Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis Dilaksanakan dalam suatu kolom yg diisi dg

fase stasioner yg porous Digunakan cairan sbg fase mobil u/mengelusi

komponen sampel keluar dari kolom Kolom digunakan untuk memurnikan

senyawa / pemisahan campuran Dapat diterapkan pada skala besar

1. Eluent, berfungsi sebagai fase gerak yang akan membawa sampel masuk ke dalam kolom pemisah.

2. Pompa, berfungsi untuk mendorong eluent dan sampel masuk ke dalam kolom. Kecepatan alir ini dapat dikontrol dan perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan perbedaan hasil.

3. Injektor, tempat memasukkan sampel dan selanjutnya sampel dapat didistribusikan masuk ke dalam kolom.

4. Kolom pemisah, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada dalam sampel. Keterpaduan antara kolom dan eluent bisa memberikan hasil/puncak yang maksimal, begitu pun sebaliknya, jika tidak ada "kecocokan", maka tidak akan memunculkan puncak.

5. Detektor, berfungsi membaca ion yang lewat ke dalam detektor.

6. Rekorder data, berfungsi merekam dan mengolah data yang masuk

JENIS KROMATOGRAFI KOLOM Kromatografi Adsorbsi, komponen yg dipisahkan scr

selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai u/bhn isian kolom.

Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi antara lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg bertindak sbg fase stasioner & eluen yg bertindak sbg fase gerak (mobil).

Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan komponen yg berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase stasioner scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase mobil.

Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg permeabel sbg fase stasioner, dan pemisahan berlangsung spt proses pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.

KROMATOGRAFI ADSORBSI

Zat padat sbg adsorben / fase stasioner Alumina & silika gel paling populer Urutan dr kemampuan adsorbsi bsr ke kcl :

Alumina Charcoal Silika gel Magnesium Kalium karbonat Sukrosa Starch Selulosa

Zat cair sbg fase mobil Zat pelarut yg mampu mlakukn elusi terlalu cepat tdk

mampu memisahkan dg baik Elusi yg terlalu lambat mnyebabkan waktu retensi yg trlalu

lama Golongan pelarut yg diurutkan dg dasar kenaikan

adsorbilitasnya pd kolom alumina : Perfluorokarbon Hidrokarbon jenuh Hidrokarbon tak jenuh Halida & eter Aldehid & keton Alkohol & thiol Asam & basa

Kolom kromatografi bekerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal.

PENGISIAN & CARA KERJA KOLOM

Pemasukan absorben kedlm kolom. Kepadatan diseragamkan dg

vibrator/plunger/ dlm bntuk larutan (slurry) & partikelnya dibiarkan mngendap.

Fungsi glass wool di atas & dasar kolom sbg penyangga isian.

Kecepatan elusi dibuat konstan 1 cm/mnt

Penggunaan kolom

u/memisahkan campuran dari dua senyawa dg membuat larutan jenuh dari campuran menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom.

Membuka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas

Menambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Kmdn kran dibuka kembali sehingga senyawa campuran akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar brkt ini:

Selanjutnya ditambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom & cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom.

Kmdn kran dibuka, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom

Pelarut dikumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom.

Pelarut mengalir kontinyu, shg tetap ditambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.

Fase stasioner berupa cairan, fase mobil dpt brp :

Cairan (HPLC = High Performance Liquid Chromatography)

Gas (GLC = Gas Liquid Chromatography)

Kelebihan HPLC : Daya ulangnya lebih baik. Dari data kelarutan,hslnya dapt diprediksikan Dpt menghasilkan puncak yg simetris dan lebih tajam u/senyawa yg stabilitas thd suhu terbatas Mrpkn teknik analisis yg peka & dpt memisahkan senyawa

yg sangat serupa dg resolusi yang baik. Waktu pemisahan singkat 5-10 mnt U/analisa kuantitatif

FASE STASIONER

Ada 2 tipe bhn isian yaitu : Pellicular beads

o Bgn dlm padat tdk berporio Dr silika

Microporous particle Ukurannya kcl 3-10mm shg luas prmukaan besar Effisiensi tinggi krn jmlh plat teoritik 10.000 dlm kolom 25

cm. Pelarut lebih polar sbg fase stasioner (=

kromatografi fase normal) Pelarut non polar (krom fase terbalik)

HPLC FASE NORMAL (Kolom dan pelarut)

a. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

b. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

a. ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.

b. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

KOLOM

Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm yg diisi dg fase stationer berukuran rata-rata 5-10mdr bahan stainless steel

DETEKTOR

Mempunyai sensitivitas yg tinggi Bersifat linear u/jangka konsentrasi tertentu Dapat mendeteksi eluent tanpa

mempengaruhi resolusi kromatogam Tdk terlalu peka terhadap perubahan

berbagai parameter terutama suhu & tekanan

MACAM DETEKTOR Detektor UV

Sebagian senyawa punya serapan khusus di daerah UV & sinar tampak Pengukuran scr kuantitatif berdasar hk Lambert-Beer yg

mngubkan besaran absorbansi dg konsentrasi solute. Hrs digunakan sinar monoromatik/dg panj.gel sempit (2-4

nm) Tipe detektor dg daerah deteksi UV (200-400nm) dan sinar

tampak (400-700 nm) tlh ada shg dpt mndeteksi hmpr semua senyawa organik.

Detektor Fluoresensi u/senyawa yg fluoresen Bersft spesifik dan lbh selektif Sgt peka & dpt mndeteksi kdar senyawa yg sgt kcl spt

aflatoksin, seny aromatik berinti byk, vitamin ttt & derivat asam amino

Kelemahannya krn kepekaan thd senyawa asing sbg kontaminan dlm eluen yg dpt mngganggu kuantifikasi senyawa yg diukur.

Detektor Konduktivitas Prinsip kerja mngukur konduktivitas eluen dari kolom u/mngukur senyawa yg bersft ionik Perlu dihindari pnggunaan buffer ion krn mpnyai

konduktivitas yg tinggi Detektor Indeks Refraksi

Prinsip krja perubahan nilai indeks refraksi dr suatu cairan yg mngalir

u/ analisis gula dan lemak Detektor FID (Flame Ionization Detector)

Senyawa pelarut dihilangkan dahulu Dianalisa senyawa yg target Eluen dr kolom dialirkan pd permukaan kawat ke

evaporator kmdn ke alat pirolisis dan ke FID

Diagram alir HPLC

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor.

Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)

komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom