V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni 1 Le applicazioni della terapia genica nelle...

V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

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Le applicazioni della terapia genica nelle

malattieLa terapia genica consente di trasferire la versione funzionante del gene

• nell’organismo – rimediare al difetto– uccidere cellule patologiche

• in cellule malate – bloccare il meccanismo alterato che causa la

malattia

la terapia non è la stessa per tutte le malattie• stessi principi • metodica differente

– bersaglio differente• fibrosi cistica

– cellule delle vie aeree• immunodeficienze

– cellule del sangue


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I limiti della terapia genica

La sicurezza della procedura • privare i vettori virali della virulenza inizialeEfficienza di trasferimento • inserire stabilmente il DNA nelle cellule Selettività del bersaglio • esprimere il gene estraneo in uno specifico tipo

cellulareDurata dell’espressione del gene trasferito• unico trattamento o ripetuti a distanza di qualche annoLa reazione immunitaria• evitare che il vettore o il gene estraneo producano una

reazione immunitaria


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Sperimentazioni cliniche in corso

Numero e fasi di protocolli di sperimentazione clinica in terapia genica dal 1898 al 2005

materiale genetico introdotto

• tossicità

• efficacia

• espressione a breve/medio termine

reale efficacia del trattamento in funzione della cura

The Journal of Gene Medicine


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Protocolli di sperimentazione clinica in terapia genica dal 1898 al 2005 per diverse patologie

Bersagli della terapia genica

The Journal of Gene Medicine


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• immunodeficienza congenita grave (SCID-ADA)• immunodeficienze ereditarie• malattie lisosomiali • diabete di tipo 1• talassemie• distrofia muscolare • difetti congeniti della pelle

ottimizzazione delle procedure di trasferimento genico– caratterizzazioni funzionale del gene bersaglio – progettazione e realizzazione di nuovi vettori– realizzazione di nuovi protocolli per aumentare la efficienza del trasferimento genico– caratterizzazione in vivo di cellule trasdotte– modulazione di risposte immuni a cellule modificate geneticamente

La ricerca

Istituto Telethon-San Raffaele, 2002


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L’ADA o adenosina deaminasi è un enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di degradazione degli acidi nucleici. La sua carenza provoca effetti sui linfociti T con una grave immunodeficienza.

Trattamenti:• terapia genica ex-vivo• trapianto di midollo osseo • sostituzione enzimatica

La terapia genica dell'ADA implica:1. Il clonaggio del gene sano dell'ADA in un vettore retrovirale2. Il trasferimento del ricombinante ADA nei linfociti T ADA- del paziente3. L'identificazione dei linfociti diventati ADA+ e la loro espansione in coltura 4. Il reimpianto di queste cellule nel paziente

• le ricerche sono ora orientate a trasferire il gene dell'ADA nelle cellule staminali del midollo osseo

L'ADA (adenosina deaminasi)

Istituto Telethon-San Raffaele, 2002

Primo tentativo di terapia genica nel 1990 effettuato da Michael Blaese su una bambina affetta da ADA.


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La terapia genica si basa su 4 strategie:

1. Incrementare la dose di un gene deficitario– introduzione di copie aggiuntive di quel gene sano(patologie autosomiche)

2. Uccidere in modo mirato le cellule patologiche– terapia genica contro il cancro per uccisione delle cellule tumorali

• diretta– geni che codificano per

» tossina letale (suicida) » pro-farmaco

• indiretta– geni immunostimolatori

3. Correggere selettivamente la mutazione che rende il gene non funzionante4. Inibire selettivamente l'espressione di un gene

– bloccare il DNA, l'RNA o la proteina della molecola alterata o aberrante espressi dalle cellule malate

Le strategie molecolari

L. Barberis e M. De Acetis, 2007


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Obiettivo:• indurre una risposta immunitaria

specifica contro le cellule infette • la loro uccisione mirata

terapia genica per le malattie infettive


Quali malattie?•infezioni che con terapie convenzionali non hanno dato segnali di guarigione

•malattie protozoarie•malaria•AIDS

Retrovirus • HIV capace di infettare i linfociti T helper (TH)• pazienti suscettibili a moltissime altre infezioni Provirus • tende a persistere in uno stato latente • viene attivato improvvisamente

Le cellule infettate dall'HIV possono venire uccise • Direttamente• con l'inserimento di un gene codificante per un antigene del virus al fine di potenziare la risposta immune nel paziente

• Indirettamente•Interferendo con il ciclo vitale del virus


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Ipercolesterolemia familiare – difetto nell'espressione del recettore delle LDL

nel fegato con conseguente affezione prematura delle arterie coronarie

terapia genica di patologie ereditarie


Terapia genica effettuata:•Parziale epatectomia•Estrazione degli epatociti •Coltivazione in vitro •Trasfezione con

–recettore per le LDL –gene per veicolare resistenza all'igromicina

•Selezione con l'igromicina •Reimmissione nel fegato del paziente mediante iniezione intravena


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Fibrosi cistica: malattia autosomica recessiva • determinata da un deficit di trasporto degli ioni

cloro attraverso le cellule epiteliali dovuta a mutazioni nel gene CFTR

• Quadro patologico: • distruzione del parenchima polmonare• insufficienza pancreatica

Terapia genica per trasferire un minigene CFTR utilizza :

1. Adenovirus ricombinante: stabilire prima la massima dose tollerabile

2. Liposomi: più sicuri,ma con efficienza inferiore.

terapia genica di patologie ereditarie


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Obiettivi:• riduzione del tumore:in maniera analogo ai trattamenti radioterapici e chemioterapici • eliminazione del tumore:per l'uccisione del 100% delle cellule cancerogene

Strategie attuabili:1. trasferimento genico nei linfociti che infiltrano il tumore2. Immunoterapia adottiva mediante modificazione genetica delle cellule tumorali 3. immunoterapia adottiva mediante modificazione genetica dei fibroblasti

terapia genica dei tumori



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Leucodistrofia metacromatica• malattia da accumulo (lisosomiali) • si eredita con modalità autosomico recessiva

• colpisce un bambino su 40mila• causata da un difetto nel gene dell’arilsolfatasi A

• enzima che serve ad evitare l’accumulo di sfingolipidi• piccole molecole di grassi presenti nella membrana delle cellule

terapia genica di malattie cerebrali

L’accumulo crea danni neurologici nei malati•paralisi•attacchi epilettici•difficoltà respiratorie

Per trasferire il gene sano nel cervello degli animali malati •HIV privato di tutte le sue componenti pericolose•conserva la naturale capacità di trasportare geni •in cellule particolarmente refrattarie

•neuroni

•una singola iniezione di virus modificato è sufficiente a trasferire il gene sano nelle cellule malate, che iniziano a produrre l’enzima mancante

•il cervello non presenta più traccia del danno da accumulo

•anche nelle zone più lontane del cervello rispetto al punto in cui viene pratica l’iniezione

sviluppare una strategia di terapia genica per altre patologie del sistema nervoso • Alzheimer e Parkinson”


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«degenerazione ereditaria della retina» • patologia progressiva• causata da un’alterazione di un singolo gene• RPE65

terapia genica contro la cecità

University College di Londra

Moorfields Eye Hospital

(The Indipendent, 2007)

L’intervento: inserire una versione sana del gene nei cromatocitiIl gene è stato «trasportato» all’interno dell’occhio da un vettore virale, geneticamente modificato, che lo ha inserito nel DNA delle cellule.

per mandare il gene a più cellule possibili, deve essere usata una quantità tale di soluzione da consentire di alzare la retina causandone il temporaneo distacco

nel futuro si potrà pensare anche ad altre patologie:•degenerazione maculare•disturbi ereditari

per i quali attualmente non ci sono trattamenti


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terapia genica contro l'epilessia

Brooks-Kayal (Journal of Neuroscience, 2006)

Esperimenti su topi hanno dimostrato che:•Se i recettori per il GABA di tipo sono attivati,inibiscono :-l’eccessiva e ripetitiva attivazione dei neuroni-squilibrio fra l’attività di due tipi di neurotrasmettitori

• l’acido glutammico (eccitatorio) • il GABA (inibitorio)

Se la proteina alpha1 (una sub-unità del recettore) è bassa si manifesta l’epilessia.

Strategia: “rifornire” le cellule cerebrali con un ulteriore gene per l’espressione di alpha1 utilizzando come vettore un adenovirus privato del proprio genoma.Risultati: blocco dello sviluppo dell’epilessia dopo una lesione cerebrale modifica del percorso dei segnali nervosi nel cervello

Patologia cronica del sistema nervoso caratterizzata da crisi convulsive ricorrenti dovute a un danno cerebrale provocato da cause diverse oppure senza causa organica.


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EB, malattia genetica della pelle • distacco dell’epidermide• dal derma

La malattia dipende da:• undifetto nel gene per la catena beta3 della laminina 5, proteina che

– permette che l’epidermide si attacchi al derma

terapia genica in epidermiolisi bollosa

De Luca (Nature Medicine, 2006)

cellule staminali •provenienti dall’epidermide del paziente

•corrette geneticamente •inserimento di un vettore retrovirale della versione sana del gene “malato”

•fatte crescere in laboratorio fino a ottenere lembi di epidermide•trapiantati su due zone delle gambe del malato


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INDICE DELLE MALATTIE Albinismo oculare tipo 1 Fenilchetonuria Porfirie

Anemia falciforme Fibrosi cistica Rene policistico

Anomalie cromosomiche

Glicogenosi Retinite pigmenosa

Atrofia mscolare spinale tipo I II III

Immunodeficienze combinate gravi

Sclerosi laterale amiotrofica

Autismo Ipercolesterolemia familiare

Sclerosi tuberosa

Cardiomiopatia ipertrofica familiare

Malattie lisosomiali Sindrome di Down

Cistinuria Malattie mitocondriali Trisomia 13 & 18

Diabete giovanile Morbo di Alzheimer Sindrome di Klinefelter

Distrofia Morbo di Parkinson Sindrome X fragile

Emofilia Neurofibromatosi tipo 1 Sordità ereditarie

Epilessie Osteogenesi imperfetta Talassemia α & β

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