Nam

Việt Nam (từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên).

Đây là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn, dài 6-8m, sinh lượng 12kg

rong tươi/m2, hình dạng rất giống thực vật bậc cao. Chúng có khả năng phân bố

rộng mọc trên các bờ biển đá, san hô chết…thích hợp từ khoảng phía trên mực triều

thấp cho đến vài ba mét sâu. Sản lượng trung bình từ 2000-4000g/m2, có nơi đến

7000g/m2 như ở Hòn Chồng, Nha Trang [4].

1.4. Một số hợp chất polysaccharide từ rong Nâu

1.4.1. Fucoidan

Fucoidan là một polysaccharide sulphate được Kylin mô tả đầu tiên vào năm

1913 từ loài rong nâu Laminaria digitata và ông điều chế được chúng vào năm

1915 với tên gọi là Fucoidin [11]. Sau gần 100 năm kể từ khi Kyllin phát hiện ra,

fucoidan được mô tả là một polysaccharide sulphat hóa dị hợp, trong đó fucose

chiếm từ 18,6% đến 60% [24],[25], sulphat chiếm từ 17,7% đến 32,9% [24],[41],

ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose,

xylose, rhamnose ... và acid uronic. Các liên kết glycosit là liên kết (1-3), (1-2) hoặc

(1-4) và các liên kết này có thế là liên kết mạch thẳng hoặc mạch nhánh. Vị trí

nhóm sulphat có thể ở 3 vị trí đó là C2, C3 và C4. Những năm sau này fucoidan

không chỉ được tìm thấy ở các loài rong nâu mà còn được tìm thấy ở một số loài

động vật thân mềm biển như Dưa chuột biển, Cầu gai biển ... tuy nhiên đáng kể nhất

vẫn là fucoidan chứa trong rong nâu với hàm lượng lên tới 6,5% trọng lượng khô,

7

chủ yếu thuộc Bộ Laminariles và Bộ Fucales của lớp Phaeophyceae. Một số loài

rong chứa fucoidan được chỉ ra trên bảng 1.1

Bảng 1.1: Một số loài rong nâu có hàm lượng fucoidan cao

TT Bộ Loài

1 Order Ectocarpales Adenocystis utricularis

2 Order Chordariales Cladosiphon okamuranus (Okinawamozuku)

3 Order Fucales Ascophyllum nodosum

Fucus distichus L

Fucus evanescens C.Ag.

Fucus vesiculosus

Hizikia fusiformic (Hijiki)

Pelvetia wrightii

Pelvetia canaliculata (Dene and Thur)

Sargassum fulvellum

Sargassum stenophyllum

Sargassum kjellmanianum

Sargassum ringgoldiamum

Sargassum fusiforme

Sargassum siliquastrum

Sargassum thunbergii (Umitoranoo)

Undaria pinnatifida (Wakame)

4 Order Laminariles Kjellmaniella crassifolia

Ecklonia kurome

Chorda filum

Laminaria japonica

Laminaria cichorioides miyabe

Laminaria saccharina (L.) Lam

Laminaria religiosa

Lessonia flavicans

8

Nemacystus decipiens (Itomozuku)

Đặc biệt fucoidan không được tìm thấy ở động thực vật trên cạn. Fucoidan từ

các nguồn chiết khác nhau thì có cấu trúc khác nhau. Hơn thế nữa, cùng một nguồn

fucoidan nhưng phương pháp tách chiết khác nhau sẽ thu được fucoidan có thành

phần khác nhau. Vì vậy, đối với từng loại nguyên liệu khác nhau để chiết được

fucoidan có hiệu suất cao sẽ có phương pháp chiết đặc biệt để chiết chúng. Do đó,

cho đến nay mới chỉ có duy nhất một loại fucoidan được bán trên thị trường đó là

fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus.

Hình 1.1: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus.

9

1.4.2. Laminaran

Laminaran là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thường gọi à

laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là: 1,3 - - D – glucan [30].

Laminaran có hàm lượng từ 1 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào

từng loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của từng loại rong. Thường vào

mùa hè hàm lượng laminaran giảm vì phải tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và

phát triển của cây rong [4].

Laminaran thường được chiết xuất từ rong nâu (Pheophyceae), và đặc biệt là

Fucales hoặc Laminariales.

Laminaran được hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các

liên kết -13 và một ít liên kết -16, gốc đường cuối mạch của một số phân tử

có thể có các gốc manitol (M-series) hay vẫn là glucose (G-series).

Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của

các liên kết -13 và -16 cũng như cách thức nối của các liên kết này trong

chuỗi glucans[32].

Hình 1.2: Cấu trúc laminaran

10

1.4.3. Acid alginic

Alginic là thành phần rất quan trọng trong rong nâu, nó chính là thành phần

làm cho rong nâu có ý nghĩa về mặt kinh tế. Hàm lượng alginic trong các loài rong

nâu khoảng 2 – 4% so với rong tươi và 13 – 15% so với rong khô, hàm lượng này

phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi truờng mà rong sinh sống. Hàm lượng

alginic của rong biến đổi theo thời gian sinh truởng trong năm. Hàm lượng tăng dần

vào đầu tháng 1, tăng cao vào các tháng 3, 4 cũng là thời gian rong phát triển hình

thành các phao bơi và thỏi sinh sản, sau đó hàm lượng giảm dần khi rong già và tàn

lụi [4].

Acid alginic là một polysaccharide mạch thẳng được tạo thành từ hai monome

là axít -D-manuronic (ký hiệu là M) và acid -L-gluronic (ký hiệu là G) được nối

với nhau qua liên kết glycozit (1-4) .Trong phân tử acid alginic các gốc acid này có

thể liên kết với nhau tạo thành các kiểu block: G-block, M-block, MG-block. Sự sắp

xếp các block-M và block-G trong mạch polyme không theo quy luật mà phụ thuộc

vào từng loài rong và chu trình sinh trưởng của chúng [31].

Hình 1.3: Cấu trúc acid alginic

11

Acid alginic không tan trong nước nhưng có khả năng hấp thụ một lượng

nước rất lớn, trương nở và tạo thành dạng bột nhão. Ngược lại, alginat natri, các

muối K+, NH4+, (CH2OH)3NH+ của acid alginic lại tan nhiều trong nước và tạo thành

dung dịch có độ nhớt cao. Alginate là một sản phẩm tự nhiên nên nó có thể bị tiêu

hóa bởi một số loại vi sinh vật hoặc các enzyme thủy phân được phân lập đất, biển

và các loài nhuyễn thể [1].

1.5. Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết từ rong biển

1.5.1. Hoạt tính sinh học của Fucoidan

Hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ (Anticoagulant và

Antithrombotic)

Fucoidan có các hoạt tính sinh học hết sức đa dạng, tuy nhiên hoạt tính

chống đông tụ của nó được nghiên cứu sâu nhất.Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng

hoạt tính chống đông tụ của fucoidan có thể có mối quan hệ với vị trí của nhóm

sulphat, trọng lượng phân tử và thành phần đường. Fucoidan có chứa nhóm sulphat

cao hơn thường có hoạt tính chống đông tụ cao hơn so với fucoidan không có nhóm

sulphat (E. kurome, H. fusiforme, etc.) 16, Error: Reference source not found.

Hoạt tính kháng u

Năm 1937, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã chiết các hợp chất

trong rong nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến acid, đem thử hoạt tính kháng

ung thư và họ cho rằng hai phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình khoảng

13500 Da và 19000 Da có hoạt tính kháng ung thư. Các fucoidan này tương tác trực

tiếp với tế bào ung thư và tiêu diệt những tế bào ung thư này 47.

Theo các nhà khoa học, fucoidan có tác dụng chữa ung thư theo các cơ chế sau:

1) Fucoidan thúc đẩy các tế bào ung thư tự phá hủy. Điều này có nghĩa là

DNA trong tế bào ung thư bị bẻ gãy bởi các enzym trong tế bào làm cho các tế bào

ung thư không có khả năng sinh sản, không hình thành khối u 14.

2) Fucoidan tăng cường hệ miễn dịch nên fucoidan phục hồi lại các tế bào,

tăng cường bảo vệ tế bào bình thường, cảnh giác tế bào lạ 26.

12

Hoạt tính kháng virus

Trong những năm gần đây người ta đã chứng minh được rằng polysaccharide

sulphat (bao gồm fucoidan) biểu hiện hoạt tính kháng vi rút cả invivo và invitro.

Fucoidan của Laminaria japonica có các chức năng kháng loại vi rút RNA và DNA.

Vai trò của Sulphat thì cần thiết cho hoạt tính kháng virut. Hơn nữa, fucoidan còn

có các hoạt tính ức chế chống lại sự sao chép vỏ ngoài một số vi rút quan trọng như

HIV và HCMV 33.

Hoạt tính kháng khuẩn

Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và vi

khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não một

biến chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra. Fucoidan cũng được xem là một

hợp chất điều trị HIV. Fucoidan tăng khả năng sản xuất các dạng interferon kích

hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để đề phòng nhiễm trùng và bệnh tật 21.

Tăng cường tính miễn dịch

Fucoidan kích thích sự sản xuất tế bào miễn dịch giúp cho cơ thể có khả

năng chống lại vi khuẩn, vi rút, kí sinh trùng và ngay cả tế bào ung thư. Các tế bào

diệt tự nhiên là các tế bào làm nhiệm vụ đầu tiên bảo vệ hệ miễn dịch cho cơ thể

con người. Fucoidan chứa các đường đặc biệt làm sản sinh các tế bào diệt tự nhiên

chống tất cả các bệnh. Khi những người sức khỏe yếu sử dụng fucoidan làm tăng số

tế bào diệt tự nhiên giúp cơ thể có khả năng tự bảo vệ 12.

Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu

Các nhà nghiên cứu đã công bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong

biển tác động dương tính lên phản ứng insulin và đường huyết trong các động vật

thí nghiệm. Việc đưa thêm các polysacharide này dẫn đến giảm một cách đột ngột

cân bằng hấp thụ đường. Điều này giả thiết rằng các hợp chất polysaccharide giống

fucoidan làm chậm việc truyền glucose vào máu từ ruột, nhờ vậy giúp giữ mức

đường máu ổn định và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức 28.

13

Bảo vệ dạ dày

Fucoidan với liều lượng thích hợp có tác dụng cải thiện hoạt động của dạ

dày. Fucoidan ngăn chặn sự gắn của một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày

Helicobacteria pylori lên tế bào.

Theo một số nghiên cứu của người Nhật ở Tokyo, việc bổ sung fucoidan

thích hợp có tác dụng cải thiện hoạt động của đường dẫn dạ dày-ruột non. Hơn nữa

các nhà khoa học mới đây đã công bố rằng fucoidan ngăn chặn sự gắn của

Helicobacteria pylori (một loại vi khuẩn gây loét dạ dày) lên tế bào tạo thành lớp

lót dạ dày. Họ đã phỏng đoán rằng hợp chất fucoidan này có thể bao phủ bề mặt vi

khuẩn làm cho chúng khó bám vào các tế bào dạ dày 28.

Trị bệnh về da

Fucoidan thúc đẩy việc sản xuất một protein gọi là integrin làm tăng sự săn

chắc và phục hồi da cũng như thúc đẩy sự co collagen [35].Các chất trong rong biển

có tác dụng giữ ẩm cho da, làm mềm da nên được dùng làm mặt nạ làm mềm da,

giúp da phục hồi, tuơi sang 28.

Trị bệnh khớp

Fucoidan đẩy mạnh về việc tạo ra fibronectin, một glycoprotein với phân tử

lượng lớn có vai trò trong việc giữ cho khớp được bôi trơn và linh động. Fucoidan

cũng có tác dụng tái tạo sụn cho các khớp đau 28.

Trong năm 1995, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng fucoidan giúp đẩy

mạnh việc tạo ra fibronectin, một glycoprotein có phân tử lượng lớn có vai trò quan

trọng trong việc giữ các khớp được bôi trơn và linh động. Nghiên cứu phát hiện ra

sự có mặt của fucoidan đã góp phần cho việc sản xuất bình thường chất này, việc bổ

sung fucoidan có thể có tác dụng hữu ích trong việc tái tạo sụn cho các khớp đau.

Trị bệnh gan

Fucoidan làm tăng đáng kể việc sản xuất HGF là một cytokin rất đặc biệt, nó

không chỉ kích thích việc tái tạo tế bào gan mà đồng thời còn tăng cường việc sản

xuất các tế bào da, tế bào cơ tim, sụn [22].

14

Đến nay sản phẩm fucoidan đã có mặt trên thế giới và được dùng làm thuốc

hỗ trợ sức khoẻ và điều trị nhiều loại bệnh. Ở nước ta chưa có sản phẩm fucoidan

trên thị trường. Do vậy việc nghiên cứu fucoidan trong rong nâu Việt Nam là việc

làm rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học cũng như thực tiễn cao.

1.5.2. Hoạt tính sinh học của Laminaran

Laminaran là thực phẩm chức năng có giá trị dược lý được FDA chấp thuận

trong việc chống đông máu, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu và kích

thích miễn dịch bẩm sinh [43].Gần đây các nhà khoa học nghiên cứu và phát hiện

thấy chất laminaran trong rong biển có thể hỗ trợ, không để tế bào miễn dịch ‘’tử

vong’’, từ đó có tác dụng bảo vệ hệ thống miễn dịch không bị tổn thương dưới tác

động của tia bức xạ. Khả năng chống tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên

nhiên này đem lại niềm hy vọng cho những người đang dung tia phóng xạ chữa trị

các khối u gây ung thư trong cơ thể [49].Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng

sức đề kháng với nhiễm trùng [44] và thúc đẩy sữa chữa vết thương [42].

Laminaran với những đặc tính của một alpha – amylase gây ra kích hoạt các

enzyme có mặt trong quá trình tăng trưởng ở thực vật và sự kích thích của hoạt

động phân giải protein của các tế bào được xử lý. Nên hiện nay laminaran được

nghiên cứu để sử dụng như là một chất thúc đẩy hạt giống nảy mầm và tăng tốc độ

tăng trưởng cây trồng.

1.5.3. Hoạt tính sinh học của acid alginic

Alginat có hoạt tính tẩy xạ. Khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium

bằng đường tiêu hóa, có thể dung alginate Na để đưa ra ngoài cơ thể. Alginat có khả

năng này vì tạo được kết tủa bền với strontium do đó ngăn được sự hấp thụ

strontium vào máu và được thải ra ngoài. Việc dung alginate Na làm chất tẩy phóng

xạ không ảnh hưởng đến quá trình trao đổi Ca và khả năng phát triển bình thường

của cơ thể [50].

Ngoài ra aginat Na còn có khả năng chống đông tụ máu.

15

1.6. Tình hình nghiên cứu về enzyme cắt mạch polysaccharide có nguồn gốc

rong biển

1.6.1. Tình hình nghiên cứu fucoidanase

Những năm trước đây, mặc dù hầu như chưa biết gì về sinh tổng hợp fucan

sunphat hóa, nhưng người ta đã có những hiểu biết về cách phân lập cách phân lập

các loại enzyme có khả năng thủy phân các polysaccharide này từ một số loài vi

sinh vật biển.

Vi sinh vật biển là những nguồn chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học

nhiều triển vọng, bao gồm các enzyme quý hiếm. Một số vi sinh vật biển có khả

năng bẻ ngắn các polysaccharide không tan trong nước như chitin và agar cũng như

các polysaccharide thành tế bào của rong biển và các sinh vật khác. Khi bị phân hủy

rong sẽ trở thành đối tượng tấn công của các vi sinh vật mà có hệ enzyme có khả

năng bẻ ngắn mạch polysaccharide thành tế bào rong về mono- và oligosaccharide.

Các saccharide này được sử dụng như nguồn dinh dưỡng của các vi sinh vật. Vì vậy

những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu nghiên cứu về vi sinh vật

biển sinh enzyme phân cắt Fucoidan. Một số kết quả đã được công bố tuy nhiên các

kết quả này vẫn chỉ ở mức quy mô phòng thí nghiệm, chưa được đưa ra thị trường.

Dưới đây là một số kết quả tổng hợp trên thế giới. (bảng 1.2).

16

Bảng 1.2: Vi sinh vật biển và enzym của chúng 28

STT

Họ Giống Loài Chủng Nguồn PLEnzym

Loại pHotp Totp (oC)

1 Vibrionacace Vibrio n.s N-5 Cát biểnFucoidanase 6,0 40fucosulfatase 7,5

2 Alteromonadaceae

n.s n.s n.s Nước biển ven bờEndosulfated fucan-degesting

6,5-8 30-35

Pseudoalteromonas P.citrea

KMN 3296

Focus evenescensThủy phân liên kết O-glycosidic

n.s <50

KMN 3297

Apostichopus japonicus n.s n.s <50

KMN 3298

Corda filum n.s n.s <40

Saccharophagus S.degradans 2-40 Spartina alterniflora n.s. n.s. n.s.

3 Flavobacteriaceae

Mariniflexile fucanivorans

n.s. SW 5 Cây xử lý nước n.s. 7.5 20-25 °C

Gramella n.s.KMM 6054

Strongylocentrotus intermedius

n.s. n.s. n.s.

Maribacter M. algaen.s. Acrosiphonia sonderi n.s n.s. n.s.KMM 621

S. intermedius n.s. n.s. n.s.

4 Melanconiaceae HyphomyceteDendryphiella arenaria

TM 94 Cát biểnExo-and endotype hydrolysis

6.0 50 °C

5 Sphingomonaceae SphingomonasSphingomonas sp.

PF-1 Nước biểnFucoidanase (endotyp)

n.s. n.s.

17

Hiện nay có 2 loại enzyme tác động lên fucoidan là fucoidanase (EC3.2.1.44)

và α-L-fucoisidase (EC.3.2.1.51). Nếu như hoạt tính của α-L-fucoisidase được mô

tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn cuối của một phân tử

polysaccharide, thì việc xác định hoạt tính của fucoidanase phân giải fucoidan là

không dễ dàng. Fucoidanase có thể bẻ gãy các liên kết glusosit bên trong phân tử

polsaccharide làm giảm nhanh chóng trọng lượng phân tử (endo-fucoidanase) hoặc

ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số phân tử oligosaccharide làm cho trọng

lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase) [18][38].

Một trong những trở ngại trong việc làm sạch fucoidanase là chưa có phép

thử đơn giản nào để có thể nhận biết và định lượng loại enzyme này. Một số

phương pháp đã được sử dụng bao gồm, sự giảm độ nhớt [20], tăng đường khử [45],

kết tủa với albumin [27], sắc ký rây phân tử [13]. Do đó, cho đến nay mới chỉ có 2

enzyme fucoidanase được làm sạch tới trạng thái đồng nhất [15].

1.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme thuỷ phân laminaran

R. Saravanan và cộng sự (2007) đã phân lập và tinh sạch enzyme ngoại bào

(1,3)--D-glucanase từ nấm Trichoderma reesei (3929), một dòng nấm do viện

Công nghệ vi sinh vật Chandigarh, Ấn Độ (Institute of Microbial Technolygy

Chandigarh) cung cấp. Dịch nuôi cấy được tinh sạch qua các bước: tủa bằng

(NH4)2SO4, thẩm tách và thử hoạt tính enzyme dựa trên lượng đường glucose tạo

thành. Trọng lượng phân tử enzyme được xác định bằng phương pháp điện di trên

gel SDS là khoảng 52 đến 62 kDa [34].

Năm 1988, B. Tangarone và cộng sự đã nghiên cứu tinh sạch và xác định đặc

tính của enzyme endo-(1,3)--D-glucanase thu được từ nấm Trichoderma

longibrachiatum. Nhóm tác giả đã nuôi cấy Trichoderma longibrachiatum trong

môi trường chứa nguồn carbon duy nhất là D-glucose, sau đó tiến hành tinh sạch

enzyme từ dịch nuôi cấy. Enzyme thu được có khả năng thủy phân laminaran thành

các phân tử glucose, ditose, tritose, tetratose, pentose và các oligo có trọng lượng

phân tử lớn hơn. Nói chung, loại enzyme này chỉ cắt những phân tử glucan có chứa

liên kết -1,3. Khoảng pH và nhiệt độ tối ưu của enzyme thu được là 4,8 và 55 oC.

18

Trọng lượng phân tử của enzyme được xác định bằng phương pháp điện di trên gel

SDS 12,5% và kết quả cho thấy trọng lượng phân tử của enzyme là khoảng 70 kDa.

Giá trị Km và Vmax đối với cơ chất laminaran lần lượt là 0,16% và 3,170

μmol/phút/mg [6].

Một loại endo-(1,3)--D-glucanase do vi khuẩn Arthrobacter sp. sản sinh ra

đã được Zhongcun Pang và các cộng sự (2004) tinh sạch qua các bước: tủa bằng

(NH4)2SO4, sắc ký trao đổi anion và sắc ký lọc gel. Enzyme tinh sạch được có trọng

lượng phân tử khoảng 32.500 Da (bằng phương pháp điện di trên gel SDS). Enzyme

tinh sạch có pH tối ưu khoảng 6,5 và khoảng pH hoạt động là từ 5 đến 8. Nhiệt độ

tối ưu là 55oC. Hằng số Michaelis Km đối với laminaran là 0,16 mg/ml [46].

Theo M.S. Pesenseva và các cộng sự, tính đặc hiệu và phương thức cắt mạch

của enzyme laminaranase là công cụ quan trọng để nghiên cứu cấu trúc của

laminaran có nguồn gốc từ những loài rong khác nhau. Ngoài ra, quá trình chuyển

hóa laminaran bằng enzyme còn tạo ra các chất mới có hoạt tính sinh học (13);

(16)--D-glucan. Laminaranase là enzyme cắt liên kết -1,3 của laminaran bằng

hai cơ chế. Exo-laminaranase) (EC 3.2.1.58) cắt lần lượt các liên kết từ sau ra trước

của phân tử laminaran, kết quả là tạo thành các sản phẩm thủy phân đơn giản nhất:

các phân tử D-glucose, trong khi đó endo-laminaranase (3.2.1.39) lại thủy phân các

liên kết bên trong mạch laminaran và giải phóng sản phẩm là các oligo-laminaran.

Theo nhóm tác giả này, đã có hai enzyme laminaranase đã xác định được trình tự

amino axit, đó là enzyme từ trứng hải sâm Strongylocentrotus purpuratus và endo-

(13)--D-glucanase từ một loài hai mảnh vỏ Spisula sachalinensis. Hai đối tượng

này thuộc nhóm động vật biển không xương sống, có kích thước và trữ lượng lớn và là

nguồn enzyme laminaranase đầy hứa hẹn.

Ngoài ra, có hai dạng enzyme laminaranase được phân lập từ gan Littorina

kurila (một loài động vật thân mềm). Cả hai loại enzyme này đều đặc hiệu đối với

liên kết -1,3 trong các phân tử glucan. Cả hai enzyme đều có tỷ lệ thủy phân

laminaran và translam (một sản phẩm chuyển hóa của laminaran bằng enzyme) cao

hơn so với các glucan khác (như yeast glucan, lichenan, zymosan,

19

pachiman .v.v…). Một số đặc tính quan trọng chính của hai loại enzyme này cũng

đã được nghiên cứu.

Một trong hai enzyme có trọng lượng phân tử được xác định bằng phương

pháp điện di trên gel SDS là khoảng 36 kDa. Sản phẩm của quá trình thủy phân

laminaran được phân tích bằng máy MALDI-TOF MS, kết quả cho thấy chúng là

các oligosaccharide và glucose. Dựa trên những kết quả này, nhóm tác gỉa đã khẳng

định enzyme laminaranase phân lập từ gan Littorina kurila thuộc loại endo-endo-

1,3--D-glucanase (EC 3.2.1.39). Loại enzyme chiếm một lượng nhỏ còn lại có sản

phẩm phản ứng thủy phân laminaran là các phân tử glucose, vì vậy rất có thể đây là

một exo-1,3--D- glucanase (EC 3.2.1.58).

1.7. Một số ứng dụng của oligosaccharide từ rong biển

Các sản phẩm hữu cơ từ rong biển ngày nay được sử dụng hết sức rộng rãi

trong các ngành như: thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp dệt, nông

nghiệp, công nghệ sinh học và nghiên cứu khoa học

Các polysaccharide từ rong biển được coi là những hợp chất hữu cơ không

thể thay thế trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khi được sử dụng như là chất tạo

đông, làm đặc, chất ổn nhũ và chất ổn định. Giá trị công nghiệp của rong biển là

cung cấp các chất keo rong quan trọng như agar, alginat, carrageenan, furcellazan…

dùng cho thực phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác.

Các oligosaccharide có tác dụng kháng nấm bệnh, ức chế quá trình phát

triển của tế bào ung thư, tế bào HIV...nhiều hợp chất hữu cơ trong rong biển có tác

dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây trồng nên đã được sản xuất thành

phân bón hữu cơ [4].

Ngày nay, fucoidan được sử dụng như là thuốc chống ung thư hiệu quả. Ở

Nhật Bản, người ta đã sản xuất viên nang fucoidan oligosaccharide. Viên nang

fucoidan này có tác dụng như là chất ức chế di căn u mới sinh và chống nấm.

Trên thị trường Châu Âu đã xuất hiện MODIFILAN. Đây là sản phẩm của các

nhà khoa học Nga sản xuất, do nhu cầu bức bách của việc khắc phục các hậu quả

20

của tai nạn nhà máy điện nguyên tử Chemobyl để làm thuốc có tác dụng chống ung

thư.

Công ty cổ phần Fucoidan Việt Nam đã sản xuất ra Fucogastro, viên nang chứa 100 mg fucoidan 80%, chiết xuất từ rong Nâu Việt Nam có công dụng: Tăng cường sức khoẻ, nâng cao khả năng miễn dịch, ngăn ngừa sự hình thành khối u, hỗ trợ điều trị viêm loét và ung thư dạ dày, tá tràng.

Hình 1.4: Sản phẩm MODIFILAN và FUCGASTRO

Ngoài ra còn có một số sản phẩm như: Fucoidan của QINGDAO YIJIA

HUAYI IMPORT AND EXPORT CO.,LTD được sử dụng để phục hồi khả năng

kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virus, điều trị ung thư, tim mạch; Fucoidan

Tongan Limu Moui của AHD INTERNATIONAL, LLC COMPANY trị tim mạch,

chống lão hoá, tăng cường miễn dịch, giảm cân…

21

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguyên vật liệu

Bùn thải từ pilot sản xuất fucoidan chiết xuất từ rong S.mcclurei, Padina, S.

polycystum. Mẫu được thu từ cống thải của pilot sản xuất fucoidan, Viện Nghiên

Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang.

Ngoài ra chúng tôi sử dụng fucoidan chiết từ loài rong S. mcclurei thuộc

ngành rong Nâu để nghiên cứu. Đây là loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và thành

phần đường fucose khá cao (50,51%) nên đã được chọn làm nguồn carbon để phân

lập vi sinh vật, đồng thời là cơ chất để thử hoạt tính enzyme. Bên cạnh đó chúng tôi

sử dụng fucoidan từ rong S. polycystum và S.microcystum để làm cơ chất cho các

thử nghiệm hoạt tính enzyme nhằm so sánh các kết quả. Các cơ chất polysaccharide

khác được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là polymannuronic acid,

lamnianran chiết xuất từ rong polycystum. Tất cả các cơ chất được sử dụng trong

nghiên cứu này do Phòng Hoá phân tích và Triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu

và Ứng dụng công nghệ Nha Trang cung cấp

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan [2]

RongThành phần đường của Fucoidan SO3Na

Acid

uronic

Fuc Xyl Man Glu Gal Rha w/w %

S. microcystum 28.9 6.94 11.27 9.83 30.35 12.72 26.69 21.20

S. polycystum 35.9 6.8 9.6 4.9 33.1 - 25.6 17.87

S. mcclurei 50.51 2.53 12.12 4.04 5.56 25.25 33.15 17.87

Fucus evanesces 87 10 0 0 1 - - -

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật

22

- Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90ml nước biển đã vô trùng, lắc đều rồi

tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau.

- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã được

hấp khử trùng.

- Hút 1 ml ở bình tam giác sau khi lắc đều vào ống nghiệm, thu được dịch mẫu pha

loãng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.

- Từ ống nghiệm 10-1, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách

hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử

trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm

có độ pha loãng mẫu 10-2, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để

có số khuẩn lạc trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng. Do hiếm khi biết

trước được nồng độ vi sinh vật trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau).

Tùy vào số lượng vi sinh vật nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thường

từ 10-3 – 10-8).

- Môi trường phân lập vi sinh vật được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào

các đĩa petri, mỗi đĩa 10 – 15ml. Dùng pipet man hút 0,1 ml dịch đã pha loãng nhỏ

vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang

đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Sau 3 – 7 ngày ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 oC, vi

khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch, ta tiến hành hành quan sát, tách và thuần khiết

khuẩn lạc.

- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa petri cấy

rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho

các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ẩm 30oC. Sau các khoảng thời gian thích

hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng vi sinh vật, tiến hành tinh sạch

nhiều lần.Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ

thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được khuẩn

lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống.

23

- Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc

mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống

thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ

lạnh ở 4oC, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền định kì

để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần khiết cần

được hoạt hóa.

2.2.2. Phương pháp lên men vi sinh vật

Chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc (150 vòng/ phút, ở

nhiệt độ 28-300C, trong 24h), trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan

sạch (được chiết từ rong S. mcclurei) như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất

enzyme cắt mạch fucoidan.

24

2.2.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật

Vi khuẩn được tuyển chọn sau khi lên men, tiến hành tách chiết enzyme từ vi khuẩn theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi khuẩn

Sau 24 giờ lên men, tiến hành ly tâm 3000 rpm/20 phút/4oC. Thu hai phần là

phần dịch nổi và phần sinh khối tế bào.

Phần dịch nổi được dùng để thử nghiệm hoạt tính enzyme fucoidanase ngoại

bào.

Phần sinh khối tế bào: Rửa 2 lần với đệm phosphat 0,02M, pH 7.2 để loại

các thành phần đường, protein bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Phá vỡ màng tế bào

Phần dịch nổi

Thử nghiệm hoạt tính

Môi trường lỏng

Li tâm 3.000 rpm/20 phút/4oC

Phần dịch nổi L1 Phần sinh khối tế bào

Thử nghiệm hoạt tính

Phá vỡ màng tế bào bằng máy nghiền siêu

âm

Phá vỡ màng tế bào bằng N2

Li tâm 10.000 rpm/20 phút

Huyền phù với 1ml đệm phosphate 0,02M

25

bằng máy nghiền siêu âm UZDN-2. Sau đó huyền phù với đệm phosphat 0,02 M,

pH 7.2 tỉ lệ 1:3 (m sinh khối vi khuẩn : v đệm). Đặt dung dịch huyền phù ở 4oC

trong 2 – 4 giờ để chiết enzyme. Tiến hành ly tâm 10.000 rpm /30 phút /4oC.

Thu phần dịch nổi và sử dụng để thử hoạt tính fucoidanase như là dịch

enzyme nội bào.

2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme

Một hỗn hợp dung dịch gồm 100µl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn

đều với 200µl cơ chất fucoidan , polymannuronic acid 2mg/ml, laminaran 1mg/ml

(pha trong đệm phosphate 0.02M, pH 7.2) ủ 4 giờ ở 37oC.

Hoạt tính enzyme cắt mạch polysaccharide được đánh giá là sự tăng đường

khử trong hỗn hợp phản ứng. Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo

phương pháp Nelson-Somogyi[29].

Dưới tác dụng của enzyme thuỷ phân polysaccharide, các loại polysaccharide

bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử. Vì vậy sự gia tăng lượng

đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực

enzyme. Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung

dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O. Tủa Cu2O tan trong thuốc thử arseno-

molybden, tạo thành phức chất màu xanh da trời và phức này hấp thụ cực đại ở

bước sóng 750 nm. Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polysaccharide

thông qua hàm lượng Cu phản ứng.

Một đơn vị hoạt tính fucoidanase (U) được định nghĩa là số μM sản phẩm

đường khử tạo thành trong 1 đơn vị thời gian (4 giờ ở 370C).

26

Đơn vị hoạt tính enzyme được tính theo công thức sau:

U = X / 180

Trong đó, X: nồng độ fucose

U: đơn vị hoạt tính

1 μmol fucose = 180 μg/ml

Hình 2.1: Đường chuẩn fucose.

Đường chuẩn fucose

y = 0.0105x + 0.0329

R2 = 0.995

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 20 40 60 80 100 120

[microgam/ml]

OD

750

27

2.2.5 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp

2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Fucoidan

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ fucoidan thích hợp

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ fucoidan trong môi trường lên

men với thành phần: 10g pepton; o,1g KH2PO4; 0,1g MgSO4.7H2O; 500 ml nước

cất; 500 ml nước biển; nồng độ fucoidan thay đổi từ 0 – 0,03% (SW/v) lên sự sinh

trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật lựa chọn và lên hoạt tính enzyme

fucoidanase.

Tốc độ lắc 150 rpm/phút trong vòng 24 giờ ở 28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo độ đục ở bước sóng

660 nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson.

0,005%0% 0,010% 0,015% 0,020% 0,030%

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nồng độ fucoidan

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Chọn nồng độ fucoidan nuôi cấy thích hợp

28

2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nito

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nguồn nitơ thích hợp

Nuôi cấy lắc chủng vi khuẩn lựa chọn trong môi trường lên men với nồng độ

fucoidan tối ưu. Thành phần môi trường thay đổi nguồn nito: Bactopepton, pepton

thịt, dịch chiết nấm men và đạm vô cơ.

Tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở 28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo độ đục ở bước sóng 660

nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson.

Bactopepton Pepton thịt Dịch chiết nấm men

Đạm vô cơ

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Chọn nguồn nitơ nuôi cấy thích hợp

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nguồn nitơ

29

2.2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy thích hợp

Nuôi cấy lắc chủng vi khuẩn trong môi trường lên men với thành phần môi

trường tối ưu, pH thay đổi từ 6.0 đến 8 với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở

28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn được xác định theo

phương pháp đo độ đục ở bước sóng 660 nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được

xác định theo phương pháp Nelson.

6 6.5 7 7.5 8

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các pH

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Chọn pH nuôi cấy thích hợp

30

2.2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc

Sơ đồ 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ nuôi cấy lắc thích hợp

Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường lên men với tốc độ nuôi cấy lắc

thay đổi từ 80 – 240 vòng/phút trong 24 giờ ở 28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo độ đục ở bước sóng 660

nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson.

10080 120 140 160 180 200 220 240

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Chọn tốc độ nuôi cấy thích hợp

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các tốc độ nuôi cấy lắc

31

2.2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Sơ đồ 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp

Chủng vi sinh vật được lựa chọn được nuôi trong môi trường lên men với

thành phần môi trường tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn. Tốc độ nuôi cấy 180

rpm/ phút ở 28 – 30oC. Quá trình sinh trưởng của chủng vi sinh được xác định theo

phương pháp đo độ đục. Mỗi giai đoạn sinh trưởng thu nhận sinh khối tế bào để

tách chiết và thử nghiệm hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson.

6h0h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Chọn thời gian nuôi cấy thích hợp

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các thời gian

32

2.2.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

2.2.6.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme

Sơ đồ 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính

của enzyme

Enzyme sau khi tinh sạch được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên

hoạt tính fucoidanase.

Một hỗn hợp gồm 50 µl enzyme với 200 µl fucoidanase (2mg/ml) được pha

trong đệm phosphate 0,02M pH từ 3 – 8. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 24 giờ. Xác định

hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson.

43.5 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5

Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson

Chọn pH cho enzyme hoạt động tối ưu

8

Khảo sát hoạt tính enzyme ở các pH

33

2.2.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme

Sơ đồ 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên

hoạt tính enzyme

Một hỗn hợp gồm 50 µl enzyme với 200 µl fucoidanase (2mg/ml) được pha

trong đệm phosphate 0,02M pH tối ưu. Ủ hỗn hợp ở 25 – 50oC trong 24 giờ. Xác

định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson.

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí

nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần

thí nghiệm.

Số liệu được xử lý được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R≥ 0,95.

25oC 30 oC 35 oC 40 oC 45 oC

Khảo sát hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ

Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson

Chọn nhiệt độ cho enzyme hoạt động tối ưu

50 oC 55 oC

34

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.Phân lập các chủng vi sinh vật từ bùn thải trong quá trình sản xuất

fucoidan

Để tiến hành tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cắt

mạch polysaccharide, chúng tôi tiến hành phân lập vi sinh vật từ bùn thải thu từ

cống thải của pilot sản xuất fucoidan ở Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ

Nha Trang.

Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ bùn thải rong nâu

STT Kí hiệu chủng Đặc điểm khuẩn lạc1 SW1 Tròn dẹp2 SW 2 Tròn, lồi, bóng, vàng nhạt3 SW 3 Dẹp, viền răng cưa, không màu4 SW 4 Tròn, bóng, nhỏ, vàng5 SW 5 Tròn, bóng, vàng, màu trắng đục6 SW 6 Nhỏ li ti, màu trắng7 SW 7 Vàng8 SW 8 Dẹp, viền răng cưa9 SW 9 Tròn, dẹp trắng10 SW 10 Màu vàng11 SW 11 Tròn, vàng, bề mặt nhăn nheo12 SW 12 Tròn, dẹp, vàng13 SW 13 Dẹp, viền răng cưa, cam14 SW 14 Trắng sữa, tròn, bóng15 SW 15 Giống xạ khuẩn16 SW 16 Dẹp, viền răng cưa17 SW 17 Trắng sữa, tròn, nhầy, lồi18 SW 18 Tròn, dẹp, viền răng cưa19 SW 19 Trắng lồi, bền mặt nhăn nheo20 SW 20 Tròn, dẹp, bóng21 SW 21 Trắng sữa, bóng, lồi22 SW 22 Vàng, dẹp23 SW 23 Trắng, bề mặt nhăn, dẹp24 SW 24 Bóng, lồi, vàng25 SW 25 Vàng26 SW 26 Vàng27 SW 27 Không màu28 SW 28 Cam29 SW 29 Dẹp, răng cưa30 SW 30 Dẹp vàng

35

Chúng tôi đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn, mặc dù được phân lập trên

môi trường giống nhau nhưng khuẩn lạc có hình dạng khác nhau nên có thể nhận

xét sơ bộ đây là các chủng khác nhau. Các chủng vi khuẩn này được sử dụng để

sàng lọc khả năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharite rong Nâu trên cơ chất

là fucoidan

3.2. Sàng lọc các chủng vi sinh vật theo định hướng sinh enzyme cắt mạch

polysaccharide

Sau khi phân lập được 30 chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành sàng lọc khả

năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch mạch polysaccharite rong Nâu trên từng mẫu cơ

chất là fucoidan cụ thể chiết từ các loài rong khác nhau là : S.mcclurei, Padiana sp,

S.polycystum (các loại fucoidan này được sử dụng làm cơ chất để thử hoạt tính

enzyme), polymannuronic acid và laminaran. Các chủng vi khuẩn được cấy sang

bình tam giác chứa môi trường lên men trong môi trường lỏng, nuôi cấy lắc ở 150

rpm/phút, ở nhiệt độ 28 – 30oC, trong 24 giờ.

Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh enzyme

bẻ ngắn mạch polysaccharite

STT

Kí hiệu chủn

g

Hoạt tính enzyme U/mg proteinFucoidanS. mcclurei

FucoidanPadina sp.

FucoidanS.polycystum F1

PM

Laminaran

1 SW1 0 0 0 0 0,210

2 SW 2 0,226 0,198 0 0 0,3243 SW 3 0 0 0 0 04 SW 4 0 0 0 0 05 SW 5 0,270 0,156 0 0 0,0236 SW6 0 0 0 0 07 SW7 0 0,555 0 0 08 SW8 0 0 0 0 0,0439 SW9 0,602 0,963 0,342 0 0,12310 SW10 0,274 0,456 0 0 0,45611 SW11 0,377 0,589 0 0 0,32112 SW12 0 0 0 0 0,120

36

14 SW13 0 0 0 0 013 SW14 0,308 1,051 0 0 0,23415 SW15 0 0 0 0 016 SW16 0 0 0 0 017 SW17 0 0 0 0 018 SW18 0 0 0 0 019 SW19 0 0 0 0 020 SW20 0 0 0 0 021 SW21 1,263 1,418 0,684 0 0,32122 SW22 0 1,188 0 0 023 SW23 0 0 0 0 024 SW24 0 0,104 0 0 025 SW25 0 0 0 0 026 SW26 0 0 0 0 027 SW27 0 0 0 0 028 SW28 0,248 1,347 0 0 029 SW29 0 0 0 0 030 SW30 0 0 0 0 0

Nhìn vào bảng 3.2, chúng tôi nhận thấy trong 30 chủng vi khuẩn được sàng

lọc thì có 8 chủng vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan của rong

S.mcclurei, 11 chủng vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan của rong

Padiana sp. và 2 chủng vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan của rong

S.polycystum.

Trong đo, 5 chủng (SW9, SW14, SW21, SW22, SW28) là những chủng sinh

enzyme có hoạt tính cao nhất. Enzyme của các chủng vi khuẩn này tác động khác

nhau trên 3 loại cơ chất fucoidan vì fucoidan chiết từ 3 loài rong khác nhau sẽ có

cấu trúc và thành phần khác nhau.

Không phát hiện chủng vi khuẩn nào sinh enzyme bẻ ngắn mạch

polymannuronic acid và có 10 chủng sinh enzyme thuỷ phân laminaran nhưng hoạt

tính không cao.

Enzyme của chủng SW21 tác động lên cả 3 cơ chất fucoidan và đều có hoạt

tính cao nhất, do đó chủng SW21 được coi là chủng có tiềm năng và được lựa chọn

để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Cơ chất fucoidan chiết từ rong S.mcclurei là

cơ chất được sử dụng xuyên suốt trong quá trình nghiên cứu tiếp theo.

37

Hình 3.1: SW21

Hình 3.2: SW9

38

Hình 3.3: SW28

Hình 3.4: SW22

39

3.3. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu để chủng SW21 phát triển và sinh

enzyme fucoidanase hoạt tính cao.

3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ fucoidan

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ fucoidan lên sự sinh tổng hợp fucoidanase của chủng SW21

Nồng độ fucoidan (%) Hoạt tính fucoidanase (U/mg protien)

0 0,123

0,005 0,359

0,010 2,236

0,015 0,854

0,020 0,574

0,030 0,038

Kết quả cho thấy nồng độ fucoidan thích hợp để chủng này phát triển và sinh

tổng hợp fucoidanase là 0,01% (m/v) (Bảng 3.3). Nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất

cảm ứng thì hoạt tính enzym thu được giảm vì khi đó xảy ra hiện tượng ức chế. Do

fucoidan có cấu tạo mạch polymer làm cho độ nhớt môi trường tăng lên và gây ảnh

hưởng đến bề mặt trao đổi chất của vi sinh vật dẫn đến quá trình sinh tổng hợp

giảm.

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Nitơ

40

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự phát triển và sinh tổng hợp fucoidanase của chủng SW21

Nguồn nitơ OD 660nmHoạt tính fucoidanase

(U/mg protein)

NH4NO3 0,382 0

KNO3 0,375 0

(NH4)2SO4 0,420 0

Dịch chiết nấm men 2,504 0,417

Bacto Pepton 2,428 1,792

Pepton thịt 2,303 1,176

Bacto pepton + dịch chiết

nấm men (5:1)2,893 3,076

Kết quả cho thấy nguồn nitơ vô cơ không thích hợp cho sự sinh trưởng và

phát triển của chủng SW21. Dịch chiết nấm men, Bacto pepton và pepton thịt đều

thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Tuy nhiên hoạt tính fucoidanase thu được

tốt nhất khi chủng vi khuẩn này được nuôi trên môi trường chứa Bacto pepton và

dịch chiết nấm 5:1 (Bảng 3.4)

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH

41

pH môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng, tác động sâu sắc đến các

quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Những biến đổi dù nhỏ của các ion (H + và

OH-) trong nồng độ của chứng cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Bên cạnh

đó, hoạt tính enzyme cũng phụ thuộc vào pH của môi trường.Vì vậy, trong thời gian

nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme, việc xác định pH ban đầu và duy trì là cần thiết.

Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển và khả năng sinh enzyme

fucoidanase của chủng SW21

Dựa trên nguồn nitơ và nồng độ fucoidan tối ưu trên, khảo sát ảnh hưởng của

dãi pH từ 6.0 đến 8.0 đến sự sinh tổng hợp enzyme. Kết quả cho thấy chủng SW21

có khả năng sinh tổng hợp enzym cao trên môi trường trung tính. pH thích hợp nhất

cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme fucoidanase của chủng SW21 là 7,0 – 7,5

nên pH này sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc

42

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc lên khả năng sinh enzyme của chủng SW21

Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ khuấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của chủng SW21. Chủng SW21 phát triển tốt hơn khi được

khuấy trộn so với không khuấy bởi vì nhờ khuấy trộn nên các vi khuẩn được tiếp

xúc nhiều hơn với chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Khuấy trộn còn

giúp cho các chất ức chế do chính vi khuẩn này sinh không bám dính vào vi khuẩn

để gây ức chế trở lại. Ngoài ra, khuấy trộn cũng có tác dụng tăng hàm lượng oxy

hòa tan trong môi trường giúp vi khuẩn phát triển tốt hơn.Tuy nhiên ở tốc độ khuấy

trộn cao thì sự phát triển của chủng có phần chậm lại có thể do tốc độ quá cao nên

các hoạt động hấp thu dinh dưỡng, chuyển hóa có thể bị ảnh hưởng.

Qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy chủng SW21có khả năng sinh tổng hợp

enzyme tốt nhất ở tốc độ nuôi cấy lắc là 160 vòng/phút.

43

3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cây quá trình sinh trưởng và tổng hợp fucoidanase

Việc xác định thời gian nuôi cấy của mỗi loài vi khuẩn là rất quan trọng. Nó

cho biết khả năng thích nghi với môi trường cũng như thời gian của các giai đoạn

phát triển của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy. Bên cạnh đó, còn có

thể cho biết thời điểm sinh khối tế bào lớn nhất giúp ta dừng quá trình lên men

trong thời gian hợp lý để thu sinh khối tế bào.

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cây quá trình

sinh trưởng và tổng hợp fucoidanase

Quan sát chủng trong quá trình nuôi cấy, chủng SW21 sẽ phát triển qua 4 pha lien tiếp bao gồm: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha tử vong.

44

Ở pha lag (6h đầu của quá trình nuôi cấy), pha lag được tính từ lúc bắt đầu

cấy giống đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi

khuẩn chưa phân chia, nhưng trọng lượng và thể tích tế bào tăng rõ rệt do trong thời

kì này vi khuẩn đang làm quen với môi trường và chất dinh dưỡng. Kết quả (Hình

3.3) cho thấy, pha lag diễn ra trong vài giờ đầu nuôi cấy.

Đến pha log (từ 6h đến 18h nuôi), nồng độ tế bào tăng nhanh chóng vì sau

pha lag trong môi trường nuôi đã có số lượng lớn các tế bào đã thích nghi. Bên cạnh

đó, đây cũng là thời gian vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào

lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong môi trường. Vì vậy, giai đoạn này

các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số

lượng tế bào tăng theo lũy thừa. Kết quả cho thấy sau 6h nuôi, giá trị OD đo được

của chủng SW21 là 1,61 (đạt 70 % so với giá tri OD cực đại. Ở pha này OD 660 tăng

liên tục, cứ sau 6h nuôi cấy thì giá trị OD660 tăng khoảng 12 ÷ 14% (so với giá trị

cực đại) cho đến khi các chủng phát triển chậm lại sau 18h nuôi cấy. Ở cuối pha

này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào có trạng thái

sinh hóa, sinh lý cơ bản là như nhau và tế bào vi sinh vật đã hoàn thiện nhất cho nên

việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa và sinh

lý của vi sinh vật.

Bước sang pha cân bằng (từ 18h đến 36h nuôi) thì tốc độ sinh trưởng cũng

như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh

ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh

dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Mặc dù ở giai

đoạn này tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây lại là giai

đoạn số lượng tế bào vi sinh vật là lớn nhất nên thường chọn thời điểm trong giai

đoạn cân bằng để thu sinh khối vi sinh vật. Kết quả OD660 nm đo được cũng thể hiện

rõ giá trị OD660 nm ở pha cân bằng lớn hơn so với ở các pha khác và sau 24h nuôi

chủng SW21 có nồng độ tế bào cao nhất.

Pha suy vong ( sau 36h) thì nồng độ tế bào cả hai chủng bắt đầu giảm xuống.

Đến khoảng 41h nuôi thì mật độ tế bào của chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào của

chủng SW21 chỉ còn đạt được 87% (so với giá trị cực đại). Điều này cho thấy vi

45

sinh vật đã đến giai đoạn suy vong do chất dinh dưỡng trong môi trường giảm

xuống, sản phẩm bài tiết quá nhiều, vi khuẩn chết đi và tự phân nhờ các enzyme của

bản thân.. Vì vậy trong quá trình nuôi cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn này.

Từ kết quả thí nghiệm ta thấy khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme của

chủng SW21 tăng mạnh sau 6h nuôi cấy,bắt đầu pha ổn định sau 18h nuôi cấy và

đạt giá trị cực đại sau 24 giờ nuôi cấy lắc (Hình 3.3). Hoạt độ fucoidanase thu được

giảm đi nhanh chóng khi bắt đầu pha suy vong, sau 36h nuôi cấy

3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện xúc tác của enzyme.

3.4.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme

Hình 3.4: pH tối ưu của fucoidanase chiết từ chủng SW21

46

Kết quả nghiên cứu cho thấy pH thích hợp cho hoạt động của fucoidanase từ

chủng SW 21 trong khoảng 6.0-7.5 (Hình 3. 4). Trong đó enzym hoạt động tối ưu ở

pH 6,5.

Kết quả này chúng tôi nhận khác với một số loài vi sinh vật khác như vi sinh

vật biển Vibrio sp. N-5 có pH hoạt động tối ưu là 7,5 [19]. trong khi đó một số vi

sinh vật biển khác lại có pH tối ưu là 6,5-8 Error: Reference source not found. pH

tối ưu cho hoạt động của enzym Fucoidanase của chủng SW21 cũng khác với

Fucoidanase của động vật thân mềm Haliotis sp. là 5,4 [39] và Littorina kurila là

5,6 [23].

3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme

Hình3. 5: Nhiệt độ tối ưu để enzyme fucoidanase từ chủng SW 21 hoạt động

47

Kết quả (Hình3.5) cho thấy fucoidanase hoạt động tốt nhất ở 35oC. Từ 50oC

trở đi enzym bắt đầu bị biến tính nên hoạt tính giảm đi nhanh chóng.

Kết quả chúng tôi nhận được tương tự so với một số công trình của các nhà

khoa học Nhật Bản khi nghiên cứu các enzym fucodanase từ một số loài sinh vật

biển, trong khi một số vi sinh vật biển khác lại có enzym hoạt động ở nhiệt độ tối

ưu là 30-35 [37].

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym fucoidanase của chủng SW21 có

khác biệt với Fucoidanase của động vật thân mềm Haliotis sp. là 38oC [39].

48

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Sau quá trình phân lập và sang lọc khả năng sinh enzyme phân cắt polysaccharide

từ bùn thải trong quá trình sản xuất của nhà máy sản xuất fucoidan, chúng tôi đã thu

được một số kết quả sau:

1. Chúng tôi đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn từ bùn thải trong quá trình

sản xuất fucoidan của nhà máy sản xuất Fucoidan. Trong đó, 5 chủng (SW9,

SW14, SW21, SW22, SW28) có khả năng năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch

fucoidan trên 3 loại cơ chất fucoidan được chiết từ 3 loài rong Nâu

S.mcclurei, S.polycystum, và Padina sp. với hoạt tính cao. Chủng SW21 là

chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao nhất trên cả 3 loại fucoidan.

Enzyme có hoạt tính bẻ ngắn mạch fucoidan đều là enzyme nội bào.

2. Điều kiện lên men tối ưu cho chủng SW21 là:

- Hàm lượng fucoidan 0,01%

- Nguồn nitơ tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp

fucoidanase là hỗn hợp Bacto pepton và dịch chiết nấm men với tỉ

lệ 5:1,

- pH môi trường nuôi cấy là 7- 7.5

- Tốc độ nuôi cấy tối ưu là 160 vòng/phút

- Thời gian nuôi cấy tối ưu là 24 giờ.

3. pH tối ưu cho hoạt động của fucoidanase từ chủng SW21 là 6,5

4. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của fucoidanase từ chủng SW21 là 35oC

4.2 Kiến nghị

1. Định danh chủng SW21

2. Tinh sạch enzyme cắt mạch fucoidan của chủng SW21

3. Nghiên cứu sâu hơn động học của enzyme

49

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Thành phần môi trường phân lập

Môi trường phân lập

Nước cất 500 ml

Nước biển 500 ml

Glucose 1g

Nấm men 1g

MgSO4.7H2O 0,05g

K2HPO4 0,2g

Pepton 5g

Agar 18g

pH 7,5 – 7,8

Phụ lục 2: Thành phần môi trường lên men

Môi trường lên men

Nước cất 500 ml

Nước biển 500 ml

MgSO4.7H2O 0,1g

K2HPO4 0,1g

Pepton 10g

Fucoidan sạch 50 mg

pH 7,0 – 7,2

50

Phụ lục 3: Cách pha hóa chất cho phương pháp Nelson

Thuốc thử Nelson A

Na2CO3 25g

KNaC4H8O6.4H2O 23g

NaHCO3 20g

Na2SO4 20g

Định mức đủ 1 lít

Thuốc thử Nelson B

CuSO4.5H2O 15g

H2SO4 đậm đặc 1 – 2 giọt

Định mức đủ 100 ml

Thuốc thử Nelson C

Dung dịch 1 gồm NH4Mo7O24.4H2O 33g

H2O 50ml

Dung dịch 2 gồm Na2HASO4 9,4g

H2O 50 ml

Trộn dung dịch 1 với 42 ml H2SO4 đậm đặc, sau đó them dung dịch 2, khuấy đều, đưa lên mức 1 lít bằng nước cất và đặt ở 37oC trong 1- 2 ngày trước khi sử dụng

51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Ngô Đăng Nghĩa, Luận án tiến sỹ, Tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất

alginate natri từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng của nó trong một số lĩnh vực

sản xuất, 1999)

2. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sang

(2007), Tạp chí Hóa học, tập 45, số 3, trang 339-342.

3. Phạm Đức Thịnh (2007), ‘Tách chiết và phân tích thành phần các polysacchrid

tan trong nước từ một số loài rong nâu Việt Nam’’, luận văn thạc sĩ, Viện

Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang, Khánh Hòa

4. Trần Thị Luyến – Đỗ Minh Phụng – Nguyễn Anh Tuấn – Ngô Đăng Nghĩa

(2003), Chế biến rong biển, nhà xuất bản Nông nghiệp

Tiếng anh

5. Andrea, et al. (2009), Fucoidan and fucoidanase – focus on techniques for

molecular structure elucidation and modification of marine polysaccharides.

Appl Microbiol Biotechnol 82: 1-11.

6. B. Tangorone, J.C.Royer, J.P. Nakas, “Purification and characterization of an

endo-(1,3)--D-glucanase from Trichoderma longibrachiatum”, Applied and

environmental. Microbiology, (1989), Vol 55, No 1, pp 177 – 184).

7. Bakunina, I.Y., O.I. Nedashkov Shaia, S. A. Alekseeva, E. P. Ivanova, L.A.

Romanenko, N. M. Gorshkova, V. V. Isakov, T.N. Zvyagintseva, and V.V.

Mikhailov (2002), “Degradation of Fucoidan by the marine proteobacterium

Pseudoalteromonas citrea”, Microbiology, 71, 41-47.

8. Berteau O., McCort I., Goasdoue N. et al.,(2002), “Characterization of a new

-L-fucosidase isolated from the marine mollusk Pecten maximus hat

catalyzes the hydrolysis of -L-fucose from Ascophylum nodosum”,

Glycobiology, 12, 273-282.

9. Berteau O., Mulloy B. (2003), “Sulfated fucans and an overview of enzimes

active toward this Review”, Glycobiology B, Vol. 13, N.6, 26R-40R.

52

10. Bilan M. I., Grachev A. A. and Usov A. I. (2004), A highly regular fraction of

a Fucoidan from the brown seaweed Fucus distinchus, Carbonhydr. Res., 339,

511-517.

11. Bo Li, Fei Lu, Xịnin Wei and Ruixiang Zhao (2008), “Fucoidan: Structure

and Bioativity”, Molecules- 13, 1671-1695.

12. Daisuke Tachikawa, Masaji Nakamizo, Makoto Fujii, Anti-Turmo Activity

and Enhancement of NK Cell Activity by Fucoidan, 12th International

Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS, 2004

13. Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J., et al. (1999), “Degradation of algal

(Ascophyllum nodosum) Fucoidan by an enzymatic activity contained in

digestive glands of the marine mollusk Pecten maximus”, Carbonhyd. Res.,

322, 291-297.

14. Dararad Choosawad, Ureporn Leggat, Chavaboon Dechsukhum, Amornrat

Phongdara and Wilaiwan Chotigeat (2005), “Anti-turn our activities of

Fucoidan from aquatic plant Utricularia aurea lour”, SongklanakarinJ.Sei.

Technol., 27, 779-807.

15. Descamps V., Klarszinsky O., Barbeyron J. et al. (1998), “Fuco-

oligosaccharides, enzym pour leur preparation a partir de fucanes, bacterie

productricede l’enzym et application des fuco-oligosaccharides a la protection

des plantes”, Brevet, FR 2783523.

16. Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M. (1989), “Isolation and preliminary

characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides with blood-

anticoagulant activity from seaweed Hizikia fusiforme”, Carbohydr. Res., 194,

315-320.

17. Fujimura, T.et (2000), “ Fucoidan is the component of focus vesiculosus that

promotes contraction of fubroblast – populated collgen gels’’, Biological

Pharmacology Bulleton, 23, pp 1180 – 1184

18. Furukawa S, Fujikawa T, Koga D, Ide A (1992), “Production of Fucoidan-

degrading enzyms, Fucoidanase and Fucoidan sulfatase by Vibrio sp. N-5”,

Nippon Suisan Gakkaishi, 58, 1499–1503.

53

19. Furukawa, S.; Fujikawa, T.; Koga, D.; Ide, A. (1992), “Purification and some

properties of exo-type Fucoidanases from Vibrio sp. N-5”, Biosci. Biotechnol.

Biochem.,56, 409-494.

20. Kitamura K, Matsuo M, Yasui T (1992), “Enzymic degradation of Fucoidan

by Fucoidanase from the hepatopancreas of Patinopecten yessoensis”, Biosci

Biotechnol Biochem, 56, 490–494

21. Kloareg, B., Dematry, M., and Mbeau, S (1986), “Polyanionic characteristic of

furified sulphated homofucans from brown algae”. Int.J.Bio Macromol-8,pp

380-386.

22. Kobayashi T, Honke K, Miyazaki T, Matsumota K, Nakamura T, Ishizuka I,

Makita A (1994), “Hepatocyte growth factor (HGF) specifically binds to

sulfoglycolipids”, J.Biol chem-269, pp9817-9821

23. Kusaykin, M.I.; Burtseva, Y.V.; Svetasheva, T.G.; Sova, V.V.; Zvyagintseva,

T.N. (2003), “Distribution of O-glycosylhydrolases in marine invertebrates.

Enzyms of the marine mollusk Littorina kurila that catalyze Fucoidan

transformation”, Biochemistry (Moscow), 68, 317,324

24. Maria E.R. Duarte,a Marc A. Cardoso,a Miguel D. Noseda,a,1 Alberto S.

Cerezo (2001), “Structural studies on Fucoidans from the brown seaweed

Sargassum stenophyllum”, Carbohydrate Research 333, pp 281–293

25. Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E,

Nifantiev and Anatolii I. Usov (2006) “Structure of a Fucoidan from the brown

seaweed Fucus serratus L”, Carbohydrate Research 341, pp 238-245

26. Maruyama, Hiroko, Tâmuchi, Hidekazu; Hashimota, Minoru; Makano,

Takahisa (2003), “Antitumor activity and immune response of Mekabu

Fucoidan extracted from sporophyll of Undaria pinnatifida”, In Vivo, 17(3),

245-249.

27. Morigana T, Araki T, Ito M, Kitamikado M (1981), “A search for Fucoidan-

degrading bacteria in coastal sea environments of Japan”, Bull Jpn Soc Sci

Fish, 47, 621–625

28. Mülheim an der Ruhr (2009), “Isolation, Characterisation, Modification an

Application of Fucoidan from Fucus vesiculosu”.

54

29. Nelson TE (1944),“A photometric adaptation of the Somogy method for the

determination of glucose”, J. Biol. Chem. 153: 375–381.

30. Nomenclature of Cabonhydrates ( Recommendations 1996).

31. Painter, T.Alga Polysaccharides. In The polysacchrides, Aspinall, G.O.Ed

Academic Press, Orlando, II, 196-285, 1983

32. Percival E.Algal polysaccharides.//In: The Carbohydrates. (Chemistry and

Biochemistry). (W.Pigman, D.Horton eds.) – 1970.-N.Y.: Acad. Press.-

V.IIB-.P.541-544)

33. Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B. (2003), “Fucoidans from the

brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity

and structural studies”. Carbohydr. Res., 338, 153-165.

34. R. Saravanan et al, “Isolation and Partial purification of extracellular enzyme

(1,3)--D-glucanase from Trichoderma reesei (3239)”, Biotechnology 6(3)

(2007), pp 440 – 443).

35. Rita Elkins M.H (2001), “Limu Moui-prize sea plant of tonga and the south

pacific”, Woodland Publishing-Utah-USA 32 pagine

36. Sakai T, Ishizuka K, Kato I (2003b), “Isolation and characterization of a

Fucoidan-degrading marine bacterium”, Mar Biotechnol 5, 409–416.

37. Sakai, T.; KaSWai, T.; Kato, I. (2004), Isolation and characterization of a

Fucoidan-degrading marine bacterial strain and its Fucoidanase, Mar.

Biotechnol, 6, 335-346.

38. Tanaka K., Sorai S. (1970), “Hydrolysis of Fucoidan by abalone liver α-L-

fucoisidase”, FEBS Lett., 9, 45-48

39. Thanassi, N.M.; Nakada, H.I. (1967), “Enzymic degradation of Fucoidan by

enzyms from the hepathopancreas of Abalone, Haliotus Species”, Arch.

Biochem. Biophys., 118, 172-177

40. Vedrenge M. Erlandsson – Harris H. Tarkowski A (2000), “Role of selectins

in experimental Staphylococcus aureus – induced arthritis’’ European Journal

of Immunology – 30, pp 1606 – 1613.

41. W.A.P.Black (1952), “Laboratory - Scale Isolation of Fucoidin from Brown

Marine Algae”, J.Sci.Fd.Agric, pp3-122.

55

42. Wei D, Zhang L, Williams DL, Browder IW (2002) glucanstimulates human

dermal fibroblast collagen biosynthesis through a nuclear factor-1 dependent

mechanism. Wound repair regen. 10:161 – 168.

43. William DL (1997), Overview of ( 1 fi 3)- -D-Glucan immunobiology,

Mediat, Inflamm, 6:247 – 250

44. Williams DL, Mueller A, Browder Ư (1996), Glucan-based macrophage

stimulators: a review of their anti-infectivepotential, Clin, Immunother. 5: 392

– 399.

45. Yaphe W., and Morgan K. (1959), “Hydrolysis of fucoidin by Pseudomonas

atlantica and Pseudomonas carrageenova”, Nature, 463, 761-762

46. Zhongcun Pang, Kodo Otaka, Yasunori suzuki, Kyoji Goto, Masatake Ohnishi,

“Purification and characterization of an endo-(1,3)--D-glucanase from

Arthrobacter sp.”, Journal of Biology. Macromol, 4 (2) (2004), pp 57 – 66.)

47. Zhuang, Cun; Itoh, Hiroko, Mizono, Takashi Ito, Hitoshi (1995), “Antimor

active Fucoidan from the brown seaweed, Umitoranoo (Aargassum

thunbergii)”, Biosci Biotech Bi, , 9, 563-567.

48. Zvyagintseva T.N, Shevchenko N.M, Nazarenko E.L, et al.,(2005), Swater-

soluble polysaccharides of some broSWn algae of he Russian Far-East.

Structure and biological action of low-molecular mass polyuronans. Journal of

Experiment Marine Biology and Ecology 320 123-131

49. http://www.hoalinhpharma.com.vn/Desktop.aspx/ND-Cam-nang-SK/Dinh-

duong-an-toan-hop-ly/Thuc_pham_chong_viem_nhiem_trong_co_the/.

50. http://www.wattpad.com/858818-hoa-hoc