Biotecnología y ADN recombinante

Desde hace miles de años , la humanidad ha venido realizando biotecnología , hasta la época moderna de un modo empírico , sin base científica :

1-     La domesticación de plantas y animales ya comenzó en el periodo Neolítico.

2-     Las civilizaciones Sumeria y Babilónicas ( 6000 a.e) , ya conocían como elaborar cerveza.

3-     Fabricación de quesos.

4-     Cultivo de champiñones. 5-     Alimentos y bebidas fermentadas.

Por supuesto, hasta la llegada de la moderna biología, y en muchos casos hasta el siglo XIX, la base de muchos de estos procesos era desconocida. De hecho, solamente en el siglo XVIII cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada.

La biotecnología, en un sentido amplio se puede definir como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios. 

Pero incluso bien avanzado el siglo XX, cuando la Genética había resuelto el misterio de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que había para actuar sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), selección de los individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con agentes físicos (rayos UV, rayos X) o químicos, con ulterior búsqueda (selección o rastreo -screening) de alguna variante de interés (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.

Debemos esperar a la década de los 70 para que surja un conjunto de técnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la vida. Son técnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseños previos y objetivos concretos (de ahí el nombre popular de Ingeniería Genética).

La Ingeniería Genética (I.G.), mejor llamada tecnología del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho.

La actual biotecnología es una empresa intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reunión de conceptos y metodologías procedentes de numerosas ciencias para aplicarlas tanto a la investigación básica como a la resolución de problemas prácticos y la obtención de bienes y servicios.

Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnología:

1-     Microbiologia. 2-     Genetica . 3-     Bioquimica. 4-     Biologia Celular. 5-     Quimica. 6-     Ciencias y teconologia de alimentos.

El avance de la biotecnología dependerá cada vez más de esta colaboración entre disciplinas, y en el uso de lenguajes y paradigmas comunes, así como en que cada tipo de especialista comprenda los logros y limitaciones de las otras ramas biotecnológicas.

Ingeniería genética

Aunque la Genética es la base de toda la Biología, su desarrollo como ciencia es de los más tardíos. Veamos esquemáticamente algunos eventos esenciales para entender el surgimiento de la tecnología del ADN recombinante:

1- A partir de 1865, Mendel establece las bases de la genética. En sus famosos experimentos con el guisante, descubrió el modo de transmisión de ciertos caracteres desde una generación a las siguientes, y su "mezcla" en el aporte materno y paterno.

2- Los hallazgos de Mendel permanecieron en el olvido hasta 1900.

3- En 1909 se acuña el término "gen" para referirse a la entidad hipotética responsable de los rasgos observables.

4- En 1913 se obtiene el primer mapa genético, con 6 genes.

5- En 1920 Morgan y Muller establecen su Teoría cromosómica de la herencia: los genes, localizados en los cromosomas, son las auténticas unidades de la herencia, tanto unidades de variación como unidades de transmisión.

Pero la naturaleza del material genético fue objeto de polémicas durante mucho tiempo, hasta que entre los años 40 y primeros 50 una serie de autores establecen firmemente que el material de la herencia reside en el ácido desoxirribonucleico (ADN; DNA).

Por esos mismos años, se propone la teoría conocida como "un gen-una enzima", que correlaciona cada unidad genética con el producto de su expresión, es decir cada gen se expresa como una determinada proteína. Desde entonces, se produce la definitiva unión de la genética con la bioquímica.

Pero aparte de estos avances básicos, a finales de los años 60, seguía pendiente de plasmación una de las expectativas abiertas por el descubrimiento de la estructura del ADN: ¿cómo llegar a "tocar" el ADN?, ¿cómo estudiar cada gen por separado, aislándolo físicamente de los demás?, ¿cómo determinar su secuencia de bases? Durante mucho tiempo, lo único que se podía secuenciar era ARN:

1- Desde 1964 se secuencian algunos ARN , que constan de 5 a 85 bases.

2- Los métodos se fueron perfeccionando, de modo que en 1975 se pudo conocer la secuencia de un minúsculo genoma: el ARN del virus bacteriano Fi-X-174 (unos 4000 nucleótidos).

Sin embargo, para estudiar genes había que ser capaces de aislarlos uno a uno a partir del cromosoma, que es demasiado grande para su manipulación inmediata.

Pero no se habían descubierto nucleasas específicas capaces de cortar en puntos determinados el ADN para generar fragmentos discretos y homogéneos.

Como tantas veces ocurre en la ciencia, fue una humilde línea de investigación básica la que abrió definitivamente el camino a la manipulación del ADN:

1- En 1953 se descubrió el fenómeno llamado de restricción: ciertos fagos (virus bacterianos) que parasitan a E. coli podían desarrollarse en ciertas cepas de esta bacteria, pero no podían hacerlo en otras (se dice que están "restringidos" en determinadas cepas).

A finales de los 60, se descubre las enzimas de restricción responsables de ese fenómeno: la cepa de bacteria restrictiva produce unas endonucleasas ("enzimas de restricción, o restrictasas") que escinden el ADN del fago crecido en otra cepa diferente.

Esas primeras enzimas de restricción eran inespecíficas en cuanto al sitio del ADN donde cortaban, pero en 1970 se obtiene un nuevo tipo de enzima de restricción totalmente específica: capaz de reconocer una determinada secuencia de ADN, de unos pocos pares de bases, y de cortar en ambas cadenas en lugares concretos.

1- Algunas restrictasas reconocen como secuencia diana un trecho de 4 pares de bases (pb).

2- Otras restrictasas reconocen secuencias de 6 pares de bases.

 

 

Muchas de estas restrictasas cortan en cada cadena en lugares separados del centro geométrico de la diana (como en el ejemplo anterior), de modo que generan extremos protuberantes.

Los extremos protuberantes de distintos fragmentos de ADN generados con la misma restrictasa (incluso de fragmentos de especies distintas), tienen tendencia, al mezclarlos, a emparejarse entre sí por puentes de hidrógeno (siguiendo las reglas de emparejamiento A-T y G-C).

Si ahora añadimos la enzima ADN-ligasa a la mezcla de fragmentos de ADN de orígenes diferentes, se repararán los enlaces fosfodiésteres. Esto es lo que realizaron por primera vez Mertz y Davis en 1972, y enseguida se dan cuenta de que ello podía constituir la base para la  producción de moléculas recombinantes in vitro, con material genético de diferentes especies.

Pero este ADN recombinante, generado en el tubo de ensayo, es inerte, no es más que una macromolécula híbrida que por sí sola no hace nada.

Si queremos que el ADN recombinante haga algo, hay que introducirlo en células vivas que sean capaces de expresar su información genética.

Esto nos lleva ya a la idea de lo que es la Ingeniería Genética: la formación in vitro de nuevas combinaciones de material genético, por medio de la inserción de un ADN de interés en un vehículo genético (vector), de modo que tras su introducción en un organismo hospedero el ADN híbrido (recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y eventualmente expresarse.

RESUMEN :

La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos.

Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño en un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.

La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:

1- La tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

2- La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

3- La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.

4- Las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética.

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes.

De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina.

Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

1- Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares".

Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:

- Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.

- Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.

En el siguiente esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción.

Se aprecia la actuación en ambas hebras. 

En el siguiente esquema se ve el resultado de la

actuación de la enzima de restricción.

Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando

unos bordes pegajosos por donde puede unirse

este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

APLICACIONES TERAPEUTICAS DE LA TECNOLOGÍADE ADN RECOMBINANTE:

La llegada de la tecnología de ADN recombinante , en primera instancia llevo aldesarrollo de pruebas para el diagnostico, detección de portadores, el diagnostico p resintomatico, y parael diagnostico prenatal de enfermedades geneticas, asícomo para empezar a comprender la patología molecular y del desarrollo demuchas enfermedades hereditarias. Estos avances en algunos casos , tambiénhan producido un rapido progreso en la disponibilidad de la biosíntesis de losproductos genicos y en la planificación de estrategias para la terapia genica deciertas enfermedades hereditarias.

La insulina utilizada en el tratamiento de la Diabetes Mellitus, se obtenia hasta hacepoco del páncreas del cerdo. Tenia que purificarse muy cuidadosamente para su uso,e incluso así ocasionalmente producia reacciones de hipersensibilidad en los pacientes.No obstante, con la tecnología del ADN recombinante , pueden utilizarsemicroorganismos para sintetizar insulina a partir del gen humano de la insulina.Entre estos microorganismos tenemos a la Escherichia coli.

La tecnología de ADN recombinante esta siendo empleada en la

producción de un numero de otros productos biosinteticos:

-         Hormona del crecimiento.

-         Factor VIII de la coagulación.

-         Factor IX de la coagulación.

-         Interferon.

-         Alfa-1-antitripsina.

-         Vacunas.

 

TERAPIA GENICA :

TERAPIA GENICA:

 

Es la reposicion o correccion de un producto genico deficiente debido a un gen anormal.

Puede hacerse ya sea, in vitro ( o ex vivo ) mediante el tratamiento de celulas o tejidos

de un individuo afectado en un medio de cultivo, con su reintroducción posterior en el

individuo afectado, o in vivo si las celulas no puden cultivarse o ser reemplazadas en el

individuo afectado.

Todos sus programas se centran solamente, en la terapia genica de celulas somaticas,

en las que la alteración de la información genetica se dirige a las celulas especificas

tejidos u organos en los que la enfermedad se manifiesta.

ABORDAJES CONVENCIONALES PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES GENETICAS:

1- REPOSICIÓN DE PROTEINAS Y/O ENZIMAS:

Si se descubre que una enfermedad genetica se debe a un déficit o trastorno de una enzima o proteina especifico , entonces en teoria el tratamiento podria consistir en la reposición de la proteina o de la enzima deficitaria o defectuosa. Ej: uso de cocentrados del factor VIII de la coagulación en el tratamiento de la Hemofilia A.

En la mayoria de los errores congenitos del metabolismo en los que se ha identificado un déficit enzimatico , no es posible la simple reposición de la enzima, pues no han existido cantidades disponibles y suficientes de enzimas o de proteinas. Además , aunque se utilicen técnicas de ADN recombinantes para realizar la biosíntesis del producto genico perdido o defectuoso,es previsible que la inyección de la enzima o de la proteina no tenga éxito ya que el proceso metabolico implicado se desarrolla en el interior de las celulas y normalmente laproteina o la enzima no se transporta al interior celular.

En algunos casos, no obstante, una modificación bioquímica de la proteina o de la enzima permite la utilización de los mecanismos normales de transporte celular para conseguir que la enzima alcance su localización normal, en el interior de la celula.

2 - TRATAMIENTO CON MEDICAMENTOS:

E n algunas enfermedades geneticas es posible el tratamiento con medicamentos;por ejemplo: ciertos medicamentos pueden ayudar a disminuir los niveles decolesterol en la hipercolesterolemia familiar. En otras, el evitar ciertosmedicamentos o alimentos puede prevenir la manifestación de la enfermedad,tal como ocurre con las sulfonamidas en el déficit de glucosa-6- fosfatodeshidrogenasa.

3- EXTIRPACIÓN Y/O TRANSPLANTE DE TEJIDOS:

La reposición del tejido defectuoso es otra opcion que puede llegar a estar disponiblecon la llegada de la tipificacion de tejidos, como por ejemplo: el transplante renalen la enfermedad renal poliquistica del adulto. La extirpación del tejido enfermopara prevenir complicaciones es una opcion profiláctica o terapeutica en muchosde los síndromes familiares que predisponen al cancer.

4- MÉTODOS EXPERIMENTALES DE TRATAMIENTO:

Se incluyen : el transplante de medula osea para algunas enfermedades de deposito neurovegetativas, tales como las mucopolisacaridosis mas graves, es decir lossíndromes de Hurler y de Hunter. Aunque son opciones terapeuticas mas drásticas ,su eficacia no ha sido demostrada.

Antes de considerar si un ensayo de terapia genica es posible, hay diversos aspectostécnicos que deben tenerse en consideración:

1-Caracterizacion del gen: El gen afectado debe haber sido clonado, que incluye no solo al gen estructural sinotambién a las secuencias de ADN implicadas en el control y la regulación de laexpresión del gen.

2-Celulas / Tejidos / Organos diana:Las celulas, tejidos u organos especificos afectados en una persona con unaenfermedad genetica que va a ser tratada deben ser identificados, así como estar accesibles.3- Sistema Vector:El medio mediante el cual se introduce un gen extraño tiene que ser eficaz y seguro.Debe haber una evidencia inequívoca en los ensayos realizados con terapia genicaen animales, de que los genes insertados funcionan adecuadamante, con lassecuencias promotora, potenciadora y reguladora apropiadas. Además es necesariodemostrar, que la población de celulas del tejido tratado tiene una vida media razonable,que el producto genico continua siendo expresado y que el cuerpo no reacciona deforma adversa al producto genico, por ejemplo: produciendo anticuerpos contrael producto proteico.Por ultimo, es esencial demostrar que la introducción de un gen extraño o una secuenciade ADN no tiene efectos deletereos, tales como el desarrollo inadvertido de un tumoro un efecto mutagenico.

MÉTODOS DE TERAPIA GENICA:

VIRALES: FISICOS:

- Retrovirus:- Entre ellos tenemos: - Transferencia de ADN mediada por los

al virus del SIDA y los virus que liposomas:producen cancer, precisan de 2 Los liposomas son una bicapa de lipidos elementos: que rodea una vesícula acuosa, y pueden a) Linea celular empaquetada: ser utilizados para introducir ADN extrañoEs una linea celular que ha sido en el interior de una celula diana.infectada por un retrovirus que ha sido manipulado por ingenieria - Endocitosis mediada por receptor:genetica, para perder la region del Es una variante de la anterior, y consisteADN que impide la producción en dirigir el ADN a receptores especificosde proteinas virales normales. situados en la superficie de las celulas.

a) Virus Ayudante: - Oligonucleotidos:

Son provirus retrovirales, que por Se sintetizan oligonucleotidos antisentido,ingenieria genetica han eliminado que se unen a secuencias especificas de ARNmas del 90% del material genetico manipuladas por ingenieria genetica :viral. ( ribozimas), creando por un proceso

- Adenovirus: catalitico una especie particular de ARNm.Se utilizan como vectores ya que infectan una amplia variedad de tipos celulares que no están en división y pueden transportar hasta36 Kb de ADN extraño.

- Virus adeno- asociados.

Son parvovirus no patógenos en los humanos, con gran poder de infección y la posibilidad deexpresión genica a largo plazo.

- Virus Herpes:

Son neutrofilos, es decir, infectanal tejido nervioso y modificados pueden ser utilizados para laterapia genica dirigida al SNC.

- Otros:Influenza.Virus ARN.

Métodos futuros de terapia genica:

- Integración de virus dirigidos en regiones especificas del ADN en ciertostipos celulares o tejidos limitados mediante endocitosis especifica mediadapor receptor.

TEJIDOS DIANA DE TERAPIA GENICA:

- Higado.- Sistema Nervioso Central.- Músculo.- Medula Osea.

ENFERMEDADES SUSCEPTIBLES A TERAPIA GENICA:

ENFERMEDAD GENETICA: DEFECTO:

- Deficiencia Inmune. - Deficit de adenosin deaminasa.- Enfermedad Granulomatosa

Crónica.

- Hipercolesterolemia. – Trastorno del receptor delipoproteinas de baja densidad.

- Hemofilia. - Déficit del factor VIII. ( A).- Déficit del factor IX. ( B).

- Enfermedad de Gaucher. – Déficit de glucocerebrosidasa.

- Mucopolisacaridosis. – Déficit de beta-glucuronidasa.

- Enfisema. – Déficit de alfa-1-antitripsina.

- Fenilcetonuria. –Déficit de fenilalaninhidroxilasa.

- Distrofia Muscular. –Mutaciones de la distrofina.

- Talasemias y falcemia. –Mutaciones de la globina alfaybeta.- Cancer.- SIDA.- Enfermedades Cardiovasculares.- Artritis Reumatoidea.

EJEMPLOS DE MÉTODOS DE TRATAMIENTOS DE ENFERMEDADESGENETICAS:

TRATAMIENTO: ENFERMEDAD:

- Inducción enzimatica con medicamentos: - Fenobarbital. Congenita no hemolítica.

- Reposición de vitaminas o coenzimas deficitarias:B6. Homocistinuria.

B12. B12 Metilmalonilacidemia.D. D Raquitismo.- Transplante de medula osea. Mucopolisacaridosis.

- Preparados de enzimas y/o proteinas.

Tri Tripsina Déficit de Tripsinogeno.Alf alfa-glucosidasa. Enfermedad de Gaucher.

Crioprecipitado/factor VIII. Hemofilia A.

- Reposición del producto deficitario:

Cortisol. Hiperplasia Adrenal Congenita.Tirosina. Hipotiroidismo Congenito.

- Restricción de sustratos en la dieta:

Aminoácidos:Fenilalanina. Fenilcetonuria.Hidratos de carbono:Galactosa. Galactosemia.Lípidos: Colesterol. Hipercolesterolemia Familiar.Proteinas Enfermedades del ciclo de la urea.

- Tratamientos con Medicamentos:

Acido Aminocaproico. Edema Angioneurotico.Dantrolene. Hipertermia Maligna.Colestiramina. Hipercolesterolemia Familiar.Penicilamina. Enfermedad de Wilson, cistinuria.Enzimas Pancreáticas. Fibrosis Quistica.

- Tratamientos con Medicamentos:Acido Aminocaproico. Edema Angioneurotico.Dantrolene. Hipertermia Maligna.Colestiramina. Hipercolesterolemia Familiar.Penicilamina. Enfermedad de Wilson, cistinuria.Enzimas Pancreáticas. Fibrosis Quistica.

- Reposición de Tejido enfermo:Transplante de riñon. Enfermedad Poliquistica Renal

del adulto.- Extirpación de tejido enfermo:

Colectomia. Poliposis.Esplenectomia. Esferocitosis hereditaria.

Aunque la terapia génica se presenta con frecuencia como una nueva panaceaen medicina , tendrá un impacto limitado a corto plazo y su aplicaciónestará llena de dificultades practicas para el futuro. No obstante, los avances recientes en la biología molecular que han llevadoa la identificación de muchas enfermedades genéticas humanas importantes y susproductos proteicos, han abierto nuevas oportunidades para la investigacióny para alcanzar la búsqueda de un tratamiento genético para muchasenfermedades genéticas y no genéticas.