Aula Terapia Genica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA , ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A FARMÁCIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁFACULDADE DE FARMÁCIA , ODONTOLOGIA E ENFERMAGEMDISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A FARMÁCIA

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Introdução

TERAPIA GÊNICA

Terapia gênica é um procedimento médico que envolve a modificação genética de células como forma de tratar doenças.

Intervenção médica baseada em modificações do material genético em células vivas.

Qualquer procedimento terapêutico em que sequências nucleotídicas são intencionalmente introduzidas ou modificadas em células/tecidos humanos.

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Definição Foi assim que surgiu o conceito de terapia gênica (ou ainda

geneterapia), que propõe, por meio de engenharia genética e com a ajuda de vetores chegar até os órgãos, tecidos e células em que há genes defeituosos para “tratá-los”.

Por tratamento, os cientistas buscam desativar o gene doente e reprogramá-lo para produzir as proteínas certas — ou parcialmente funcional — ou ainda adicionar novos genes em substituição aos que não funcionam normalmente.

O objetivo, seja qual fora o tipo de intervenção, é fazer o DNA aprender a ler um novo código — ou seja, corrigir o problema na sua origem.

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Histórico Em 1990, foi realizado nos Estados Unidos o primeiro

Protocolo Clínico de Terapia Gênica em humanos, em duas crianças portadoras da imunodeficiência combinada severa.

O sucesso parcial desse protocolo levou a uma explosão no desenvolvimento de vários estudos com perspectivas de uso terapêutico dos genes.

O aumento na quantidade de protocolos clínicos reflete o fato de que há grandes esperanças de sucesso da terapia gênica para combater doenças que afligem a sociedade há muito tempo, com poucas perspectivas na medicina clássica. Entre as grandes mudanças recentes, destacamos o uso de moléculas de RNA dupla-fita que agem como silenciadores gênicos através de mecanismos de RNA interferência (RNAi).

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Histórico O trabalho pioneiro descrito por Oswald T. Avery e seus

colaboradores em 1944 já mostrou que é possível transferir genes de uma cepa bacteriana patogênica para outra não-patogênica, identificando o DNA como portador da informação genética.

Essa descoberta fundamental foi logo seguida pela proposta da estrutura dupla-hélice do DNA, por James Watson e Francis Crick em 1953.

Estavam lançadas bases para a busca de uma forma de inserir genes saudáveis em indivíduos que deles necessitassem, hipótese que foi aventada em 1964.

O isolamento do primeiro gene, por Jon Beckwith e colaboradores em Harvard (1969), levou a declarações reforçando essa possibilidade.

No entanto, teve início também uma polêmica sobre a segurança da engenharia genética e possibilidades de sua utilização para propósitos de eugenia.

Esse debate estendeu-se durante toda a década de 1970 e culminou na criação de legislações adequadas de segurança em diversos países.

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Histórico Em 1977, os pesquisadores Michael Wigler e Richard Axel

conseguiram a primeira correção genética propriamente dita em células de mamífero cultivadas in vitro.

Esses pesquisadores inseriram o gene que codifica a enzima timidina quinase em células portadoras de deficiência nesse gene. A metodologia utilizada, com DNA purificado, apesar de fornecer dados inequívocos, ainda era pouco eficiente.

Ganhou força, então, a proposta aventada anteriormente de utilizar vírus não-patogênicos como vetores transportadores de genes. Essa idéia gerou intensas pesquisas e já nos anos de 1983 e 1984 foram propostos os primeiros sistemas de vetores derivados de três espécies virais.

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Histórico No início do século XXI, com o seqüenciamento do genoma humano e

o desenvolvimento das ferramentas de comparação de genes baseada na informática, foi desvendado um universo jamais imaginado anteriormente.

Essas ferramentas foram um apoio fundamental na medida em que várias doenças humanas eram, à custa de muito trabalho, relacionadas a defeitos em genes específicos.

Os dados do genoma humano foram anunciados várias vezes com pompa e euforia. identificavam que, com a “revelação do Livro da Vida”, estaríamos próximos de resolver problemas seculares. De fato, com esses dados foi possível identificar pelo menos 70.000 defeitos genéticos em seres humanos.

A capacidade de interferir na constituição genética de um indivíduo, por meio da terapia gênica, surge então como uma espécie de tábua de salvação para resolver problemas relacionados à saúde humana, pela cura de doenças genéticas herdadas dos pais, ou mesmo de doenças que podem ser adquiridas durante a vida, como o câncer, doenças do coração e infecções virais

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Aplicações Na prática, porém, o tratamento ainda passa por testes que avaliam sua segurança e eficácia para os seres humanos, e, além disso, os cientistas acreditam que nem todos os pacientes poderão se beneficiar desses avanços.

Pré-condições à realização da terapia gênica Ser portador de alguma das doenças caracterizadas pela mutação de um ou

mais genes. Segundo os especialistas, os melhores candidatos são aqueles que possuem um transtorno causado por um único gene “defeituoso”, uma vez que fica mais fácil entender o mecanismo de codificação das proteínas e, consequentemente, a manifestação da doença.

Os pesquisadores já conhecerem a biologia da doença genética – que tecidos são atingidos pela mutação gênica, como as proteínas codificadas pelo gene mutante atuam. Esta condição é essencial para que os especialistas produzam em laboratório a cópia de DNA do gene mutante, ou seja, o gene terapêutico, que será inserido no organismo do paciente por meio de um vetor. Também os ajuda a definir o melhor método para aplicar a terapia – desde o tipo de vetor até o melhor procedimento para fazê-lo chegar até as células-alvo.

O gene com mutação não é do tipo dominante negativo. Se fosse, isso significa que o gene mutante produz uma proteína capaz de impedir a ação do gene terapêutico e, neste caso, o sucesso da terapia gênica é mais difícil, porque requer o uso de técnicas de apoio.

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Os riscos da terapia gênica: Resposta imune a proteína produzida pelo gene inserido

causando inflamação. Mutação insercional. O gene saudável introduzido pode promover a síntese de

muita proteína, antes defeituosa, levando a outros problemas.

Outros genes podem ser acidentalmente entregue as células.

Os vetores pode atingir outras células não afetadas pelo defeito genético, e então provocar algum problema.

O vetor viral pode se tornar infectivo/ contagioso.

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Procedimentos técnicos necessários à terapia gênica em humanos (FDA): isolamento do gene e suas seqüências reguladoras determinar quais são as células afetadas dispor de um mecanismo eficiente (vetores) para inserir o

gene nas células especificadas. dispor de tempo para análise. que todos os procedimentos não apresentem efeitos

colaterais indesejáveis.

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Estratégias terapêuticas Transferência

(em pacientes com mutação não funcional ou deleção de um gene )

Correção

(reverter mutação específica em um gene alvo)

Amplificação

(aumentar a expressão do gene alvo)

Indução de morte

(introdução de gene “killer”)

Silenciamento

(inibição da expressão de um gene)

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Vetores para Transferência

gênica

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Transferência gênica Vetores não virais Métodos físicos ;

Métodos químicos ;

Vetores virais Métodos biológicos;

Retrovirus Herpes simplex virus Adenovírus Adenovírus associados

A escolha do método a ser empregado é feita de acordo com a patologia, a célula ou tecido-alvo, o tamanho e tipo de transgene a ser expresso e o tempo e quantidade de expressão que se deseja obter, entre outros fatores.

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Vetores de transferência gênicaCaracterísticas ideais:

capacidade de acomodação de um transgene de tamanho ilimitado;

Baixa imunogenicidade e citotoxicidade; Expressão estável do transgene,; direcionamento para tipos específicos de células ou tecidos; baixo custo, fácil produção e manipulação e ainda possibilidade de regular a expressão do gene

exógeno no tempo e/ou na quantidade.

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Vetores não virais Mais recentes na terapia

gênica Não imunogênicos Uso repetido Sem mutação insercional Transdução in vivo limitada

Principais barreiras:

1.Entrada na célula

2.Degradação citoplasmática

3.Transporte até o núcleo

4.Entrada no núcleo

pREGFP11.2 kb

EGFP

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Métodos físicos: Microinjeção: consiste na introdução de uma pequena

quantidade de DNA diretamente no núcleo da célula-alvo com o auxílio de um aparelho denominado micromanipulador.

Vantagens Desvantagens

Pequena quantidade de DNA; Evita a degradação citoplasmática

o número de células que pode ser transformado é geralmente muito baixo.

Facilidade de aplicação Requer pessoal treinado e especializado

Produção de trangênico A aplicação está restrita a tecidos com nível baixo de endonuclease

Apresenta problemas técnicos e éticos.

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Métodos físicos: Eletroporação:  Neste sistema, pulsos elétricos alternados são

aplicados a células que estão em contato com uma solução de DNA plasmidial. A corrente gerada é capaz de formar poros na superfície celular, facilitando a entrada do material genético nas células.

Vantagens Desvantagens

Bastante eficiente Elevada morte celular

Alta taxa de transformação

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Métodos físicos: Biobalística ou gene gun: microesferas de ouro ou tungstênio

cobertas com DNA são aceleradas por um gás carreador, que projeta estas esferas contra células, promovendo a entrada deste DNA no núcleo das células bombardeadas.

Vantagens Desvantagens

Bastante eficiente Expressão transitória

Alta taxa de transformação

Pode causar lesão celular

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Métodos químicos Utilizam características do DNA e das membranas celulares para,

utilizando compostos químicos, garantir a entrada de material genético nas células.

Em geral, os compostos utilizados são catiônicos, ou seja, possuem carga total positiva.

Assim, estes compostos interagem com as cargas negativas dos grupamentos fosfato do DNA e formam complexos.

Tais complexos têm também uma carga geral positiva, eliminando a repulsão de cargas existente entre o DNA e os domínios extracelulares da maioria das proteínas de membrana, que também têm carga negativa.

Assim, a entrada do complexo na célula por mecanismos celulares normais, como a endocitose, é facilitada.

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Métodos químicos Fosfato de cálcio : Dextran Lipossomos HACS

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Métodos biológicos

Sistemas biomoleculares específicos de transferência, recombinação e expressão gênica; Vetores por excelência; Vêm evoluindo há milhões de anos na natureza em associação com bactérias, plantas e animais;

Principais barreiras dos vetores não virais: 1.Entrada na célula 2.Degradação citoplasmática 3.Transporte até o núcleo 4.Entrada no núcleo

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Vetores virais Atualmente é o método mais utilizado para terapia gênica devido à

alta eficiência de transfecção.

Os vírus são modificados para que fiquem deficientes em replicação e capazes de transferir seu material genético para células-alvo.

As famílias de vírus mais conhecidas e utilizadas em protocolos de transferência gênica são: os retrovírus, adenovírus, vírus adeno-

associado e herpes simples vírus.

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Vetores virais

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Vetores virais

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Retrovírus Lentivírus e oncorretrovírus fazem parte da família dos retrovírus.

Retrovírus são vírus de RNA fita simples, transcrito para DNA pela transcriptase reversa que o vírus carrega e integrado no genoma da célula infectada.

Os lentivírus têm a capacidade de transfectar células quiescentes.

Já os oncorretrovírus têm preferência por células em divisão, como tumores . Sua propriedade de integração ao genoma hospedeiro acentua a possibilidade de garantir a expressão estável do transgene.

No entanto, existem problemas como a integração aleatória dos retrovírus no genoma hospedeiro podendo inserir-se no meio de outro gene modificando sua expressão naquela célula. Outro problema de grande importância é a questão de segurança na manipulação de vetores virais baseados em vírus como o HIV.

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Retrovírus

Integração cromossômica do RNA Expressão estável e permanente Sem especificidade celular Integração ao acaso Possibilidade de recombinação Ativação de oncogenes Células com capacidade de divisão

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Adenovírus Para transfecção eficiente in vivo foram elaborados vetores

adenovirais.

Adenovírus são pequenos vírus de DNA dupla fita.

Esses vetores conseguem infectar a maioria dos tipos celulares de mamíferos, além de ser possível purificá-los em larga escala.

Entretanto, o efeito citotóxico nas células infectadas causa diminuição da expressão do transgene.

Eficientes para transferência gênica

Não se integram no genoma.

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Adenovírus associado

O genoma do AAV contém uma fita simples de DNA. Nas células humanas o vírus fica latente, sua ativação ocorre na presença de um vírus auxiliador, como o adenovírus ou herpes simples vírus.

O AAV é uma atraente alternativa, pois não está associado a nenhuma doença em humanos.

Pode infectar grande variedade de células, é menos imunogênico e transfecta fotorreceptores com mais eficiência que os adenovírus.

Os vetores AAV têm como limitações sua difícil preparação em altos títulos, tamanho reduzido do inserto que o vetor consegue acomodar e necessidade de co-infecção das células com o vírus auxiliador para facilitar a conversão da simples fita de DNA em DNA dupla fita.

Podem integrar o genoma aleatoriamente

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Silenciamento genético

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RNAi: A NOVA FACE DA TERAPIA GÊNICA Pequenas moléculas de RNA são sintetizadas nas

células, a partir do seu genoma, de modo a produzir estruturas similares a grampos, formando moléculas de RNA dupla-fita (conhecidos como microRNA, ou miRNA) que controlam a expressão de genes celulares, seja a partir da degradação do RNA mensageiro, seja a partir de um bloqueio da síntese protéica.

Esse sistema interfere na expressão gênica das células, e por isso recebeu o nome de RNA interferência (RNAi) .

Essas moléculas, conhecidas como siRNA (small interfering RNA), devem ser complementares à seqüência do gene-alvo e podem reduzir a expressão deste em até 80%.

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Aplicações

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Aplicações da Terapia Gênica

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Tratamento

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Na maioria das vezes o tratamento das doenças genéticas é somente paliativo:

-aliviar a dor

-melhorar a qualidade de vida

amenizando os sintomas ao invés de agir na causa primária: o gene

Tratamento de doenças genéticas

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ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO

DOENÇAS MONOGÊNICAS

-Tratamento se baseia na reposição da proteína deficiente → melhora do funcionamento ou minimizando as consequências de sua deficiência

-efetivo em 12% dos distúrbios

DOENÇAS COMPLEXAS – MULTIFATORIAIS

-se o fator ambiental é conhecido: oportunidade efetiva de intervenção → modificação ou não exposição ao fator ambiental

-tratamento cirúrgico ou médico

Quanto mais precoce o diagnóstico e instituído um tratamento → mais favorável será a evolução dos pacientes.

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Transplante de órgão

Ativação de um gene dormente

Fornecimento da proteína

Evitar o agente danoso

Remoção do produto tóxico acumulado

Dieta especial

ADA e Talassemia: Medula óssea

Talassemia Beta: Gene da cadeia da hemoglobina

Hemofilia A/B: fator VIII/IX de coagulação. Diabetes: insulina

Xeroderma pigmentosum: luz solar

D. Wilson: acúmulo de cobre penicilamina e trientina

Fenilcetonúria: dieta baixa de fenilalanina

TRATAMENTO AO NÍVEL DO FENÓTIPO AFETADO

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DOENÇAS MONOGÊNICAS COM TERAPIA EFETIVA

Hiperplasia adrenal congênita: reposição hormonal Fenilcetonúria: restrição dietética de fenilalanina Hemofilia: reposição do fator Imunodeficiência combinada grave: transplante de medula Cistinúria: ingestão de líquidos: D-penicilina Agamaglobulinemia: reposição de imunoglobulinas Acidúria metilmalônica: vitamina B12 Doença policística adulta: transplante renal

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DOENÇAS MULTIFATORIAIS COM TERAPIAS EFETIVAS

Fenda labial e palatina: cirurgia Estenose pilórica: cirurgia Cardiopatia congênita: cirurgia e medicação Hidrocefalia: cirurgia e medicação Hipertensão: medicação Úlcera péptica: medicação e cirurgia Epilepsia: medicação

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Consequências do tratamento das doenças genéticas

Efeitos colaterais a longo prazo:

Hemofilia: infusão do fator de coagulação → formação de anticorpos contra a proteína

Talassemia: transfusão de sangue → sobrecarga de ferro

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1º Passo:

Organismo-alvoGene de interesse

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CÉLULAS ALVOCaracterísticas: acessíveis, tempo de vida longo no corpo,

alta taxa de proliferação

Tipos de células alvo: Células tronco (medula óssea- cordão umbilical) linfócitos fibroblastos de pele células musculares (mioblastos) células vasculares endoteliais hepatócitos

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http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/genetica/contenido14.htm

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Escolha do Protocolo de Terapia Gênica Exemplos :

Fibrose CísticaParkinson

Retinite Pigmentosa

Tratar diretamenteÓrgão específico

HemofiliaDoenças Metabólicas

Tratar SistemicamenteFígado e Músculo

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Escolha do Protocolo de Terapia Gênica

Doenças monogênicas

recessivas

Expressão do genefuncional

Doenças MonogênicasDominantes

Silenciamento do gene anormal

DNA Antisense

Doenças Adquiridas:HIV, Câncer,

Cardiovasculares

Mas também podem ser tratadas:

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CASO CLÍNICO

Parte I: Criança com 8 meses é levado a emergência devido batida na cabeça. O levantamento da história médica mostrou que teve vários episódios de sangramentos nasais. O médico suspeitou de um distúrbio de coagulação e solicitou exame de triagem.

Parte II: Os resultados da triagem de coagulação mostraram a análise de tempo de protrombina e funcionamento das plaquetas normais. Porém mostraram um tempo prolongado de protromboplastina parcial ativada, suspeitando de alteração de fator de coagulação. Os resultados mostraram que Ethan tem menos de 1% de atividade do fator IX de coagulação, consistente com diagnóstico de hemofilia B.

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CASO CLÍNICO

Parte III: Os pais foram encaminhados a um hematologista e uma equipe de genética para explicar as características da doença (recessiva ligada ao X) e opções de tratamento.

Mutação no gene do fator VIII (Hemofilia A) ou IX (Hemofilia B) de coagulação

afeta 1:5000 homens Sintomas: sangramento espontâneo

nas juntas, nos tecidos moles e órgãos vitais

Tratamento: injeções regulares de fator VIII ou IX

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CASO CLÍNICO

Parte IV: O hematologista explica sobre o tratamento usando uma infusão intravenosa de fator IX recombinante ou derivado de plasma. Devido a herança ligada ao X também solicita o teste genético na criança e na mãe.

Mais de 2100 mutações diferentes

http://maxianarellidebemcomavida.blogspot.com/2009_03_01_archive.html

Parte V: Após 18 anos, Ethan foi internado várias vezes. Os pais ficaram sabendo sobre a terapia gênica e procuraram o hematologista para ser incluído no ensaio clínico.

Neste ensaio a terapia é injetada diretamente no músculo

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CASO CLÍNICO

Procedimento: extração de células da pele (fibroblastos) inserção do gene normal em plasmídeo (não provocam rejeição pelo

organismo) inseridos nos fibroblastos por choque elétrico clonagem dos fibroblastos

pacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem, após pequenas incisões

aumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade de vida dos pacientes) benefícios foram temporários: apenas 10 meses

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CASO CLÍNICO

Parte VI:

Ethan participou de um ensaio de terapia gênica usando AAV recombinante direcionado ao fígado pela veia porta.

Houve um pequeno aumento nos níveis de fator IX, mas ainda não o suficiente.

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Sucessos e Insucessos da Terapia Gênica - Imunodeficiência (ADA)

Lewis, R., 2004.

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Sucessos e Insucessos da Terapia Gênica - Imunodificiência (ADA) Deficiência da Adenosina Desaminase

(1990) – Primeira Terapia Gênica

Duas meninas uma 4 e outra de 8 anos com SCID receberam seus próprios leucócitos intravenoso após tratamento com TG introduzido o gene normal para ADA;

Nos anos seguintes elas permaneceram relativamente saudáveis, mas com tratamento sendo repetido;

Uma precisou de PEG-ADA (enzima sintética) e a outra apresentou 25% de suas células T normais.

Desde 1991: > 90 pacientes foram tratados usando células fronco do cordão umbilical ou medula óssea

Os pacientes têm sobrevivido, a maioria sem terapia complementar

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VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA

Universidade de Pensilvania: rapaz de 18 anos faleceu durante triagem de TERAPIA GÊNICA faleceu 4 dias após a terapia falência múltipla de órgãos

Doença: deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC): doença ligada ao X distúrbio do ciclo da uréia (fígado) causa níveis impróprios de amônia no sangue

Vetor adenoviral (alta dose- 38 trilhões de adenovírus) injeção no fígado altos níveis de IL-6 consequências sistêmicas síndrome de resposta inflamatória sistêmica letal

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VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA Julho/2007: mulher de 36 anos com artrite reumatóide

faleceu 22 dias após receber a segunda dose de um gene terapêutico para artrite. Após investigação pela FDA não foi possível atribuir a morte da paciente a terapia

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TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER Cerca de 650 protocolos: triagem clínica 2/3 dos protocolos de terapia gênica em estudo envolvem

cânceres não herdados introdução de genes supressores de tumor para restaurar a

função perdida.

Ex.: inserção do gene TP53 normal em tumores de pulmão bloquear a progressãotumoral e apoptose

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Terapia Gênica no Brasil- Em 2004 foi criada a Rede de Terapia

Gênica - 14 grupos de pesquisa dos estados

do Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, financiados pelo Institutos do Milênio do CNPq/MCT.

- Pesquisas: introdução de genes com efeito terapêutico

Qual o alvo do Brasil?- terapia gênica em câncer- doenças graves do metabolismo- doenças degenerativas e cardiovasculares- vacinas de DNA profiláticas para doenças infecciosas e vacinas de DNA terapêuticas para HPV

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Terapia Gênica no Brasil Rede é composta por: Rio de Janeiro: o Instituto de Biofísica da UFRJ, o

Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Câncer (InCa);

São Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butantã;

Rio Grande do Sul: os Departamentos de Genética e de Biofísica e o Hospital de Clínicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.

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Vídeo http://www.youtube.com/watch?v=Fz4egOd-V

Y4

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Obrigada !