5. KROMATOGRAFI KOLOM

7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM

1/50

KROMATOGRAFI KOLOM

Tresna Lestari, M.Si., Apt


2/50

PENGERTIAN

Kromatografi kolom adalah kromatografi

yang menggunakan kolom sebagai alat

untuk memisahkan komponen-komponen

dalam campuran.


3/50

KROMATOGRAFI KOLOM

Merupakan kelanjutan dari KLT

Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis

Digunakan untuk memurnikan senyawa ataumemisahkan campuran

Dilaksanakan dalam suatu kolom yang diisi

dengan fase diam Fase diam : Padat, cair

Fase gerak : Cair, gas


4/50

PEMBAGIAN KROMATOGRAFI KOLOM

Fase Diam Fase

Gerak

Jenis

Kromatografi

Padat

Cair KK, KCV, KCKT

Gas KG

CairCair KCKT

Gas KG


5/50

MAKANISME PEMISAHAN

KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi Adsorbsi, komponen yang dipisahkan secaraselektif teradsorbsi pada permukaan adsorben.

Kromatografi Partisi, analit mengalami partisi antara

lapisan cairan fase diam (stasioner) & eluen sebagai fasegerak (mobile).

Kromatografi Pertukaran Ion, komponen berbentuk ionyang terikat pada penukar ion sebagai fase stasioner secaraselektif akan terlepas/terelusi oleh fase mobile.

Kromatografi Filtrasi Gel, fase diam berupa gel permeabel,pemisahan berlangsung spt proses pengayakan ygdidasarkan pd ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.


6/50

KROMATOGRAFI ADSORBSI

Zat padat sebagai adsorben / fase stasioner

Alumina & silika gel paling populer

Urutan dari kemampuan adsorbsi besar ke kecil :

Alumina

Charcoal

Silika gel

Magnesium

Kalium karbonat Sukrosa

Starch

Selulosa

POLAR


7/50

Zat cair sebagai fase gerak/mobile

Elusi terlalu cepat tidak mampu memisahkan campuran

dengan baikElusi terlalu lambat menyebabkan waktu retensi terlalu

lama

Golongan pelarut yang diurutkan berdasarkan kenaikan

adsorbilitasnya pd kolom alumina : Perfluorokarbon

Hidrokarbon jenuh

Hidrokarbon tak jenuh

Halida & eter Aldehid & keton

Alkohol & thiol

Asam & basa

POLAR


8/50

KROMATOGRAFI KOLOM KLASIK

Didasarkan pada adsorbsi komponen campurandengan afinitas berbeda terhadap permukaan fasediam.

Adsorben bertindak sebagai fase diam dan fasegeraknya adalah cairan yang mengalir membawakomponen campuran sepanjang kolom.

Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadapadsorben akan secara selektif tertahan danafinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.


9/50

Cara Penggunaan

Kromatografi Kolom

1. Sampel dikeringkan menggunakan fase diam

2. Sampel dituangkan melalui atas kolom

3. Masukkan pelarut ke dalam kolom

4. Komponen dalam sampel teradsorbsi oleh bahan

penyerap berupa pita sempit pada permukaan

kolom.


10/50

5. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,masing-masing komponen akan bergerak turun

melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap

zona berisi satu macam komponen.

6. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung

dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar

kolom.


11/50

Gambar kromatogafi kolom


12/50

HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY

Fase stasioner berupa cairan dan padatan

Fase diam cair : Pelarut lebih polar (kromatografi fase normal)

Pelarut non polar (krom fase terbalik)

Fase diam padat : Pellicular beads

Bagian dalam padat tidak berpori

Terbuat dari silika

Microporous particle

Ukurannya kecil 3-10mm sehingga luas permukaan besar

Effisiensi tinggi karena jumlah plat teoritik 10.000 dalam kolom

25 cm.


13/50

HPLC FASE NORMAL

a. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang150 sampai 250 mm.

b. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan

fase gerak non polar misalnya heksan.

c. Senyawa-senyawa polar dalam campuran akan melekatlebih lama pada silika yang polar dibanding dengansenyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawayang non polar akan lebih cepat melewati kolom.


14/50

HPLC FASE TERBALIKa. Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi

non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon

panjang pada permukaannya secara sederhana baik

berupa atom karbon 8 atau 18.

b. Fase gerak yang digunakan pelarut polar berupa

campuran air dan alkohol seperti metanol.

c. Senyawa-senyawa non polar akan terikat lebih lama di

dalam kolom sehingga memiliki waktu retensi yanglebih lama.


15/50

Rangkaian Dasar Kolom HPLC


16/50

1. Eluen, berfungsi sebagai fase gerak yang akan

membawa sampel masuk ke dalam kolompemisah.

2. Pompa, berfungsi untuk mendorong eluen dan

sampel masuk ke dalam kolom. Kecepatan alirdapat dikontrol dan perbedaan kecepatan bisa

mengakibatkan perbedaan hasil.

3. Injektor, tempat memasukkan sampel danselanjutnya sampel dapat didistribusikan

masuk ke dalam kolom.


17/50

4. Kolom pemisah, untuk memisahkan

komponen yang ada dalam sampel.5. Detektor, berfungsi membaca komponen

yang lewat ke dalam detektor.

6. Rekorder data, berfungsi merekam dan

mengolah data yang masuk


18/50

KOLOM

Dari bahan stainless steel. Panjang 10-25 cmdan diameter 4,5-5,0 mm yg diisi dg fase

stationer berukuran rata-rata 5-10mm.


19/50

DETEKTOR

Mempunyai sensitivitas yang tinggi

Bersifat linear untuk jangka konsentrasi

tertentu

Dapat mendeteksi eluen tanpa mempengaruhi

resolusi kromatogam

Tidak terlalu peka terhadap perubahan

berbagai parameter terutama suhu & tekanan


20/50

MACAM DETEKTOR Detektor UV

Untuk senyawa yang mempunyai serapan khusus di daerah UV

& sinar tampak.

Pengukuran secara kuantitatif berdasar Hk Lambert-Beer yangmenghubungkan besaran absorbansi dengan konsentrasi solut.

Terdapat daerah deteksi UV (200-400nm) dan sinar tampak(400-700 nm) sehingga dapat mendeteksi hampir semua

senyawa organik.

Detektor Fluoresensi Untuk senyawa yang dapat berfluoresensi seperti aflatoksin,

seny aromatik berinti banyak, vitamin tertentu & derivat asamamino.

Sangat peka & dapat mendeteksi kadar senyawa yang sangatkecil

Kepekaan terhadap senyawa asing sebagai kontaminan dalameluen dapat mengganggu kuantifikasi senyawa yg diukur.


21/50

Detektor Konduktivitas Untuk mengukur senyawa yang bersifat ionik

Perlu dihindari penggunaan buffer ion karena mempunyaikonduktivitas yang tinggi

Detektor Indeks Refraksi Prinsip kerja perubahan nilai indeks refraksi dari suatu cairan

yang mengalir

Untuk analisis gula dan lemak

Detektor FID (Flame Ionization Detector) Senyawa pelarut dihilangkan dahulu

Eluen dr kolom dialirkan ke evaporator kemudian ke alat pirolisisdan ke FID

Yang dianalisa hanya senyawa target


22/50

Interaksi Antara Fase Diam dan Analit

(Adsorbsi Isotermik)

a. Tipe konkap, terjadi bila mula-mula linaruttidak kuat interaksinya. tetapi kemudianmenjadi lebih kuat sehingga terikat lamapada fase diam. berarti K < 1

b. Tipe normal (linier), ikatan yang terjadi padasetiap saat panggah atau tetap. Sehinggaberupa garis lurus dan K = 1.

c. Tipe konvek, adsorpsi mula-mula terikatdengan kuat oleh fese diam, tetapi makinlama makin lemah sehingga bentuk kurvanyamenjadi konvek atau harga K>1


23/50

Contoh Gambar Adsorbsi Isotermik

23

Gambar:


24/50

Retensi (Tambat)

Sifat retensi suatu linarut menggambarkan

jenis distribusi linarut diantara fase gerak dan

fase diam

Retensi diukur berdasarkan waktu dimana

sampel diinjeksikan sampai sampel

menunjukkan ketinggian puncak yang

maksimum dari senyawa itu.

Retensi ini dinyatakan sebagai VR (volume

tambat) atau tR

(waktu tambat)


25/50

Volumefase gerak yang diperlukan untuk

membawa linarut dari kolom sampai ke

detektor dinamakan volume retensi (VR)

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk

bergerak melalui kolom menuju detektor

disebut waktu retensi (tR)


26/50

Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan

sangat bervariasi dan bergantung pada:

Tekanan yang digunakan (karena itu akan

berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuatdari material apa, tetapi juga pada ukuran

partikel)

Komposisi yang tepat dari pelarut

Temperatur pada kolom


27/50

27

Tambat Relatif

Tambat relatif () merupakan rasio tambat antara dualinarut yang berbeda setelah dielusi

Makin besar harga akan makin besar selisih waktutambat linarut 2 - waktu tambat linarut 1.

Berarti kedua puncak linarut tersebut dapat terpisah

dengan baik. Keadaan tersebut menggambarkan kemampuan fase

membedakan linarut 1 dan linarut 2.


28/50

Campuran sebelum elusi

Puncak dan Bercak


29/50

Keterangan

29

Puncak pada KCKTp-dihidroksi benzen palinglama tertahan dalam kolom dengan fase diam

silika gel. Karena iktannya paling kuat.

Bercak pada KLTp-dihidroksi benzin paling

pendek migrasinya, karena ikatan dengan fasediam silika paling kuat.

Makin dekat gugus hidroksil, ialah meta dihidroksi

dan o dihidroksi benzen paling mudah terelusi

oleh pelarut karena ikatan adsorbsinya dengan

silika makin lemah.


30/50

KROMATOGRAFI GAS

Adalah teknik untuk memisahkansenyawa atsiri dalam fase gas melalui fasediam


31/50

Macam Kromatografi Gas

Kromatografi gas - padat : fase diam adalah

butiran-butiran adsorben dan fase gerak

adalah gas

Kromatografi gas - cair : fase diam adalah

cairan yang disalutkan pada permukaan tipis

butiran padat dan fase gerak adalah gas

http://www.catatankimia.com
http://www.catatankimia.com/http://www.catatankimia.com/


32/50

RANGKAIAN DASAR ALAT

KROMATOGRAFI GAS


33/50

Bagian dasar kromatografi gas :

1. Sistem gas pembawa

2. Sistem pemasukan cuplikan

3. Sistem pemanasan kolom

4. Kolom

5. Sistem deteksi

6. Sistem pengolah data


34/50

Syarat Sampel

Harus memiliki keatsirian yang cukup(Volatil)

Stabil terhadap panas

Tidak terdekomposisi pada suhuoperasional KG (< 450oC)


35/50

1. Lembam

2. Koefisien difusi gas rendah

3. Kemurnian tinggi

4. Mudah didapat dan murah

5. Cocok dengan detektor yang dipakai

Contoh gas pembawa : N2, He, H2, Ar, dll

Syarat Gas Pembawa


36/50

PRINSIP KERJA KROMATOGRAFI GAS

Injektor merupakan tempat masuknya sampel kedalam sistem KG

Injektor dipanaskan antara 150 ~ 250oC gunamenguapkan sampel dan pelarutnya.

Linarut-linarut yang berfase uap ini akandigerakkan ke kolom oleh gas pembawa.

Kolom berada dalam oven yang terkontrol

suhunya. Laju migrasi komponen sampel dalam kolom

ditentukan oleh : sifat-sifat fisikokimianya,suhu dan komposisi kolom.


37/50

Dalam kolom, komponen sampel mengalir dengan

kecepatan yang berbeda-beda. Komponen yang bergerak tercepat akan keluar dari

kolom paling awal dan diikuti dengan sisanya.

Komponen yang terpisah menuju detektor akanmenghasilkan sinyal listrik yang besarnya

proporsional.

Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier.

Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa

puncak.


38/50

GAS DAN DETEKTOR

Detektor GasPembawa

GasPembakar

GasPendukung

1. TCD He/Ar/N2/H2 __ _____

2. FID He/N2 H2 Udara

3. FTD He/N2 H2 Udara

4. FPD He/N2 H2 Udara

5. ECD N2 __ _____


39/50

GAS DAN TEKANAN

Tipe Gas Tekanan Gas yang dibutuhkan

1. Gas Pembawa 7 kg/cm2 atau lebih tinggi

2. Gas Pembakar 2 kg/cm2 atau lebih tinggi

3. Gas Pendukung 2 kg/cm2 atau lebih tinggi


40/50

SISTEM DETEKSI

( DETEKTOR)Detektor Senyawa yang

terdeteksiJumlahminimum

TCD Semua senyawa kecuali gaspembawa

10 ppm (10 ng)

FID Senyawa organik 0,1 ppm (0,1 ng)

ECD Senyawa halogen/logamorganik

0,1 ppb (0,1 pg)

FTD Senyawa nitrogen/fosfor

organik

1 ppb (1 pg)/

0,1 ppb (0,1 pg)


41/50

THERMAL CONDUCTIVITY DETECTOR (TCD)

Mendeteksi semuasenyawa yangmemiliki perbedaan

konduktivitas dengangas pembawa.


42/50

FLAME IONIZATION DETECTOR (FID)

Sensitif terhadapsenyawa-senyawaorganik padaumumnya.


43/50

ELECTRON CAPTURE DETECTOR (ECD)

Sensitif terhadapsenyawa-senyawa

halogen dan logamorganik.

Biasanya untuk analisispestisida organoklorin


44/50

FLAME THERMIONIC DETECTOR (FTD

/NPD)

Sensitif terhadap senyawafosfor organik dannitrogen organik.

Biasanya untuk analisispestisida dan produkmedikal.


45/50

FLAME PHOTOMETRIC DETECTOR (FPD)

Sensitif terhadapsenyawa-senyawafosfor organik,

sulfur organik dantimah organik.

Biasanya untukanalisis pestisidadan flavour.


46/50

SISTEM PENGOLAH DATA

Sinyal yang didapat dari detektor akan direkamdalam bentuk kromatogram dan diolah.


47/50

KROMATOGRAM

Kromatogram ideal mempunyai deretanpuncak yang rapat namun tidakbertumpukkan.

Ukuran puncak hasil analisis berhubunganbanyaknya senyawa dalam cuplikan.

Bila konsentrasi sebuah senyawabertambah maka ukuran puncakpunmembesar.


48/50

Contoh Kromatogram


49/50

Contoh Kromatogram


50/50

TERIMAKASIH

5. KROMATOGRAFI KOLOM

Documents

Transcript of 5. KROMATOGRAFI KOLOM