LEZIONE Terapia Genica PDF
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Modelli di terapia genica
Modelli di terapia genica
� Definizione e background
� Strategie di terapia genica
� Sistemi di rilascio
� Esempi di trials clinici
� Prospettive future
Molte patologie, dovute a proteine malfunzionanti,non sono trattabili con terapie tradizionali
Negli anni ‘70 nasce l’idea della Terapia Genica
(rilascio intracellulare di materiale genetico per generare un effetto terapeutico, con diverse strategie di
intervento a seconda dello scopo prefissato)
Terapia Genica: perché ?
DNA e mutazioni
ACGT
Proteina anomalaSequenza mutata
Ala CysAsnAspLys …GCAGCA AAAAAA GATGAT AATAAT TGTTGT
� 3 miliardi di basi (A,C,G,T)� circa 30.000 geni� circa 250.000 proteine
GENOMA UMANO
ereditarie (patologie genetiche)acquisite (tumori)dovute a virus (malattie infettive)
MUTAZIONI
Patologie bersaglio
� Multifattoriali
Malattie cardiovascolari e neurodegenerative - Diabete -Artrite reumatoide
� Tumorali
Leucemie - Carcinomi
� Infettive
AIDS - Epatite B e C
� Acquisite
Traumi (fratture ossee, ferite, ustioni) - Ischemie
� Monogeniche
Immunodeficienze - Distrofia muscolare - Fibrosi cistica - Emofilie Retinopatie - Emoglobinopatie - Ipercolesterolemia fam - Xeroderma pigmentosum
Terapia genica: quale tipo?
SOMATICA
manipolazione dell’espressione genica in cellule differenziate
dell’individuo adulto
l’alterazione genica riguarda esclusivamente il paziente su cui è
stata realizzataeventuali modificazioni geniche
verrebbero trasmesse alla progenie
non autorizzata !!!!
manipolazione dell’espressione genica in cellule riproduttive
GERMINALE
ex vivo
Le cellule bersaglio sono prelevate dal paziente,
modificate geneticamente in laboratorio e reintrodotte nello
stesso individuo
in situ
il transgene vienerilasciato localmente nel sito di azione mediante
iniezione i.m. o intratumorale o per
inalazione ecc…
in vivo
il transgene viene somministrato per via sistemica e.v.
nel corpo del paziente
� no problemi immunologici
� efficienza delle metodiche di trasduzione in vitro
� solo alcune malattie (immunologiche, ematologiche,
metaboliche)
� tumori localizzati; patol. dell’apparato respiratorio; tessuto
cutaneo ecc…
� cellule e tessuti poco accessibili
� scarsa efficienza di trasduzione, barriere
Terapia genica: come?
TERAPIA GENICA: come ?
Rilascio gene modificato Rilascio cellule modificate
in vivoex-vivo
Trasferimento
Genico in vivo Aerosol
Perfusione organo
Iniezione diretta(miocardio)
Via sistemica
elettroporazione
Uso di cateteri(tumori solidi)
TERAPIA GENICA: come ?
Vettore per rilasciare e proteggere il gene terapeutico
DNA nudo elettroporazione pistola genica microiniezioneliposomi
non-virali
adenovirus adenoassociati retrovirus lentivirus herpesvirus
virali
Differenze nei sistemi di rilascio
integrazione del transgene nel genoma ospita � espressione stabile
il transgene non si integra nel genoma � espressione temporanea
DNA nudo e metodi fisici
Vantaggi
� assenza di immunogenicità� alta efficienza ex-vivo� rilascio di grossi geni� utile per le vaccinazioni a DNA
Svantaggi
� instabilità nella maggior parte dei tessuti� espressione transitoria � in vivo solo per tessuti superficiali (cute),
muscolo, cuore, fegato
Iniezione diretta
Elettroporazione
Pistola genica
Microiniezione
Cromosomi Artificiali (MACs)
Vantaggi
� capacità di trasportare grossi geni� mantenimento autonomo� espressione genica regolabile
Svantaggi
� difficoltà di costruirlo in laboratorio � difficoltà di rilascio per le sue dimensioni
Vettori chimici
Vantaggi� non contengono geni virali � limitata immunogenicità� anche costrutti molto grandi
Svantaggi
� poco efficienti nel rilascio genico in vivo� espressione transitoria� difficoltà a rilasciare il DNA nel nucleo
Liposomi
+ + + +
DNA-
--
-
liposomes
-
Vettori virali
Adenovirus
AAV*
Retrovirus* Herpes-simplexvirus
Lentivirus*
Svantaggi
� reazione immunitaria� tossicità� integrazione random/mutagenesi inserzionale*
Vantaggi
� altamente efficienti nel trasferimento genico� espressione a lungo-termine*
� di facile produzione e in elevate quantità
� esprimibile per un lungo periodo e regolabile
� sicuro, cioé inerte dal punto di vista immunologico
� selettivo per determinati tipi cellulari
� capace di trasportare geni piccoli e grandi
� capace di integrarsi in siti specifici del genoma
� capace di infettare sia cellule in divisione chequiescenti
Vettore ideale
Strategie di terapia genica
introduzione di copie funzionali del gene difettivo o assente
� Compensazione genica
correzione del gene difettivo� Riparo genico
prevenzione del riconoscimento deitessuti da parte dell’organismo
� Anti-infiammatoria
introduzione di geni che producono anticorpi intracellulari� Anticorpale
interruzione del nutrimento ai tumori� Anti-angiogenica
introduzione di “geni suicidi” cheproducono tossine o pro-farmaci
� Suicida
introduzione di RNA antisenso perinibire l’espressione genica
� Inattivazione
introduzione di geni che inattivanoagenti infettivi
� Vaccinazione
� Terapie cellulari trapianto di cellule geneticam modif
patologie infettive (++AIDS, epatite)
patologie autoimmuni
patologie tumorali
patologie ereditarie (mendeliane)
tp. compensativa
tp. riparativa
tp. ablativa – suicida– di inattivazione– anticorpale– anti-angiogenetica
immunoterapia
tp. anti-infiammatoria
trapianti cellulari
patologie acquisite(traumi, ischemie ecc)
patologie multifattoriali (neurodegen, diabete ecc)
Strategie e patologie
Strategie a confronto
espressione della proteina normale
gene X
gene mutato � no proteina
Compensativa (x patologie AR. Trials clinici:FC, emofilia, SCID)
gene X
gene mutato � no proteina
m mm
wt
X Xwt
m
gene correttowt
espressione della proteina normale
wt wtwt
Riparo (anche x patologie AD da gain-of-function)
SOLO DNA GENOMICO CORRETTO
FRAMMENTI DI DNA
DNA GENOMICO MUTATO e DNA INSERITO
RIPARO GENICO RILASCIO GENICODNA NUDO CROMOSOMI ARTF
o PLASMIDI
SOSTITUZIONE OMOLOGA
INTEGRAZIONE DELTRANSGENE
MANTENIMENTO DELTRANSGENE
RILASCIO DI DNA TERAPEUTICO MEDIANTE MICROINIEZIONE
Riparo genico
� Mantiene il gene integro
� Mantiene la relazione tra sequenzeregolatrici e codificanti
� Assicura un livello di espressioneaccurato
� Dovrebbe essere a lungo-termine
Vantaggi
� Efficienza può essere bassa
� Rischio di mutagenesi inserzionale
� Degradazione del DNA terapeutico
Svantaggi
CELLULABERSAGLIO
VETTOREVIRALE
RISULTATOATTESO
cellula epitelio respiratorio
TERAPIA GENICACOMPENSATIVA
per patologie ereditarie
ganciclovir
cellula tumorale
ganciclovir-fosfato
timidin-kinasiVETTOREVIRALE
CELLULABERSAGLIO
RISULTATOATTESO
TERAPIA GENICAABLATIVAper patologie
tumorali
Strategie a confronto
Cellule Tumorali: caratteristiche
Cellulealtamenteproliferanti
Effetto“spettatore”
Terapia suicida
� Successivo trattamento conun pro-farmaco non tossico(es. Gangiclovir) che vieneconvertito selettivamentenella forma tossica (Gangiclovir-P) dal DME
� Conosciuta anche come terapia attivante un profarmaco (GPAT)
� Introduzione in cellule bersaglio di un gene che codifica per un enzima (es. HSV-TK) metabolizzante un farmaco (DME)
AAAmRNA
ODN antisensoRNA antisenso
ribozimasiRNA
AAA
ibrido RNA-DNA � Rnasi Hinibizione della traduzione
taglio diretto dell’mRNA
mutagenesi mirata ODN
gene mutato (es. HIV) filam.anti-senso(stampo)
filam. senso
TFO (elica triplice)
Inattivazione Genica
no RNA
Inattivazione Genica: RNA
1. Oligonucleotide antisenso
2. Ribozimi
� Interferenza mediata da RNA (RNAi) è un nuovo meccanismo per il silenziamento genico specifico
� Meccanismo evolutivam conservatocome linea di difesa contro virus
� Si legano all’mRNA complementaree lo inattivano in maniera specifica
� Uso di siRNAs sintetizzati chimicamcome nuova metodica di RNA terapeutico
Inattivazione genica: RNA
3. RNA interference
Terapia genica in Cellule Staminali
Cellula staminale CSE
Introduzione del gene terapeutico
Gene terapeutico verrà espresso in tutte le cellule del sangue
Perché usare le cellule staminali ematopoietiche?
� Cellule che si autorinnovano: nessuna necessità diripetute somministrazioni
� Poco numerose e facilmente rimovibili
� Facilmente identificabili, manipolabili e reintroducibili
� Il gene terepautico risiederà in tutte le cellule derivate
� CSE possono migrare in numerosi distretti corporei(midollo osseo, fegato, milza, linfonodi) e funzionare come vettori di trasferimento genico
Bersagli di Terapia Genica con CSE
� Malattie monogeniche SCID, ADA-SCID, malattia di Gaucher,Sindrome di Hurler, anemia di Fanconi,Malattia granulomatosa cronica
� Trapianti e tumori Marcatori genici, geni-suicida,geni di resistenza ai chemioterapici
� Immunoterapia Vaccini a DNA/RNA, recettori chimerici cellule T
� Sindromi daimmunodeficienzaacquisita (HIV)
Riboenzimi catalitici, RNA antisenso, repressori dominanti di geni HIV, RNA decay
SUCCESSI
� ADA-SCID, Aiuti, 2002� X-SCID, Hacein-Bey-Abina, 2002� Epidermolisi bullosa, De Luca, 1998� Ferite epidermide, Quesenberry, 2002
POTENZIALITA’
� Malattie metaboliche� Malattie ematologiche � M. Parkinson � M. di Alzheimer � Infarto� Diabete � Artrite reumatoide
� Trapianti cellulari� Trapianto cellule staminali geneticamente modificate ex-vivo
Terapia cellulare
Trials clinici
Tumori cerebrali
Carcinomi renali
Melanomi
Neuroblastomi
Leucemie mieloidi croniche
Ipercolesterolemia familiare
Fibrosi cistica
Emofilia A e B
Emoglobinopatie
Malattie metaboliche
ADA e X-SCID
Malattia emorragica X-linked dovuta a mutazioni nel gene per fattore VIII
incidenza: 1/5000 maschi
elettroporazione DNA plasmidico in fibrablasti da 6 pazienti con emofilia grave A
Fattore VIII � buon candidato per terapia genica:- l’espressione non è influenzata dagli episodi di
sanguinamento- non rischio di “overdose”- espressione organo-specifica non richiesta- anche bassi livelli possono dare benefici clinici
in 4 / 6 pazienti ���� incremento significativo dei livelli di fattore VIII nel sangue ���� riduzione degli episodi di sanguinamento, minor uso di fattore
VIII esogeno
Terapia genica: es. Emofilia A
� Buoni risultati in modelli animali
� Pochi esempi di risultati a lungo termine nell’uomo(X-SCID, ADA-SCID, Emofilia A)
� Procedure di rilascio genico relativam sicure(sviluppo risposta infiammatoria sistemica, sviluppo di leucemia)
� Alcune patologie più facilmente trattabili
� Alcune aree più promettenti(vaccini a DNA, angiogenesi per m. cardiovascolari, trapianti cell)
Terapia genica: risultati
Limiti attuali
bassa efficienza di rilascio genico
bassa specificità di bersaglio
espressione transiente e non-fisiologica
reazione immunitaria contro i vettori
Prospettive future
sviluppo di nuovi vettori
sviluppo di strategie cellulo-specifiche
approcci di gene-targeting
sviluppo di vettori non-immunogenici
Terapia genica: limiti e prospettive
� comprensione dei meccanismi patofisiologici della malattia
� individuazione dell’appropriato bersaglio cellulare
� individuazione del metodo di trasferimento ottimale
� creazione di un modello animale della patologia per studi pre-clinici in vivo
Terapia genica: passaggi-chiave
Sicurezza e Terapia Genica
Necessità di procedimenti sicuri e criteri selettivi nella scelta dei pazienti
- Si riteneva comunemente che la terapia genica somatica per il trattamento di una malattia grave fosse un’opzione terapeutica corretta dal punto di vista etico: i benefici erano ritenuti maggiori di costi e rischi, per malattie mortali o terminali.Il 17 Settembre 1999 Jesse Gelsinger muore a causa di una risposta iperimmune contro la grande quantità di vettore necessaria per una terapia non mirata: il consenso generale è messo in discussione.Jesse Gelsinger, 18 anni, è relativamente sano ed ha una forma lieve di deficienza parziale di ornitina transcarbamilasi (OTC) che poteva anche essere controllata con la dieta e con i farmaci (anche se con un regime molto stretto). In questa malattia, per una incapacità a demolire correttamente le proteine della dieta si ha accumulo tossico di ammoniaca
- Integrazione retrovirale in vicinanza di un oncogene e sviluppo di leucemia in trial clinico per X-SCID (2/15 pazienti)
Il successo della terapia genica dipenderàdalla collaborazione di più specialisti e
dall’utilizzo dell’appropriata combinazione strategia/vettore
per il trattamento di ciascuna patologia
CONCLUSIONI
Non esiste una “pallottola magica” valida per tutte le patologie
Distrofinopatie:trials innovativi
short arm, Xp21
Genome size: 2.5 Mb
79 constitutive exons (1% of the gene)
very large introns and non-coding regions (99% of the gene)
7 promoters (3 driving full length isoforms)
Il gene distrofina
1B 1M 1P 2a 4 9 19 29 44 55 62 68 70-75 78
5’ 3’B M P R B3 S G
La distrofina : dove si esprime
SkM
Heart
� Dystrophin is virtually absent in skeletal muscle of Duchenne patients, in rare cases strongly reduced (rare revertant fibers)
� Dystrophin is present though qualitatively and quantitatively reduced in skeletal muscle of Becker patients
Come distinguere fra Becker e Duchenne
CTRL BMD DMD
revertant fibers (courtesy of Patrizia Sabatelli)
NucleusNucleus
Extracellular MatrixExtracellular Matrix
Outer nuclear membrane
TNNT2TNNT2TPM1TPM1TCAPTCAP
LMNALMNAInner nuclear membrane
TTNTTN
Collagen VI
Laminin 2
δδδδ ββββ γγγγ ββββααααSGCDSGCD
DYSDYS
αααα Integrin SarcolemmaSarcolemma
CostameresCostameres
DESDES Sarcoplasmic Reticulum
Ca2+
Mithocondria
SarcomereSarcomere
Ca2+
Z disc
Z line
I band
M line
A band I band
Z line
Cytoplasmic actin
DSPDSP
MVCLMVCL
PLNPLN
Cytoplasmic actin
CLPCLPLDB3LDB3
MYH7MYH7MYBPC3MYBPC3
ACTCACTC
CTF1CTF1TAZ TAZ
ABCC9ABCC9
EYA4EYA4
DYSDYS
T-tubule
Lancet, 2005
La ricerca
Modulare mutazioni della distrofina con oligonucleotidi antisenso (AONs) >>exon skipping
Come funzionano gli ANTISENSO
LA RICERCA : UTILIZZO DI NANOPARTICELLE PER VEICOLARE OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
•NANOPARTICELLE ( 500nm)
RR
RR
RR
R
R
R
R
R
RR
RR
R
R R
R
R RR
R
R
++
++
+
+
+
+
+
++
++
+
++
+
T1-AONs : IL LEGAME
LE NANOPARTICELLE T1 LEGANO GLI ANTISENSO
ArON
T1 Fluorescenti (T1-fluo) Al microscopio elettronico
ESPERIMENTI NEL TOPO MDX
EPSERIMENTO NEL MODELLO ANIMALE DI DISTROFINOPATIA (MDX)
ANTISENSO SU ESONE 23 (DOVE èPRESENTE LA MUTAZIONE DEL TOPO)
INOCULO SISTEMICO INTRAPERITONEALE
STUDIO DELLA PROTEINA NEI TESSUTI DEL TOPO
STUDIO DELL’RNA
diaphragm
gastrocnemius
quadriceps
C57BL6 mdx group 1 (day 21)
mdx group 1 (day 60)
mdx group 2 (day 21)
RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO
C57BL6mdx group 1
(day 21)
diaphragm
gastrocnemius
quadriceps
mdx group 1 (day 60)
RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO
A B C D
C57BL6mdx group 1
(day 21)mdx group 1
(day 21)mdx group 4
(day 21)
RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEL CUORE DEL TOPO TRATTATO
COME SI DIFFONDONO LE NANOPARTICELLE CON LEGATI GLI ANTISENSO
DIAFRAMMA
CELLULE DELLE PARETI DEI VASI
VASI LINFATICI
CELLULE DEL MESOTELIO
Fegato
Milza
ALTRI ORGANI: NON SEGNI DI TOSSICITA’
Altre strategie terapeuticheUp-regulation of functional analogues fo dystrophin (utrophin)
Gene therapy
Cell therapy
Molecular Therapy
(Antisense)
gentamicin (1996-1999)
PTC124 (pilot trial in progress)
“somatic cell gene replacement”� cDNA distrophin (13.9 Kb) in gutted adenovirus (g-AV)
� cDNA distrophin 6.3 Kb in viral vector (AV adenovirus I)
� cDNA distrophin 4.3 Kb (micro dystrophin) in adenoassociated virus (AAV)
Gene therapy
ADVANTAGESADVANTAGES
ONCE-IN-MAN THERAPY (stable therapy)Correct localization of dystrophin (gastrocnemius and tibialis anterior)Correct localization of glycoprotein complex
DISADVANTAGESGreat immuno response!!Requires chronic immunosuppression!!Low availability of viral vectorsGenome integration (side effects)Systemic delivery: no ideas about the late-onset side effects
CELL THERAPYCELL THERAPY
Heterologous cells-mesangioblasts (perycites) injection in dystrophic dogs (golden retriever)-rescue of dystrophin protein synthesis and localisation both in heart and skeletal muscles-reduction of necrotic and inflammatory changes at the morphological analysis of the treated dogs
CELL THERAPYCELL THERAPYADVANTAGESADVANTAGES
OnceOnce--inin--man therapyman therapyUseful potentially for all muscular disordersUseful potentially for all muscular disorders
DISADVANTAGESDISADVANTAGES--safety issues: unknown!safety issues: unknown!
--side effects: theoretically manyside effects: theoretically many--staminal cellsstaminal cells--related trouble (proliferation)related trouble (proliferation)
--heterologous cells: chronic heterologous cells: chronic immunosoppressionimmunosoppression
Terminato nel 2009Dati non ancora disponibili
PTC124
USA company is contacting european groups for a trial for nonsense mutations
Coordination: PTC Therapeutics (US)
PTC124 (gentamicin analogue): read through premature termination codonsPTC124 targets genetic disorders caused by nonsensemutations (Nature, 2007)
PTC124: it may correct nonsense mutations only
PTC124 Stop mutations correction
� Stop (nonsense) AAGGTCTGTTCACCCATTATC
AAGGTCTGTTGA (stop)
Lead to TRUNCATED non functional proteins (generally DMD phenotype)
PTC124: drug able to convert a PREMATURE STOP CODON (TGA, TAA, TAG) in a SENSE codon.
Ribosomal correction (post-transcriptional)
PTC124 (gentamicin analogue): read through premature termination codons
Pre-trial studies in mdx preliminary results: dystrophin rescue up to 5% in mdx treated for 8 weeksNo side effects.
US Multicentric trial (Italy : E.Mercuri, P.Comi and E.Bertini)oral administrationperiod: 6 months-1 year
Limitations: low efficiency of dystrophin rescueSide effects: none known
Prosensa “first in man”trial
PRO051 drug:5’ UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU 3’IC:at least 50% of spared muscle
Concurrent glucocorticoid treatment
0.8 mg of PRO051IM injection
Dystrophin rescue 40-60%Mild side effects
Conclusioni
-primi trial nell’uomo con antisenso e PTC124 giàeffettuato in Olanda e USA
Ma sono necessari:
-ulteriori studi per cercare sistemi di rilascio -accurata valutazione delle efficacia e tossicità
-ricerca di biomarkers