MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK … · Dari dasar hati penulis menyampaikan terima kasih...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK Pandanus

conoideus Lamk VARIAN BUAH KUNING

Disusun Oleh:

KURNIA DYAH SUGESTI

M0305041

SKRIPSI

Ditulis dan Diajukan untuk memenuhi sebagian

persyaratan mendapatkan gelar sarjana Sains Kimia

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM

UNVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

Oktober, 2010

i


commit to user

HALAMAN PENGESAHAN

Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Sebelas Maret Surakarta Telah Mengesahkan Skripsi Mahasiswa:

Kurnia Dyah Sugesti M 0305041, dengan judul ”Modifikasi Teknik

Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari Ekstrak Pandanus

conoideus Lamk Varian Buah Kuning”

Skripsi ini dibimbing oleh:

Pembimbing I

Dr.rer.nat Fajar Rakhman W,M.Si

NIP 19730605 200003 1001

Pembimbing II

M. Widyo Wartono, M.Si

NIP 19760822 200501 1001

Dipertahankan di depan Tim Penguji Skripsi pada:

Hari : Kamis

Tanggal : 07 Oktober 2010

Anggota Tim Penguji:

1. Dra. Tri Martini, M.Si 1.............................

NIP 19581029 198503 2002

2. Yuniawan Hidayat, M.Si 2. .............................

NIP 19790605 200501 1001

Disahkan Oleh

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Sebelas Maret Surakarta

Ketua Jurusan Kimia,

Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D. NIP 19560507 198601 1001

ii


commit to user

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul

”MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN

TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK PANDANUS CONOIDEUS LAMK VARIAN

BUAH KUNING” adalah benar-benar hasil penelitian sendiri dan tidak terdapat

karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu

perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat kerja atau

pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara

tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Oktober 2010

Kurnia Dyah Sugesti

iii


commit to user

MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK (Pandanus conoideus

Lamk) VARIAN BUAH KUNING

KURNIA DYAH SUGESTI Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Sebelas Maret

ABSTRAK

Buah kuning merupakan salah satu varian dari Buah Merah (Pandanus conoideus Lamk). Perbedaan utama dari ekstrak buah kuning dengan ekstrak buah merah adalah kadar asam lemak tak jenuh dan senyawa antioksidannya dimana dalam ekstrak buah merah mempunyai kadar yang lebih banyak daripada ekstrak buah kuning. Pada penelitian ini telah dilakukan pemisahan trigliserida dari ekstrak buah kuning dengan modifikasi teknik kromatografi kolom. Modifikasi dilakukan dengan menambahkan alumina basa dan agen pengoksidasi berupa MnO2 kedalam fasa diam silika gel. Elusi dilakukan dengan menggunakan fasa gerak petroleum eter dan dietil eter. Fraksi yang dihasilkan kemudian diidentifikasi dengan menggunakan IR dan GC-MS.

Pemisahan menggunakan fasa diam silika gel-alumina (2:3) dengan penambahan MnO2 3% menghasilkan 3 fraksi. Spektra FT-IR dari fraksi pertama menunjukkan adanya serapan yang khas untuk beberapa gugus fungsi yaitu ester dari trigliserida dan alkana rantai panjang. Spektra GC-MS menunjukkan metil ester dari asam lemak yaitu asam oleat, palmitat, dan stearat serta teridentifikasi senyawa 1-0-oktadekanoil-1,2-etanadiol dan glikol-1-palmitat yang merupakan produk tak sempurna dari oksidasi trigliseridanya. Komponen trigliserida telah terpisah dari senyawa lain dalam ekstrak buah seperti β-karoten dan tokoferol. Kedua senyawa tersebut merupakan antioksidan yang dapat mencegah oksidasi asam lemak tak jenuh. Dari hasil analisis, diketahui bahwa trigliserida dapat dipisahkan dari senyawa yang lain dengan modifikasi teknik kromatografi kolom tanpa merusak senyawa tersebut karena keberadaan senyawa antioksidan dapat melindungi trigliserida dari reaksi oksidasi.

Kata kunci: Buah kuning, modifikasi kromatografi kolom, trigliserida, senyawa antioksidan, auto-oksidasi.

iv


commit to user

MODIFICATION OF COLUMN CHROMATOGRAPHY TECHNIQUE FOR TRIGLYCERIDES SEPARATION FROM Pandanus conoideus

LAMK VARIANT YELLOW FRUIT

KURNIA DYAH SUGESTI Department of Chemistry, Faculty of Mathematic and Sciences

Sebelas Maret University

ABSTRACT Yellow fruit is one variant of Pandanus conoideus Lamk. The main

different of yellow and red fruit extract is the concentration of unsaturated fatty acid and antioxidant agent where the red fruit much higher than yellow fruit. Triglycerides separated from yellow fruit extract using modification of column chromatography was done. The modification was done by an addition of basisch alumina and oxidizing agent that is MnO2 into stationary phase. Fractions was obtained from separation then determined by IR and GC-MS.

Separation used stationary phase of silica gel-alumina(2:3) by an addition MnO2 3% result 3 fractions. Spectra IR from the first fraction showed the presence of several characteristic functional groups, that is ester from triglycerides and long chain alkane. GC-MS spectrum showed metyl ester from triglycerides such as oleic acid palmitate acid, and stearate acid also new compound was identified as 1-0-octadecanoyl-1,2-ethanediol and glycol-1-palmitate which the unperfect product from triglycerides oxidation. Triglycerides have been separated from other compound in extract such as β-karoten and tokoferol. Both of them are antioxidant that prevent unsaturated fatty acid oxidation. From the analysis result, could be known that triglycerides could be separated from the other compound with modification of column chromatography without changed this compound because the antioxidant were protecting triglycerides from oxidation reaction.

Key word : yellow fruit, modification of column chromatography, triglyserides, ontioxidant agent, auto-oxidation.

v


commit to user

MOTTO

Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu

telah selesai (dari suatu urusan), Kerjakanlah dengan sungguh-sungguh

(urusan) yang lain.

(Alam Nasyrah: 6-7)

Tinta bagi seorang pelajar lebih suci nilainya daripada darah seorang martir

( Muhammad SAW)

Semua yang pasti di dunia ini adalah ketidakpastian itu sendiri dan Tuhan

memelihara ketidakpastian itu pada seluruh umat manusia agar manusia

terus belajar dan terus bermimpi

(Albert Einstein)

Sebaik-baiknya manusia adalah manusia yang memberi manfaat untuk

orang lain

(5 cm)

vi


commit to user

PERSEMBAHAN

Kupersembahkan perjuangan ku ini kepada:

Ibu dan bapak yang telah memberikanku kesempatan untuk

membanggakan kalian dengan cara ku

Kakak dan adik tercinta yang selalu mendukungku

Someone yang selalu setia menungguku ur still the one

vii


commit to user

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat-Nya

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Skripsi yang berjudul “

Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari

Ekstrak Pandanus conoideus Lamk Varian Buah Kuning ” ini disusun atas

dukungan dari berbagai pihak. Dari dasar hati penulis menyampaikan terima kasih

kepada:

1. Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret,

Surakarta.

2. Dr.rer.nat. Fajar Rakhman Wibowo,M.Si selaku pembimbing I dan

pembimbing akademik, terimakasih atas bantuan, arahan dan kesabarannya

membimbing selama melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3. M. Widyo Wartono, M.Si selaku pembimbing II, yang telah memberikan

bimbingan dan arahan.

4. I.F. Nurcahyo, Msi., selaku Ketua Laboratorium Kimia Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret.

5. Seluruh Dosen di Jurusan Kimia, Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas ilmu yang berguna dalam

menyusun skripsi ini.

6. Para Laboran di Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas bantuan dan kerjasama

yang baik.

7. Teman-temanku angkatan 2005 yang senantiasa mendukungku. Special

thank’s for Sulis, Arini, Erma, Lenia, Okly, ijup, Sofi.

8. Semua pihak yang tidak dapat kami sebutkan satu persatu.

Semoga Allah SWT membalas jerih payah dan pengorbanan yang telah diberikan

dengan balasan yang lebih baik.

viii


commit to user

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh

karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dalam rangka

untuk menyempurnakan skripsi ini. Akhir kata, semoga karya kecil in dapat

memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan bagi pembaca.

Surakarta, Oktober 2010

Kurnia Dyah Sugesti

ix


commit to user

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .................................................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ...................................................................... iii

HALAMAN ABSTRAK............................................................................... iv

HALAMAN ABSTRACT ............................................................................ v

HALAMAN MOTTO ................................................................................... vi

PERSEMBAHAN ......................................................................................... vii

KATA PENGANTAR .................................................................................. viii

DAFTAR ISI ................................................................................................ ix

DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv

BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................ 1

A. Latar Belakang Masalah ........................................................... 1

B. Perumusan Masalah................................................................... 2

1. Identifikasi masalah ............................................................. 2

2. Batasan masalah.................................................................... 4

3. Rumusan masalah................................................................. 4

C Tujuan Penelitian ...................................................................... 4

D. Manfaat Penelitian ................................................................... 5

BAB II. LANDASAN TEORI......................................................... ............. 6

A. Tinjauan Pustaka ..................................................................... 6

1. Buah kuning. ........................................................................ 6

2. Komponen-komponen pada ekstrak buah kuning ................ 7

a. Komponen trigliserida ....................................................... 8

1) Trigliserida...................................................................... 8

2) Asam lemak bebas ........................................................ 9

x


commit to user

3) Oksidasi asam lemak .................................................... 10

b. Komponen non trigliserida ................................................ 12

1) Karotenoid ..................................................................... 12

2) Tokoferol ....................................................................... 15

c. Aktivitas antioksidan ......................................................... 15

1) Radikal bebas.................................................................. 15

2) Antioksidan.................................................................... 17

3. Kromatografi ....................................................................... 18

a. Kromatografi kolom .......................................................... 18

b. Alumina ............................................................................. 19

c. Silika gel ............................................................................ 21

4. Mangan dioksida(MnO2)...................................................... 22

B. Kerangka pemikiran .................................................................. 23

C. Hipotesis .................................................................................... 24

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ........ .................................... 25

A. Metodologi Penelitian .............................................................. 25

B. Tempat dan Waktu Penelitian .............................................. ... 25

C. Alat dan Bahan .................................................. ...................... 25

1. Alat-alat yang digunakan........................................ ............. 25

2. Bahan-bahan yang digunakan .............................................. 26

D. Prosedur Penelitian..................................................................... 26

1. Clean up sampel....................................................... ........... 26

2. Pembuatan 0,5% rhodamin B dalam etanol ......................... 26

3. Kromatografi lapis tipis ....................................................... 26

4. Kromatografi kolom flash..................................................... 27

E.Teknik pengumpulan dan analisis data........................................ 27

a. Pengumpulan data ................................................................ 27

b. Analisis data ......................................................................... 28

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 29

A. Persiapan sampel ...................................................................... 29

B. Penentuan fasa gerak dan fasa diam ......................................... 29

xi


commit to user

C. Pemisahan dengan kromatografi kolom flash .......................... 33

D. Identifikasi senyawa ................................................................. 36

E. Pengaruh penambahan alumina dan MnO2 .............................. 45

F. Pengaruh keberadaan antioksidan dalam ekstrah buah kuning . 46

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 49

a. Kesimpulan...................................................................................... 49

a. Saran .. ............................................................................................. 49

DAFTAR PUSTAKA ........... ........................................................................ 50

LAMPIRAN.................................................................................................. 54

xii


commit to user

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Beberapa asam lemak yang umum.............................................. 8

Tabel 2. Komposisi asam lemak dari minyak buah kuning ...................... 10

Tabel 3. Urutan kepolaran eluen, elusi senyawa dan kekuatan adsorben

dalam kromatografi ..................................................................... 19

Tabel 4. Harga Rf dari spot hasil pemisahan buah kuning ....................... 30

Tabel 5. Harga Rf, warna dan berat total tiap fraksi ................................. 35

Tabel 6. Perbandingan data GC-MS dengan kandungan dalam ekstrak

buah kuning ................................................................................. 44

xiii


commit to user

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Buah kuning .......................................................................... 6

Gambar 2. Struktur molekul monogliserida, digliserida dan trigliserida 9

Gambar 3. Reaksi kondensasi asam lemak ............................................. 9

Gambar 4. Contoh struktur molekul asam lemak bebas (asam oleat) ..... 10

Gambar 5. Mekanisme oksidasi asam lemak pada tahap inisiasi dan

propagasi ............................................................................... 11

Gambar 6. Konversi β-karoten ................................................................ 14

Gambar 7. Struktur α-tokoferol .............................................................. 15

Gambar 8. Struktur alumina .................................................................... 20

Gambar 9. Struktur dasar alumina a) asam, b) netral, c) basa ................ 21

Gambar 10. Struktur silika gel .................................................................. 22

Gambar 11. Pengubahan vitamin A menjadi retinal oleh MnO2 .............. 23

Gambar 12. Plat KLT ekstrak buah kuning dengan modifikasi Si-Al

(2:3)+MnO2 a). 3% dan b). 5% ............................................ 31

Gambar 13. Kromatografi kolom flash ..................................................... 33

Gambar 14. Grafik perubahan masa tabung hasil pemisahan dengan

kromatografi kolom flash ...................................................... 34

Gambar 15. Perbandingan Rf plat silika gel awal dengan Rf dari eluat ... 35

Gambar 16. Puncak-puncak serapan analisis FT-IR terhadap fraksi

pertama .................................................................................. 37

Gambar 17a. Kromatogram GC-MS ekstrak buah kuning murni ............... 38

Gambar 17b. kromatogram GC-MS fraksi trigliserida……………………. 38

xiv


commit to user

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kolom kromatografi modifikasi............................................ 54

Lampiran 2. Gambar plat pemisahan dengan silika gel dan

silika+alumina (2:3)............................................................... 55

Lampiran 3. Kondisi operasi GC-MS QP2010S Shimadzu ...................... 56

Lampiran 4. Spektrum analisis GC-MS ekstrak buah kuning murni ........ 57

Lampiran 5. Spektrum analisis GC-MS fraksi trigliserida ........................ 59

Lampiran 6. Spektrum FT-IR fraksi trigliserida ........................................ 64

Lampiran 7. Bagan alir cara kerja ............................................................. 65

xv


commit to user

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) merupakan salah satu buah

endemik Papua. Empat varian utama dari P. conoideus dikenal oleh masyarakat

sekitar karena nilai ekonominya sebagai tanaman obat. Keempat varian P.

conoideus diantaranya adalah merah panjang, merah pendek, cokelat dan kuning

(Budi, 2001). Beberapa bukti empiris menunjukkan bahwa P. conoideus varian

kuning (yang kemudian dikenal dengan buah kuning) dapat bertindak sebagai

obat antikanker meskipun mekanisme penghambatan terhadap sel kanker oleh

buah ini belum sepenuhnya dapat diketahui (Astirin, 2008).

Analisis pendahuluan terhadap ekstrak buah kuning terungkap bahwa

ekstrak buah kuning mengandung: total karoten (9.500 ppm); β-karoten (240

ppm); tokoferol (10.400 ppm) dan beberapa asam lemak seperti asam oleat, asam

linoleat dan asam palmitat serta omega 3 dan omega 9 yang dikenal sebagai

antioksidan yang dapat mencegah berbagai penyakit termasuk kanker (Budi,

2001). Kandungan senyawa dalam buah kuning hampir sama dengan varian buah

merah panjang hanya berbeda dalam komposisi asam lemak jenuhnya dan kadar

asam lemak tak jenuh serta senyawa antioksidannya.

Asam lemak terdapat dalam tumbuhan terutama dalam bentuk terikat,

teresterkan dengan gliserol sebagai lemak yaitu berupa triasil gliserol atau

trigliserida (Harborne, 1987; Muchalal, 2004). Ikatan tak jenuh yang ada dalam

asam lemak merupakan pusat aktif yang dapat bereaksi dengan oksigen.

Peroksidasi (auto-oksidasi) lipida dapat menyebabkan kerusakan jaringan tubuh

secara in vivo sehingga menimbulkan beberapa penyakit seperti kanker. Efek yang

merusak ini ditimbulkan oleh radikal bebas (ROO*, RO*, OH*) yang dihasilkan

saat pembentukan peroksida dari asam lemak. Keberadaan antioksidan dalam

ekstrak buah dapat menghambat atau mencegah reaksi auto-oksidasi pada lipida.

Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat pada radikal peroksida

(ROO*, RO*, OH*) dan mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil.

1


commit to user

Autooksidasi yang terjadi pada asam lemak relatif lebih cepat apabila

ekstrak lipida dalam ekstrak buah dipisahkan dari komponen senyawa yang lain.

Sebaliknya apabila dilakukan pemisahan langsung dari bahan awal reaksi

autooksidasinya menjadi lebih lambat. Amplifikasi yang dilakukan dengan

menambahkan oksidator pada proses kolom akan dapat diketahui seberapa besar

kekuatan oksidasi dari asam lemak tak jenuhnya dan ketahanan terhadap reaksi

oksidasi karena keberadaan senyawa antioksidan yang terdapat pada ekstrak buah.

Penelitian yang telah dilakukan pada ekstrak lipida dari ekstrak buah

merah menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fasa diam modifikasi

yaitu berupa silika gel-alumina (2:3) dan oksidator berupa MnO2 diperoleh hasil

suatu produk turunan asam lemak yaitu berupa dioktil phtalat dan bis(2-etilheksil)

adipat (Handayani, 2008). Sedangkan ekstrak β-karoten dari buah merah juga

telah dipisahkan dengan menggunakan teknik modifikasi tersebut. Modifikasi fasa

diam tersebut menyebabkan senyawa β-karoten mengalami perubahan (Rumanthi,

2008).

Adanya perbedaan komposisi dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah

kuning dimungkinkan berpengaruh terhadap proses pemisahan senyawanya.

Kandungan asam lemak tak jenuh dalam ekstrak buah merah lebih besar daripada

ekstrak buah kuning, sehingga kemungkinan asam lemak yang bereaksi dengan

oksidator lebih besar pada buah merah. Berdasarkan hal tersebut, pada penelitian

ini dilakukan modifikasi yang sama dengan modifikasi yang dilakukan pada

ekstrak buah merah dengan memperhatikan pengaruh perbedaan kadar asam

lemak dan potensi antioksidan dengan penambahan oksidator yang tinggi, apakah

reaksi yang terjadi akan sekuat pada buah merah jika modifikasi ini dilakukan

pada buah kuning.

B. Perumusan Masalah

1. Identifikasi Masalah

Buah kuning (Pandanus conoideus Lamk.) mengandung trigliserida dan

senyawa lain seperti β-karoten dan tokoferol. Komposisi utama dalam ekstrak

buah kuning didominasi oleh asam lemaknya. Kandungan asam lemak tak jenuh

2


commit to user

dalam ekstrak buah kuning sekitar 58,018%, sedangkan kandungan asam lemak

tak jenuh dalam ekstrak buah merah sekitar 65,74%. Selisih asam lemak tak jenuh

dalam ekstrak buah kuning dan ekstrak buah merah sebesar 7,722%. Dalam

ekstrak buah merah juga terdapat adanya asam lemak bebas. Selain komposisi

asam lemak, komposisi antioksidan dalam ekstrak buah kuning juga berbeda

dengan ekstrak buah merah. Total antioksidan dalam ekstrak buah kuning sebesar

20.140 ppm (2,014%), sedangkan total antioksidan dalam eksrak buah merah

sebesar 23.700 ppm (2,37 %). Selisih antioksidan dalam ekstrak buah merah dan

ekstrak buah kuning sebesar 3.560 ppm (0,356%).

Asam lemak dalam ekstrak buah kuning dapat dipisahkan dari senyawa

lain dengan berbagai macam teknik pemisahan diantaranya kromatografi kolom.

Penambahan alumina dalam fasa diam dapat mengakibatkan perubahan

irreversibel. Alumina menyebabkan reaksi saponifikasi gliserida dan auto-oksidasi

asam lemak (Schultz, 1962). Alumina untuk kromatografi berada dalam bentuk

basa (pH 9,5), asam (pH 4,5 dalam air) dan netral. Alumina basa merupakan

alumina yang lebih reaktif dibandingkan dengan alumina lainnya dan dapat

menyebabkan reaksi polimerisasi, kondensasi dan dehidrasi (Gordon, 1972;

Cannel, 1998). Penambahan oksidator (MnO2) pada fasa diam juga dapat

mengoksidasi senyawa alkohol menjadi aldehid. Ekstrak lipida dari ekstrak buah

merah memerlukan komposisi MnO2 sebanyak 1,5% untuk dapat berubah menjadi

bentuk turunannya (Handayani, 2008). Sedangkan ekstrak β-karoten

membutuhkan MnO2 sebanyak 5% untuk dapat berubah (Rumanthi, 2008).

Modifikasi yang telah dilakukan untuk ekstrak buah merah akan diperoleh

senyawa turunan asam lemak yang berupa dioktil pthalat (Novianti,2010).

Modifikasi yang dilakukan tanpa memisahkan senyawa awal dari komponen yang

lain akan menurunkan produk dioktil pthalat yang dihasilkan. Apabila dilakukan

modifikasi yang sama untuk buah kuning dimungkinkan akan terjadi reaksi yang

sama dan dapat juga berbeda. Mengingat perbedaan kadar antara asam lemak

dalam ekstrak buah kuning dengan ekstrak buah merah serta perbedaan kadar

senyawa antioksidan yang dapat menghambat autoksidasi asam lemaknya.

3


commit to user

2. Batasan Masalah

1. Sari buah kuning yang digunakan adalah sari buah kuning dari papua yang

diproduksi oleh I Made Budi.

2. Teknik yang digunakan untuk memisahkan dan atau mereaksikan

trigliserida didalam ekstrak buah kuning adalah teknik kromatografi kolom

yang dimodifikasi fasa diamnya.

3. Fasa diam yang digunakan adalah campuran silika-alumina basa dengan

perbandingan 2:3 dan penambahan MnO2 3% dan 5%.

3. Rumusan Masalah

1. Apakah dapat dilakukan pemisahan trigliserida dalam ekstrak buah kunig

dengan menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom yaitu berupa

penambahan alumina basa dan oksidator kedalam fasa diam silika gel,

dengan memperhatikan pengaruh senyawa antioksidan dalam ekstrak

tersebut.

2. Dengan memperhatikan perbedaan kadar antara asam lemak tak jenuh dan

antioksidan dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah kuning apakah

dalam fraksi trigliseridanya dapat dihasilkan senyawa turunan asam lemak

(dioktil pthalat) seperti yang diperoleh dalam ekstrak buah merah.

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk memisahkan trigliserida dari ekstrak

buah kuning menggunakan modifikasi kolom kromatografi dengan

memperhatikan adanya pengaruh senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning

serta perbedaan kadar antara asam lemak tak jenuh dan senyawa antioksidannya

sehingga dapat diketahui pada ekstrak trigliserida kemungkinan dihasilkannya

senyawa dioktil ptalat seperti pada ekstrak buah merah.

4


commit to user

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah memberikan

informasi reaksi sekaligus pemisahan trigliserida dari ekstrak buah kuning

menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom dengan memperhatikan

pengaruh dari adanya suatu antioksidan dan perbedaan kadar asam lemak tak

jenuh serta senyawa antioksidan di dalam ekstrak buah kuning dan ekstrak buah

merah.

5


commit to user

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Buah Kuning

Buah kuning (Pandanus conoideus Lamk.) termasuk dalam famili

Pandanaceae dengan varian kuning. Didaerah asalnya Papua, tanaman ini dikenal

dengan nama sait, mongka memyeri, atau barkum. Buah ini tersebar hampir di

seluruh wilayah Bumi Cendrawasih terutama di Pegunungan Arfak. Buah kuning

berwarna kuning muda. Ukurannya mencapai panjang 102 cm, diameter 20 cm

dan bobot 4 – 7,5 kg. Buah dibungkus dengan daun memanjang, pohonnya

menjulang setinggi 16 – 17 m, ditopang akar – akar tunjang berdiameter 6 – 7 cm

sepanjang 2,5 – 3,7 m. daun berwarna hijau tua, lanset dan ujung meruncing.

Panjang daun 88 – 102 cm dan lebar 6 – 10 cm. seluruh tepi daun ditumbuhi duri

sepanjang 1 mm ( Mangan, 2005 ).

Gambar 1. Buah kuning

Bagi masyarakat Wamena, buah kuning digunakan untuk pesta adat,

namun banyak pula yang memanfaatkannya sebagai obat. Khasiat buah merah dan

buah kuning yang sudah dikonsumsi turun-temurun di Papua dipercaya mampu

menyembuhkan berbagai penyakit seperti penyakit mata, kulit, kanker rahim dan

kanker paru-paru serta kanker hati (Moeljopawiro, 2007).

β-Karoten dalam buah kuning berfungsi memperlambat berlangsungnya

penumpukan flek pada arteri. Interaksinya dengan protein meningkatkan produksi

antibodi. Ini meningkatkan jumlah sel pembunuh alami yang dapat menekan

kehadiran sel-sel kanker dan menangkal radikal bebas senyawa karsinogen

6


commit to user

penyebab kanker. Konsumsi β-karoten rutin membuat tubuh dapat memperbanyak

sel-sel alami pembasmi penyakit. Bertambahnya sel-sel tersebut akan menekan

kehadiran sel kanker dengan menetralisir radikal bebas senyawa karsinogen

penyebab kanker. Tokoferol (vitamin E) berfungsi hampir sama dengan β-karoten

yaitu pencegah penyakit degeneratif. Tokoferol akan mematikan serbuan radikal

bebas dan menetralisir kolesterol dalam darah (Dermawan, 2005; Duryatmo,

2005; Sofia, 2005).

2. Komponen-Komponen pada Ekstrak Buah Kuning

Komponen penyusun buah kuning terdiri dari trigliserida dan non

trigliserida. Asam-asam lemak penyusun trigliserida terdiri dari asam lemak jenuh

dan asam lemak tak jenuh. Asam lemak merupakan asam organik berantai

panjang yang mempunyai atom karbon dari (C4:0) sampai (C20:0). Asam lemak

mempunyai gugus karboksil tunggal dan ekor hidrokarbon non polar yang

panjang, yang menyebabkan kebanyakan lipid bersifat tidak larut didalam air

(Lehninger, 1990). Asam lemak jenuh adalah asam lemak dengan rantai karbon

yang tidak mengandung ikatan rangkap, sedangkan asam lemak tidak jenuh adalah

asam lemak yang mengandung satu atau lebih ikatan rangkap (Poedjiadi, 1994).

Beberapa contoh asam lemak disajikan dalam tabel 1.

Keberadaan ikatan ganda pada asam lemak tak jenuh menjadikannya

memiliki dua bentuk: cis dan trans. Semua asam lemak nabati alami hanya

memiliki bentuk cis (dilambangkan dengan "Z"). Asam lemak bentuk trans

(trans fatty acid, dilambangkan dengan "E") hanya diproduksi oleh sisa

metabolisme hewan atau dibuat secara sintetis. Akibat polarisasi atom H,

asam lemak cis memiliki rantai yang melengkung. Asam lemak trans karena

atom H-nya berseberangan tidak mengalami efek polarisasi yang kuat dan

rantainya tetap relatif lurus.

Warna minyak disebabkan oleh adanya pigmen, karena asam lemak dan

gliseridanya tidak berwarna. Warna orange dan kuning disebabkan adanya pigmen

karoten yang larut dalam minyak tersebut. Apabila minyak dihidrogenasi, maka

akan terjadi pula hidrogenasi pigmen yang dikandungnya, akibatnya terjadi

7


commit to user

pengurangan warna pada minyak. Karoten tidak stabil pada suhu tinggi dan bila

minyak diolah dengan menggunakan uap panas, maka karoten akan kehilangan

warnanya (Ketaren, 1986).

Tabel 1. Beberapa Asam Lemak yang Umum

Nama Rumus

Asam Lemak Jenuh Butirat Kaproat Kaprilat Kaprat Laurat

Miristat Palmitat Stearat

Arakidat Behenat

Lignoserat

CH3(CH2)2COOH CH3(CH2)4COOH CH3(CH2)6COOH CH3(CH2)8COOH CH3(CH2)10COOH CH3(CH2)12COOH CH3(CH2)14COOH CH3(CH2)16COOH CH3(CH2)18COOH CH3(CH2)20COOH CH3(CH2)22COOH

Asam Lemak Tak Jenuh Palmitoleat

Oleat Petroselinat

Linoleat Linolenat

Elaeostrearat Arakidonat

Erusat

CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4COOH

CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH

CH3(CH2)3CH=CHCH=CHCH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)4CH=(CHCH2CH)3=CH(CH2)3COOH

CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH

a. Komponen Trigliserida

(1). Trigliserida

Trigliserida adalah triester dari gliserol dengan asam-asam lemak, yaitu

asam-asam karboksilat beratom karbon 6 s/d 30. Trigliserida banyak dikandung

dalam minyak dan lemak, merupakan komponen terbesar penyusun ekstrak buah

kuning. Selain trigliserida, terdapat juga monogliserida dan digliserida. Struktur

molekul dari ketiga macam gliserid tersebut dapat dilihat pada Gambar 1.

(Puspasari, 2007).

8


commit to user

R

O

OH

O

OH

R

O

OH

O

O

O

R

O

O

R3

R1

O

O

O

O

R2

monogliserida digliserida trigliserida

Gambar 2. Struktur molekul monogliserida, digliserida, dan trigliserida

R1, R2, dan R3 merupakan rantai hidrokarbon yang berupa asam lemak dengan

jumlah atom C lebih besar dari sepuluh. Senyawa inilah yang akan dikonversi

menjadi ester melalui reaksi transesterifikasi.

Trigliserida yang pada suhu kamar berupa zat padat disebut lemak,

sedangkan trigliserida yang berupa cairan disebut minyak. Secara kimia, lemak

sebagian besar terdiri atas asam lemak jenuh dan minyak mengandung lebih

banyak asam tidak jenuh (Robinson, 1991). Oleh karena itu, molekul trigliserida

bila terkondensasi hasilnya adalah satu molekul gliserol dan tiga asam lemak

dengan melepaskan tiga molekul air.

H2C – OH HOOCR1 H2COOCR1

│ │ HC – OH + HOOCR2 HCOOCR2 + 3H2O │ │ H2C – OH HOOCR3 H2COOCR3

Gliserol Asam Lemak Trigliserida Air

Gambar 3. Reaksi kondensasi asam lemak

Trigliserida yang terkandung dalam minyak merupakan campuran berbagai

macam asam lemak dan kecil kemungkinan yang sejenis (Astuti, 2002). Proses

hidrolisis yang dilakukan biasanya dengan penambahan sejumlah basa yang

dikenal dengan reaksi penyabunan atau saponifikasi. Selain dalam bentuk

trigliserida asam lemak dalam ekstrak buah kuning juga terdapat dalam bentuk

asam lemak bebas.

(2). Asam lemak bebas

Asam lemak bebas adalah asam lemak yang terpisahkan dari trigliserida,

digliserida, monogliserida, dan gliserin bebas. Hal ini dapat disebabkan oleh

pemanasan dan terdapatnya air sehingga terjadi proses hidrolisis. Oksidasi juga

9


commit to user

dapat meningkatkan kadar asam lemak bebas dalam minyak nabati.

HC – (CH2)7 – COOH ║ HC – (CH2)7 – CH3

Gambar 4. Contoh struktur asam lemak bebas (asam oleat)

Tabel 2. Komposisi asam lemak dari minyak buah kuning

Jenis asam lemak Kandungan asam lemak % b/v

Asam myristat 0,055

Asam pentadekanoat 0,182

Asam palmitat 10,083

Asam stearat 3,154

Asam palmitoleat 1,377

Asam oleat 49,83

Asam linolenat 0,504

Asam linoleat 6,307

Asam eikosanoat 0,159

Asam behenat 0,852

(Budi,2004)

(3). Oksidasi asam lemak

Proses oksidasi dapat berlangsung jika terjadi kontak antara sejumlah

oksigen dengan minyak atau lemak, umumnya yang berupa asam lemak tak jenuh.

Mekanisme oksidasi lipida terjadi dari beberapa tahap. Menurut Meyes (1997) dan

Hamilton (1983), autooksidasi lipida berjalan dengan dua tahap. Selama tahap

pertama, oksidasi berjalan lambat dengan laju kecepatan seragam. Tahap pertama

ini sering disebut periode induksi. Oksidasi pada periode induksi ini berlangsung

beberapa waktu sampai pada waktu titik tertentu dimana reaksi memasuki tahap

kedua yang mempunyai laju oksidasi dipercepat. Laju pada oksidasi tahap kedua

beberapa kali lebih cepat dari laju oksidasi tahap pertama. Asam lemak yang

memiliki ikatan rangkap lebih banyak (misal asam linoleat) bereaksi lebih cepat

dibanding yang berikatan rangkap lebih sedikit (metil oleat) sehingga periode

induksinya lebih pendek.

10


commit to user

R1 C C C R2

H

H

H H H

HAsam lemak tidak jenuh

Energi

(panas + sinar)R1 C C C R2

H H H H

HRadikal bebas

+ O2

R1 C C C R2

H

O

H H H

HOPeroksida aktifR1 C C C R2

H

H

H H H

H

+

R1 C C C R2

H

O

H H H

HOH

+ R1 C C C R1

H H H H

H

Hidroperoksida

Radikal bebas

Gambar 5. Mekanisme oksidasi asam lemak pada tahap inisiasi dan propagasi

Mekanisme oksidasi lipida tidak jenuh diawali dengan tahap inisiasi,

yaitu berbentuknya radikal bebas (R*) bila lipida kontak dengan panas, cahaya,

ion metal dan oksigen. Reaksi ini terjadi pada group metilen yang berdekatan

dengan ikatan rangkap –C=C- (Buck, 1991). Ditambahkan oleh Gordon (1990),

tahap inisiasi terjadi karena bantuan sumber energi ekstenal seperti panas, cahaya

atau energi tinggi dari radiasi, inisiasi kimia dengan terlarutnya ion logam atau

metaprotein seperti haem. Tahap selanjutnya adalah tahap propagasi dimana

autooksidasi berawal ketika radikal lipida (R*) hasil tahap inisiasi bertemu

dengan oksigen membentuk radikal peroksida (ROO*). Reaksi oksigenasi ini

terjadi sangat cepat dengan energi aktivitas hampir nol sehingga konsentrasi

ROO* yang terbentuk jauh lebih besar dari konsentrasi R* dalam sistem

makanan dimana oksigen berada (Gordon, 1990). Radikal peroksida yang

terbentuk akan mengekstrak ion hidrogen dari lipida lain (R1H) membentuk

hidroperoksida (ROOH) dan molekul radikal lipida baru (R1*). Selanjutnya

reaksi autooksidasi ini akan berulang sehingga merupakan reaksi berantai. Tahap

terakhir oksidasi lipida adalah tahap terminasi, dimana hidroperoksida yang

11


commit to user

sangat tidak stabil terpecah menjadi senyawa organik berantai pendek seperti

aldehid, keton, alkohol dan asam (Rusmono, 2000). Peranan biologi yang penting

dari lipid adalah sebagai : (1) komponen struktur membran; (2) lapisan pelindung

pada beberapa jasad; (3) bentuk energi cadangan; (4) komponen permukaan sel

yang berperan dalam proses interaksi antara sel dengan senyawa kimia di luar sel,

seperti dalam proses kekebalan jaringan; dan (5) sebagai komponen dalam proses

pengangkutan melalui membran (Wirahadikusuma, 1985).

b. Komponen Non Trigliserida

(1). Karotenoid

Karotenoid adalah suatu senyawa golongan terpena yang merupakan

golongan pigmen yang larut dalam lipida dan tersebar luas, terdapat dalam semua

jenis tumbuhan. Pada tumbuhan, karotenoid mempunyai dua fungsi, yaitu suatu

pigmen pembantu dalam fotosintesis dan sebagai pewarna pada bunga dan buah.

Dalam bunga, karotenoid kebanyakan berupa zat warna kuning sedangkan di

dalam buah dapat juga berupa zat warna jingga atau merah (Harborne, J. B.,

1996). Ada banyak jenis karotenoid yang telah banyak ditemukan. Hidrokarbon

karotenoid seperti β-karoten dan lycopene, dikenal dengan karoten, sedangkan

turunan teroksigenasinya disebut xanthophyl. Di alam, karotenoid stabil terdapat

dalam bentuk all-trans (all-E), tetapi juga ada sejumlah kecil yang terdapat dalam

bentuk cis (Z). Modifikasi atas kerangka karotenoid dasar, terjadi dan

menghasilkan berbagai macam metabolit. Metabolit karotenoid yang paling

penting adalah vitamin A (Richard B. Herbert, 1995). Di antara lebih dari 400

jenis karotenoid yang layak ditentukan sifat-sifatnya dengan baik, hanya sekitar

30 jenis yang mempunyai aktivitas sebagai provitamin A. Untuk manusia dan

hewan-hewan percobaan, kelompok karotenoid yang aktif secara biologis, secara

tidak seragam mengandung paling sedikit satu cincin β-ionon yang tidak

tersubstitusi. Karotenoid yang paling aktif adalah all-trans β-karoten.

β-Karoten adalah salah satu jenis senyawa hidrokarbon karotenoid yang

merupakan senyawa golongan tetraterpenoid (Winarsi, 2007). Adanya ikatan

ganda menyebabkan β-karoten peka terhadap oksidasi. Oksidasi β-karoten akan

lebih cepat dengan adanya sinar, dan katalis logam, khususnya tembaga, besi dan

12


commit to user

mangan. Oksidasi akan terjadi secara acak pada rantai karbon yang mengandung

ikatan rangkap. β-karoten merupakan penangkap oksigen dan sebagai antioksidan

yang potensial, tetapi β-karoten efektif sebagai pengikat radikal bebas bila hanya

tersedia oksigen 2 – 20 %. Pada tekanan oksigen tinggi diatas kisaran fisiologis,

karoten dapat bersifat pro-oksidan (Burton, 1989).

β-Karoten mengandung ikatan rangkap terkonjugasi yang memberikan

karakter pro-oksidan, akibatnya akan sangat mudah diserang melalui penambahan

radikal peroksil.

β-caroten + ROO* β-car*

β-car* + O2 β-car-OO*

β-car* + ROO* produk tak aktif

Radikal β-karoten (β-car*) yang terbentuk bereaksi dengan cepat dan reversible

dengan oksigen untuk membentuk radikal peroksil yang baru (β-car-OO*).

Reaktivitas β-karoten menjadi radikal peroksil dan stabilitas pembentukan

β-car* adalah dua gambaran penting yang memberikan molekul tersebut

kemampuan antioksidan. Reaktivitas β-karoten artinya senyawa tersebut

mempunyai potensi untuk menyerang radikal peroksil yang diturunkan dari

molekul lipida yang lain, walaupun ketika berada pada konsentrasi rendah.

Stabilitas β-car* artinya adalah pada tekanan O2 yang rendah, bentuk tersebut

dapat mendominasi seluruh bentuk radikal peroksil. Radikal β-car* dapat

dilepaskan dari sistem reaksi dengan radikal peroksil yang lain (Burton, 1988).

β-Karoten memiliki 11 ikatan rangkap karbon-karbon yang terkonjugasi.

Zat ini merupakan prekursor biologis bagi vitamin A, yaitu alkohol tak jenuh

berkarbon 20, yang juga disebut retinol. Retinol ini menghasilkan 11-cis-retinal

(Gambar 5). Konversi vitamin A menjadi 11-cis-retinal tidak hanya melibatkan

oksidasi gugus alkohol menjadi aldehid, tetapi juga isomerisasi trans menjadi cis

pada ikatan rangkap C11 – C12 (Hart, 2003). Dalam tubuh, satu molekul β-karoten

akan diubah menjadi dua molekul retinil dan dipecah dalam mukosa dari usus

kecil oleh β-karoten- dioksigenase menjadi retinol, sebuah bentuk dari vitamin A.

Retinol dioksidasi menjadi retinaldehid dan sebagian kecil aldehid ini diubah

menjadi asam retinoat yang juga merupakan salah satu bentuk vitamin A.

13


commit to user

Penjelasan tersebut menunjukkan bahwa β-karoten dalam tubuh dapat diubah

menjadi vitamin A melalui reaksi oksidasi enzimatis. Namun, penelitian Lederrer

(1957) menunjukkan bahwa vitamin A dapat dioksidasi menjadi retinen (salah

satu bentuk vitamin A) menggunakan teknik kromatografi dengan penambahan

MnO2 pada fasa diamnya.

Vitamin A secara umum relatif lebih stabil dalam panas, asam dan basa

bila dibandingkan dengan β-karoten, namun vitamin A juga mudah teroksidasi

atau rusak dengan udara, pemanasan suhu tinggi, terkena sinar atau bila berada

dalam lemak yang sudah tengik. Karotenoid berperan penting dalam kesehatan

manusia yaitu bertindak sebagai antioksidan biologi, melindungi sel dan jaringan

dari pengaruh radikal bebas dan oksigen tunggal. Kegunaan karotenoid yang lain

adalah berhubungan dengan potensial oksidatif fungsi sistem imun atau ketahanan

tubuh dan penghambatan perkembangan kanker.

Beta-karoten

↓ [O]

CH2OH

Vitamin A (retinol) ↓Enzim

O H

11-cis-retinal

Gambar 6. Konversi β-karoten

14


commit to user

(b). Tokoferol

Tokoferol merupakan senyawa kimia yang mempunyai aktivitas vitamin

E. Tokoferol dalam minyak dapat berfungsi sebagai antioksidan sehingga minyak

dan karoten yang terkandung didalamnya dapat terlindungi dari oksidasi. Sebagai

antioksidan tokoferol berfungsi sebagai donor hidrogen yang mampu mengubah

radikal peroksil menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif, sehingga mampu

merusak rantai asam lemak (Winarsi, 2007). Tokoferol relatif stabil terhadap suhu

tinggi, namun sensitif terhadap oksidasi (Winarno, 1991). Ada dua mekanisme

berbeda untuk menunjukkan kerja vitamin E sebagai antioksidan yaitu (1) vitamin

E bereaksi langsung dengan oksigen dan (2) vitamin E bekerja untuk menangkap

radikal turunan asam lemak tidak jenuh dan menghentikan auto-oksidasi

(Giamalva, 1985). α-Tokoferol (Gambar 6) mempunyai kecenderungan menjadi

pro-oksidan pada dosis tinggi dan menyebabkan tekanan oksidatif yang dapat

memodulasi sinyal transduksi, mengalihkan gen dan mempengaruhi respon sel

seperti perkembangbiakan, diferensiasi dan reproduksi. Untuk itu, α-tokoferol

harus digunakan secara hati-hati (Gulcin, 2005).

O

CH3

HO

H3C

CH3

CH3

H HCH3 CH3

CH3

CH3

Gambar 7. Struktur α-Tokoferol

c. Aktivitas Antioksidan

(1). Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan sekelompok zat kimia yang sangat reaktif

karena memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Radikal

bebas adalah oksidan, tetapi tidak semua oksidan merupakan radikal bebas.

Oksidan merupakan senyawa yang dapat menerima elektron dan radikal bebas

merupakan atom atau gugus yang orbital luarnya memiliki elektron yang tidak

berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1994). Senyawa oksigen reaktif

15


commit to user

(Reactive Oxygen Species = ROS) diproduksi secara terus menerus di dalam

tubuh manusia sebagai akibat proses metabolisme normal (Langseth, 1995).

Selama makanan dioksidasi untuk menghasilkan energi, sejumlah

radikal bebas juga terbentuk. Radikal bebas berfungsi untuk memberikan

perlindungan tubuh terhadap serangan bakteri dan parasit. Namun tidak

menyerang sasaran spesifik, sehingga akan menyerang asam lemak tidak jenuh

ganda dari membran sel, struktur sel, dan DNA. Radikal bebas adalah

oksidan, tetapi tidak semua oksidan merupakan radikal bebas. Oksidan

merupakan senyawa yang dapat menerima elektron dan radikal bebas

merupakan atom atau gugus yang orbital luarnya memiliki elektron yang

tidak berpasangan. Radikal bebas dan senyawa oksigen reaktif yang diproduksi

dalam jumlah yang normal, penting untuk fungsi biologi (Haryatmi, 2004).

Beberapa hipotesis menjelaskan tentang radikal bebas pada diabetes

mellitus, seperti glikosilasi protein non enzimatik, autooksidasi glukosa gangguan

metabolisme glutation, perubahan enzim antioksidan dan pembentukan lipid

peroksidasi. Peningkatan radikal bebas secara umum menyebabkan gangguan

fungsi sel dan kerusakan oksidatif pada membran. Pada kondisi tertentu

antioksidan mempertahankan sistem perlindungan tubuh melalui efek penghambat

pembentukan radikal bebas. Efisiensi mekanisme pertahanan tersebut mengalami

perubahan pada diabetes mellitus. Penangkapan radikal bebas yang tidak efektif

dapat menyebabkan kerusakan jaringan (Rajasekaran et al., 2005 ; Kaleem et al.,

2006). Radikal bebas bereaksi dengan biomembran menyebabkan destruksi

oksidatif asam lemak tak jenuh membentuk aldehid sitotoksik melalui peroksidasi

lipid. Selanjutnya peroksidasi lipid diukur dengan thiobarbituric acid reactive

substances (TBARS) dan lipid hydroperoxides (HPX) yang merupakan

produk akhir dari peroksidasi lipid. Peningkatan peroksidasi lipid pada

membran dan lipoprotein terjadi pada diabetes. HPX yang terbentuk dari

peroksidasi lipid memiliki efek toksik langsung pada sel endothelium dan

juga terdegradasi membentuk radikal hidroksil (OH*). Hal tersebut dapat

terlihat pada sel β pankreas (Pari dan Latha , 2005).

16


commit to user

(2). Antioksidan

Suatu senyawa dikatakan memiliki sifat antioksidan bila senyawa tersebut

mampu mendonasikan satu atau lebih elektron kepada senyawa perooksidan,

kemudian mengubah senyawa oksidan menjadi senyawa yang lebih stabil.

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dapat dikelompokkan menjadi tiga

kelompok, yaitu:

(a). Antioksidan primer(antioksidan endogen atau antioksidan enzimatis),

contohnya enzim peroksidase dismutase, katalase dan glutation peroksidase.

Enzim-enzim ini mampu menekan atau menghambat pembentukan radikal

bebas dengan cara memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk

stabil. Reaksi ini disebut sebagi chain-breaking-antioxidant.

(b). Antioksidan sekunder (antioksidan eksogen atau antioksidan non

enzimatis). Contoh antioksidan sekunder ialah vitamin E, vitamin C, β-karoten,

isoflavon, asam urat, bilirubin dan albumin. Senyawa-senyawa ini dikenal

sebagai penangkap radikal bebas (scavenger free radical), kemudian mencegah

amplifikasi radikal.

(c). Antioksidan tersier, misalnya enzim DNA-repair, metionin sulfoksida

reduktase, yang berperan dalam perbaikan biomolekul yang disebabkan oleh

radikal bebas (Winarsi, 2005).

Penambahan antioksidan (AH) dengan konsentrasi rendah pada lipida

dapat menghambat atau mencegah reaksi auto-oksidasi. Penambahan tersebut

dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap insiasi dan propagasi dengan

memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) dan

mengubahnya menjadi bentuk lebih stabil.

Tahap inisiasi: R* + AH → RH + A*

Tahap propagasi: ROO* + AH → ROOH + A*

Sementara itu, turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan yang

lebih stabil dibanding radikal lipida dan tidak mempunyai cukup energi untuk

dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal baru (Schultz, 1962,

deMan, 1997).

17


commit to user

Pada penghambatan oksidasi lipida, salah satu masalah yang menarik

adalah mekanisme dimana antioksidan menstabilkan vitamin A dan karoten.

Struktur oksida terjadi melalui ikatan oksigen pada bagian tak jenuh dari cincin.

Namun hal ini tidak terjadi pada rantai. Antioksidan fenolik menghambat oksidasi

tersebut. Aktivitas vitamin A sebagai antioksidan diperkuat dengan menggunakan

antioksidan fenolik (Schultz, 1962; Paiva, 1999).

3. Kromatografi

Kromatografi mencakup berbagai proses berdasarkan perbedaan distribusi

antara dua fasa dari penyusun cuplikan. Satu fasa tetap tinggal dalam sistem dan

dinamakan fasa diam, sedangkan fasa yang lain dinamakan fasa gerak untuk

memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa gerak menyebabkan

perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. (Sudjadi, 1988). Pemisahan secara

kromatografi dilakukan dengan cara mengubah langsung beberapa sifat fisika

umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat adalah kecenderungan molekul

untuk melarut dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk melekat

pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penyerapan) dan kecenderungan molekul

untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) (Gritter, Bobbitt, 1991).

Jika fasa gerak digerakkan melalui fasa diam untuk menghasilkan

pemisahan kromatografi, proses ini dikenal sebagai pengembangan.

Pengembangan ialah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut

pengembang merambat naik dalam lapisan. Setelah senyawa-senyawa dipisahkan

dengan pengembangan, hasilnya dideteksi (divisualisasi atau ditampakkan). Jika

senyawa-senyawa yang dipisahkan benar-benar dikeluarkan dari sistem, maka

senyawa itu telah dielusi. Senyawa yang telah dipisahkan disebut solut atau

cuplikan (Gritter, 1991).

a. Kromatografi kolom

Kromatografi kolom merupakan kromatografi cair yang dilakukan dalam

kolom besar. Kromatografi kolom merupakan metode terbaik untuk pemisahan

campuran dalam jumlah besar (lebih dari satu gram). Kadang-kadang cara ini

disebut dengan kromatografi cair preparatif. Penggunaan kromatografi kolom

18


commit to user

adalah untuk mendapatkan hasil zat murni secara preparatif dari campuran dan

untuk pemisahan zat pada penentuan kuantitatif maupun kualitatif. Pada

kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada

bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau

tabung plastik. Pelarut dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang

disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Walaupun banyak jenis

penyerap telah dipakai untuk kolom, silika gel dan alumina merupakan penyerap

paling banyak digunakan. (Gritter, 1991).

Tabel 3. Urutan kepolaran eluen, elusi senyawa, dan kekuatan adsorben dalam kromatografi

Urutan Polaritas Eluen

Urutan Elusi Senyawa

Urutan Adsorben

Petroleum eter Karbon tetraklorida Benzene Kloroform Dietil eter Etil asetat Aseton Etanol Methanol Air

Hidrokarbon tak jenuh Alkena Hidrokarbon aromatik Eter Aldehida, keton, ester Alkohol Asam karboksilat

Selulosa Gula Asam silika (silika gel) Florisil (magnesium silikat) Aluminium oksida (alumina)

Beberapa kombinasi heksana atau petroleum eter (40 – 60 oC, bp) dan

dietil eter, biasanya dengan asam asetat (90:10:1) atau diisopropil eter dan asam

asetat (98,5:1,5) umumnya digunakan untuk pemisahan lipida non polar.

Mobilitas terbesar ditunjukkan oleh ester kolesterol diikuti oleh triasilgliserol,

asam lemak bebas, kolesterol, diasilgliserol, monoasilgliserol (Holme, 1993).

b. Alumina

Alumina (Al2O3) adalah salah satu adsorben yang digunakan pada

kromatografi. Penyerap ini seringkali dipakai untuk pemisahan alkaloid, zat

warna, fenol, steroid, vitamin-vitamin, karoten dan asam-asam amino.

(Sastrohamidjoyo, 2002). Alumina yang diperoleh dari perdagangan dengan

bersifat asam netral atau basa. Alumina, terutama bila bersifat alkali, sering

menyebabkan perubahan kimia dan menimbulkan reaksi-reaksi. Sebagai misal, ia

19


commit to user

dapat menyebabkan kondensasi dari aldehid-aldehid dan keton-keton, hingga bila

hal ini terjadi dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai senyawa seperti

terpen dan sterol. (Sastrohamidjoyo, 2002). Hal ini dapat dicegah dengan

mencucinya dengan larutan asam atau dengan air (terakhir diikuti dengan

metanol), kemudian direaktivasi pada suhu 200˚C. Pemanasan alumina diatas

suhu 500˚C sebaiknya dihindari; Lederer (1957) menyatakan bahwa permukaan

alumina teatap konstan hingga suhu 528˚C, kemudian menurun sampai 15% pada

suhu 734˚C dan menurun 40% setelah pemanasan pada suhu 938˚C. Satu gram

alumina untuk kromatografi mempunyai luas permukaan sebesar 90m2, darinya

hanya sebesar 6m2 per gram yang tidak berguna sebagai adsorben.

Ald+ Ald+

Od-Od-Od-Od-

OAld+

Od-

O

Od-

Gambar 8. Struktur alumina

Alumina yang digunakan untuk kromatografi berbentuk serbuk putih.

Ukuran partikel alumina berkisar 50 – 200 µm (70 – 290 mesh). Alumina dapat

dihasilkan dengan permukaan asam, basa, dan netral, berdasarkan pH dari

adsorben. Alumina asam mempunyai pH mendekati 4 dan paling berguna untuk

pemisahan senyawa asam seperti asam karboksilat. Alumina asam dapat

menyebabkan dehidrasi alkohol (terutama alkohol tersier). Alumina basa (pH

mendekati 10) berguna untuk pemisahan senyawa basa seperti alkaloid. Alumina

basa dapat menyebabkan hidrolisis ester. Alumina juga dapat menyebabkan

hidrolisis dari lipida alkalilabile (Renkonsen, 1961). Alumina netral (pH

mendekati 7) sering digunakan untuk pemisahan senyawa non polar seperti steroid

(Cannel, 1998; Gordon, 1972).

20


commit to user

O

Al3+

Al3+

Cl

Cl

O

Al3+

Al3+

O

Al3+

O

Al3+ O

O Na

Na

(a) (b) (c)

Gambar 9. Struktur Dasar Alumina (a) Asam, (b) Netral, (c) Basa

Alumina dapat bertindak sebagai katalis superbasa dan menyebabkan

isomerisasi ikatan rangkap pada olefin. Logam Na akan terionisasi dan elektron

yang terlepas akan berpindah ke atom oksigen. Atom oksigen dengan muatan

negatif yang lebih tinggi akan menghasilkan kemampuan donor elektron yang

kuat. Atom oksigen memiliki jumlah elektron yang lebih banyak akan mempunyai

kemampuan donor elektron yang lebih tinggi dan mempunyai kebasaan yang

tinggi pula (Widodo, 2002). Alumina bila digunakan dengan eluen organic akan

menyerap aromatik dan hidrokarbon tidak jenuh, karotenoid, steroid, alkaloid dan

produk alam lainnya. Alumina dapat mengkatalisis reaksi inter maupun

intramolekular, terutama senyawa yang sensitif terhadap basa seperti alkali

(Bratihwaite and Smith, 1995). Pemisahan beberapa lipida menggunakan kolom

alumina menghasilkan peningkatan kemampuan adsorbsi dimulai dari

hidrokarbon, ester kolesterol, trigliserida, kolesterol bebas, asam lemak dan

fosfatida (Holme, 1993).

c. Silika Gel

Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Penyerap ini

seringkali digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa asam-asam aminio,

alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, minyak esensial, anion dan kation

organik, sterol dan terpenoid. Silika gel yang digunakan kebanyakan kebanyakan

diberi binder (pengikat) yang dimaksudkan untuk memberikan kekuatan pada

lapisan, dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang banyak

digunakan adalah kalsium sulfat. Tetapi, dalam perdagangan biasanya silika gel

21


commit to user

telah diberi pengikat dengan kode silika gel G (Sastrohamidjoyo, 2002).

Silika merupakan adsorben yang bersifat polar. Adsorben polar ini

berinteraksi dengan molekul yang akan diadsorb melalui beberapa gaya, antara

lain dengan tarikan elektrostatik dan ikatan hidrogen. Silika merupakan asam

lemah karena adanya grup Si-OH, sedangkan alumina merupakan adsorben polar

yang bersifat basa kuat karena keberadaan O2-. Adsorben asam akan lebih

menahan komponen basa untuk menaikkan kebasaannya, demikian juga pada

pada adsorben basa akan cenderung menahan komponen asam. Penanganan silika

gel yang diperoleh secara komersial, biasanya diaktifkan dengan pemanasan pada

suhu 100˚C selama 24 jam kemudian mengerikannya dalam desikator selama 24

jam (Lederer, 1957).

Si

O

O

O

H

Si

O

O

O

H

O

Si

O

O

O

H

Gambar 10. Struktur Silika Gel

4. Mangan Dioksida (MnO2)

Oksidasi benzil dan alil alkohol menjadi aldehid dan keton dapat

dilakukan dengan menggunakan padatan mangan dioksida, MnO2. Kekuatan

oksidasi reagen ini tergantung pada ukuran partikel dan derajad hidrasinya. Reaksi

oksidasi terjadi pada permukaan oksida dan mengakibatkan pembentukan radikal

sebagai intermediet. Produk samping dari reaksi ini adalah manganese (MnO).

Solven seperti petroleum eter, aseton, dan metilen klorida, dimana oksida tidak

dapat larut, digunakan dalam oksidasi. Pentingnya menggunakan solven karena

reaksi terjadi melalui koordinasi substrat dan reagen. Solven dapat mempengaruhi

derajad adsorpsi dan desorpsi alkohol pada mangan dioksida. Jika alkohol primer

atau sekunder digunakan sebagai solven, kompetisi adsorpsi situs alkohol akan

mengurangi hasil produk oksidasi.

22


commit to user

Alkohol jenuh juga teroksidasi oleh MnO2, tetapi dengan kecepatan yang

lebih lambat dibandingkan dengan benzil atau alil alkohol. Hal ini menjadikan

reagen MnO2 kemoselektif untuk jenis alkohol ini. Benzil dan alil alkohol primer

diubah menjadi aldehid sedangkan bentuk sekundernya menjadi keton.

C C

H

H CH2OH

C C

H

H CHO

trans-cinamil alkohol trans-cinamaldehid

MnO2

petroleum eter

Gambar 11. Pengubahan vitamin A menjadi retinal oleh MnO2

Mangan dioksida dapat digunakan untuk mengubah vitamin A menjadi retinal

dengan menggunakan petroleum eter sebagai solven (Palleros, 2000; Smith,

1946).

B. Kerangka Pemikiran

Buah kuning merupakan sub spesies dari buah merah, Ekstrak buah

kuning mengandung senyawa-senyawa diantaranya adalah asam lemak yang

berada dalam bentuk trigliserida dan senyawa antioksidan seperti β-karoten dan

tokoferol. Trigliserida dalam ekstrak akan dipisahkan dengan menggunakan

teknik modifikasi fasa diam kromatografi kolom.

Berdasarkan penelitian sebelumnya kandungan asam lemak dan β-karoten

dalam buah merah dapat dipisahkan dan dioksidasi dengan menggunakan metode

kromatografi yang dimodifikasi fase diamnya dengan penambahan alumina dan

MnO2 pada silika gel. Adanya perbedaan warna yang dimiliki oleh buah kuning

dimungkinkan akan terjadi reaksi yang sama karena kandungan asam lemak dan

senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning hampir seluruhnya sama dengan

ekstrak buah merah, hanya berbeda dalam kadarnya.

Alumina dapat menyebabkan reaksi saponifikasi gliserida dan auto-

oksidasi asam lemak serta hidrolisis ester. Alumina juga dapat bertindak sebagai

katalis basa yang dapat menyebabkan isomerisasi pada ikatan rangkap. Sedangkan

MnO2 dapat mengoksidasi benzil dan alil alkohol menjadi bentuk aldehid dan

23


commit to user

keton. Alumina dan silika gel dapat memisahkan lipida menjadi kelas-kelasnya

dimulai dari trigliserida, asam lemak bebas, digliserida dan monogliserida.

Asam lemak tak jenuh dalam trigliserida dapat mengalami oksidasi yang

diawali dengan terbentuknya radikal bebas dengan oksigen sehingga

menghasilkan glikol dan hasil pemenggalan seperti aldehid dan asam karboksilat

berantai pendek. β-karoten dengan aktivitas vitamin A yang besar dapat dioksidasi

menjadi retinen dengan menggunakan teknik kromatografi yang fasa diamnya

diberi MnO2. β-karoten juga dapat bertindak sebagai antioksidan yang dapat

mencegah terjadinya oksidasi lipida.

Mekanisme yang mungkin terjadi adalah trigliserida, β-karoten dan

tokoferol terpisah bersama-sama. Selama elusi, ketiga senyawa tersebut bertemu

dengan oksidator. β-karoten dan tokoferol yang mempunyai fungsi sebagai

antioksidan akan menghalangi trigliserida yang mempunyai asam lemak dengan

ikatan rangkap untuk mengalami reaksi oksidasi. Sehingga selama pemisahan,

trigliserida akan terlindungi dari oksidator dan dapat dipisahkan dari ekstrak buah

kuning tanpa merusak trigliserida tersebut.

C. Hipotesis

Berdasarkan uraian diatas dapat diambil hipotesis yaitu trigliserida dapat

dipisahkan dari ekstrak buah kuning menggunakan teknik kromatografi yang

dimodifikasi fasa diamnya (penambahan alumina basa dan oksidator kedalam

silika gel). Namun dengan adanya pengaruh fasa diam modifikasi dan antioksidan

dalam ekstrak, mengakibatkan terjadi suatu reaksi yang dapat menghambat

oksidasi asam lemaknya.

Dengan adanya perbedaan daya tahan terhadap oksidasi karena perbedaan

kadar antara asam lemak dan senyawa antioksidan dalam ekstrak buah merah dan

ekstrak buah kuning dimungkinkan akan dihasilkan senyawa dioktil ptalat sebagai

turunan asam lemak yang sama dengan ekstrak buah merah.

24


commit to user

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen di

laboratorium kimia. Penelitian pendahuluan adalah penentuan perbandingan fasa

gerak dan fasa diam untuk kromatografi kolom dengan metode KLT

menggunakan plat modifikasi. Fasa diam berupa campuran silika-alumina(2:3)

dengan penambahan MnO2 3% dan 5%. Setelah diperoleh data KLT dilakukan

pemisahan ekstrak buah kuning dengan kromatografi kolom menggunakan fasa

diam campuran silika-alumina(2:3) dengan penambahan MnO2 3%. Ekstrak buah

kuning dielusikan pada kolom kromatografi menggunakan eluen campuran PE-

dietil eter(1:1). Hasil pemisahan diidentifikasi dengan spektroskopi infra

merah(IR), dan Gas Chromatography – Mass Spectroscopy (GC-MS).

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Sublab Kimia Laboratorium Pusat Universitas

Sebelas Maret Surakarta. Sedangkan identifikasi dilakukan di Laboratorium

Kimia Organik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Gadjah Mada Yogyakarta.Waktu kegiatan penelitian berlangsung pada bulan Juli

2009 – April 2010.

C. Alat dan Bahan yang Digunakan

1. Alat-alat yang digunakan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1. Kolom kromatografi tekan

2. Alat-alat gelas buatan pyrex

3. GC-MS QP2010S Shimadzu

4. IR Shimadzu FTIR Prestige 21

5. TLC Plate Coater

25


commit to user

6. TLC Chamber

7. Oven

8. Syringe whatman 0,2 µm TF

9. Lampu UV

2. Bahan-bahan yang digunakan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1. Ekstrak buah kuning dari Papua Irian Jaya produksi I Made Budi

2. Silika Gel 60 GF254 for TLC (Merck)

3. Aluminiumoxid 150 aktiv basisch (Merck)

4. Silica gel 60, 70-230 Mesh ASTM(Merck)

5. Aluminiumoxid 60 aktiv basisch 70-230 Mesh ASTM (Merck)

6. PE teknis (Merck)

7. dietil eter p.a (Merck)

8. metanol p.a (Merck)

9. rodamin B(Merck)

10. MnO2(Merck)

D. Prosedur Penelitian

1. Clean up sampel

Sebanyak 1 g ekstrak buah kuning dilarutkan dalan 10ml dietil

eter. Kemudian ekstrak diinjeksikan pada syring whatman dengan ukuran

pori 0,2 µm. Ekstrak diuapkan untuk mendapatkan ekstrak pekat kembali.

2. pembuatan 0,5 % Rhodamin B dalam etanol

Sebanyak 0,4 g rhodamin B dilarutkan dalam 100ml etanol.

3. Kromatografi Lapis Tipis

KLT awal adalah KLT silika pabrik untuk identifikasi awal dari

ekstrak buah kuning dan untuk penentuan eluen. Ekstrak buah kuning

dielusikan pada plat KLT dengan cara ditotolkan dengan mikropipet. Dan

dimasukkan dalam gelas piala yang berisi eluen campuran PE dan dietil

eter dengan perbandingan (19:1; 9:1; 7:3; 5:5) sebagai larutan pengembang

kemudian dibiarkan terelusi/mengembang. Plat kemudian disemprot

26


commit to user

dengan larutan rhodamin B yang akan memberikan bercak merah muda

pada plat di bawah sinar UV.

KLT selanjutnya menggunakan plat yang telah dimodifikasi. Silika

gel dipanaskan pada 120oC dan alumina dipanaskan pada 150oC selama

satu jam. Untuk plat dibuat bubur silika gel-alumina ditambahkan MnO2

3% dan 5%. Masing-masing bubur adsorben kemudian diratakan pada plat

KLT dan dikeringkan diudara. KLT dilakukan untuk penentuan banyaknya

fraksi buah kuning pada kromatografi kolom. Ekstrak buah kuning

ditotolkan pada plat KLT. Kemudian plat dielusikan dengan eluen

campuran PE:dietil eter(1:1).

4. kromatografi kolom flash

1 g Ekstrak buah kuning dielusi dalam kolom kromatografi dengan

fasa diam silika-alumina(3:2) dengan penambahan MnO2 3%. Eluen yang

digunakan PE-dietil eter dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3. Eluat yang

dihasilkan kemudian ditampung dalam vial-vial tiap 3 mL dan dikeringkan

dari pelarutnya.

Eluat yang telah kering dari pelarut atau eluen kemudian ditimbang

dan diuji dengan KLT. Nilai Rf yang dihasilkan dibandingkan dengan nilai

Rf dari plat KLT silika gel awal. Nilai Rf yang sama dikumpulkan

kemudian fraksi yang dihasilkan diidentifikasi dengan menggunakan IR

dan GC-MS.

E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data

a. Pengumpulan Data

Penentuan fasa diam dan eluen dengan menggunakan KLT akan diperoleh

data berupa spot-spot hasil pemisahan untuk tiap perbandingan eluen petroleum

eter dan dietil eter dan penambahan MnO2 dalam fasa diam, yang selanjutnya

hasil pemisahan yang baik akan digunakan dalam pemisahan kromatografi kolom.

Pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi akan dihasilkan

eluat. Tiap eluat diuji dengan KLT dan menghasilkan nilai Rf yang kemudian

27


commit to user

dibandingkan dengan nilai Rf awal. Fraksi yang sama dikumpulkan dan kemudian

dilakukan identifikasi.

b. Analisis Data

a. Infrared Spectroscopy (IR)

Identifikasi dengan IR dilakukan untuk menentukan gugus fungsi dari

senyawa-senyawa yang ada dalam fraksi.

b. Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS)

Identifikasi dengan GC-MS digunakan untuk memperkirakan senyawa-

senyawa yang dihasilkan.

28


commit to user

BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Persiapan Sampel

Ekstrak buah kuning yang digunakan dalam penelitian ini berupa cairan

minyak berwarna cokelat kekuningan. Preparasi awal sampel adalah clean up

ekstrak buah kuning menggunakan whatman TF dengan ukuran pori 0,2 µm.

Filter ini dibuat dengan menggunakan membran PTFE (Politetrafluoroethylene)

yang spesifik untuk pemisahan senyawa organik, filtrasi pelarut non air dan ideal

digunakan pada analisis HPLC, TLC, dan GC. Metode yang digunakan untuk

clean up adalah metode injeksi. Sebanyak 1 gram ekstrak buah dilarutkan dalam

10 ml dietil eter, ekstrak kemudian diinjeksikan pada syring hingga diperoleh

ekstrak encer. Ekstrak dibiarkan agar pelarut menguap hingga diperoleh ekstrak

pekat kembali.

Tujuan utama clean up adalah membersihkan pengotor dan matriks-

matriks lain dalam ekstrak buah kuning yang dapat mengganggu pemisahan.

Ekstrak awal berwarna cokelat kekuningan dan setelah dilakukan clen up

diperoleh ekstrak berwarna kuning pekat. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak

telah bersih dari pengotor dan matriks-matriks lain yang dapat menggangu

pemisahan seperti senyawa tanin dan selulosa.

B. Penentuan Fasa Gerak dan Fasa Diam

Pemisahan trigliserida dalam ekstrak buah kuning diawali dengan

penentuan komposisi fasa diam dan fasa gerak yang akan digunakan. Penentuan

ini dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fasa gerak

yang akan digunakan dalam kromatografi kolom ditentukan dengan menggunakan

plat TLC silica gel 60 F254. Trigliserida dan β-karoten merupakan senyawa non-

polar yang saling bercampur satu sama lain. Kedua senyawa tersebut dapat larut

dalam eluen petroleum eter dan dietil eter sehingga digunakan larutan

pengembang PE dan dietil eter. Perbandingan larutan pengembang yang

digunakan adalah 19:1, 9:1, 7:3, 1:1. Harga rf dari spot yang dihasilkan terlihat

29


commit to user

pada tabel 4. Perbandingan yang digunakan adalah perbandingan fasa gerak yang

memberikan spot terbanyak dengan harga rf yang tinggi.

Tabel 4. Harga Rf dari spot hasil pemisahan ekstrak buah kuning (gambar

plat terlampir pada lampiran 2)

Fasa diam Silika Gel Silika gel :

Alumina (2:3) 19:1* Warna 9:1* warna 7:3* warna 1:1* warna 1:1* Warna 0,53 kuning

** 0,58 kuning

** 0,68 kuning

** 0,8 kuning

** 0,8 kuning

** - - - - - - - - 0,2 Tak

berwarna

* Perbandingan eluen PE:Dietil eter

** lama-kelamaan menjadi pudar kemungkinan karena β-karoten

teroksidasi

Hasil terbaik diperoleh pada perbandingan 1:1 dimana dihasilkan satu spot

berwarna kuning dengan harga rf sebesar 0,8. Untuk perbandingan fasa gerak

yang lebih non polar yaitu pada perbandingan 19:1 dan 9:1 dihasilkan spot yang

tailing dan harga rf rendah, ketika kepolaran dinaikkan dihasilkan satu spot

tunggal dengan harga rf yang relatif rendah sehingga perlu dinaikkan lagi

kepolarannya hingga dihasilkan spot yang tidak tailing dan nilai rf tinggi. Adanya

satu spot mengindikasikan bahwa ekstrak kurang dapat terpisah dengan fasa diam

silika gel saja. Untuk hasil pemisahan yang lebih baik adalah dengan

pencampuran fasa diam antara silika gel dengan alumina. Alumina merupakan

adsorben kuat sehingga interaksinya mengikat solut juga lebih kuat dibanding

silika. Hal ini mengakibatkan senyawa-senyawa dalam ekstrak buah kuning yang

bersifat polar akan semakin tertahan didalam fasa diam sedangkan senyawa non

polar akan terelusi lebih cepat. Alumina yang digunakan adalah alumina yang

teraktifasi basa. Sifat basa pada alumina dapat menyebabkan reaksi saponifikasi

pada trigliserida yang akan berpengaruh pada hasil pemisahan.

Penentuan perbandingan yang digunakan antara silika gel dengan alumina

berdasarkan pada acuan penelitian sebelumnya bahwa asam lemak dan β-karoten

dalam ekstrak buah merah terpisah terpisah baik pada perbandingan 2:3

30


commit to user

(Handayani; Rumanthi, 2008). Diduga terjadi hal yang sama untuk pemisahan

ekstrak buah kuning. Pada perbandingan ini dihasilkan 2 spot dengan harga rf

pada tabel 4. Spot pertama berwarna kuning, namun agak memudar jika dibiarkan

terlalu lama. Spot kedua tidak berwarna dan akan tampak apabila disemprot

dengan rhodamin B dan dilihat menggunakan lampu UV. Rhodamin B adalah

reagen yang digunakan untuk untuk menguji adanya trigliserida dan asam lemak

(Jork,1990). Adanya spot kedua mengindikasikan bahwa asam lemak bebas pada

ekstrak buah kuning telah terpisah dari trigliseridanya.

Kombinasi fasa diam antara silika dengan alumina untuk mendapatkan

hasil pemisahan yang paling baik sedangkan untuk pengubahan senyawanya

dilakukan dengan penambahan MnO2. MnO2 berfungsi sebagai oksidator yang

dapat mengoksidasi trigliserida. Komposisi MnO2 yang ditambahkan adalah 3%

dan 5%. Asam lemak dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO2 dan

terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO2 1,5% (Handayani, 2008),

sedangkan β-karoten dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO2 dan

terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO2 5% (Rumanthi,2008). Hasil ini

dapat dijadikan pertimbangan bahwa asam lemak yang belum terpisah dari β-

karoten dalam ekstrak buah kuning akan bereaksi dengan MnO2 pada kisaran

konsentrasi >1,5 % dan <5%, sehingga konsentrasi MnO2 yang digunakan adalah

3% dan 5%.

a b

Gambar 12. Plat KLT ekstrak buah kuning dengan modifikasi Si-Al (2:3)+MnO2 (a). 3% dan (b). 5%

Pemisahan dengan komposisi MnO2 5% menghasilkan 4 spot dengan jarak

31


commit to user

rf sebesar 0,8; 0,6; 0,3 dan 0,25. Pada pemisahan dengan komposisi MnO2 3%

menghasilkan 4 spot dengan jarak rf sebesar 0,78; 0,67; 0,33; dan 0,11 seperti

terlihat pada gambar 11. Warna sampel sebelum proses penotolan adalah kuning,

dan pada saat ditotolkan pada plat modifikasi warna ini menjadi pudar.

Kemungkinan yang terjadi adalah warna sampel tertutup oleh warna plat yang

gelap (abu-abu kehitaman), atau dapat dikarenakan langsung terjadi reaksi antara

sampel dengan fase diam saat ditotolkan. Pada saat sampel dielusi tidak

diindikasikan adanya perubahan warna, namun setelah sampel selesai dielusi dan

dikeringkan terlihat adanya dua spot yang tidak berwarna. Plat kemudian

disemprot dengan Rhodamin B dan diamati menggunakan sinar UV. Hasil yang

diperoleh adalah 4 spot dengan karakteristik warna yang hampir sama kecuali spot

pertama yang terlihat lebih jelas sedangkan spot yang lain terlihat agak pudar.

Spot pertama diindikasikan sebagai campuran asam lemak dalam bentuk

trigliserida dan β-karoten yang telah bereaksi dengan MnO2. Spot ketiga dan

keempat merupakan asam lemak bebasnya. Spot kedua dengan jumlah yang

paling sedikit merupakan sisa karoten yang tidak bereaksi dengan asam lemak dan

MnO2.

Pemisahan menggunakan konsentrasi MnO2 5% menunjukkan

karakteristik warna yang sama dengan pemisahan menggunakan konsentrasi

MnO2 3%, perbedaan terdapat pada harga Rf-nya. Pada konsentrasi MnO2 3%

jarak antar spotnya relatif lebih jauh yang menunjukkan bahwa resolusinya lebih

baik. Pada komposisi MnO2 5% spot ketiga tidak terpisah dengan spot keempat.

Komposisi pada perbandingan silika dan alumina 2:3 dan penambahan MnO2 3%

mampu menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang baik dan harga Rf yang

lebih tinggi serta tidak mengurangi jumlah spot yang dihasilkan dan karakter

warna masing-masing spot, sehingga campuran fase diam inilah yang digunakan

untuk pemisahan dengan kromatografi kolom.

Berdasarkan penentuan fasa gerak dan fasa diam dilakukan pemisahan

dengan kromatografi kolom untuk hasil pemisahan yang lebih baik. Fasa diam

yang digunakan adalah campuran silika dan alumina dengan perbandingan 2:3 dan

penambahan MnO2 3%. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah petroleun

32


commit to user

eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1.

C. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Flash

Pemisahan dengan kromatografi kolom menggunakan kolom berdiameter

2 cm dan panjang 25cm. Total fasa diam yang digunakan adalah 50 g, dengan

perincian MnO2 1,5 g, Silika 19,4 g, dan alumina 29,1 g. Alumina mempunyai

berat molekul yang lebih besar daripada silika gel, sedangka MnO2 mempunyai

berat yang paling ringan sehingga MnO2 akan selalu berada paling atas pada

permukaan kolom. Agar reaksi dapat berjalan sempurna maka MnO2 harus dibuat

sehomogen mungkin dengan yang lain. Salah satu cara adalah dengan metode

kering yaitu dengan memasukkan campuran fasa diam ke dalam kolom yang

berisi pelarut yang paling non polar yaitu PE. Campuran dimasukkan sedikit demi

sedikit dengan komposisi yang sama sehingga akan terbentuk lapisan-lapisan

yang teratur dalam kolom seperti pada gambar 12.

Gambar 13. Kromatografi kolom flash

Fasa gerak yang digunakan adalah petroleum eter dan dietil eter dengan

perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi

gradien yang dimulai dari perbandingan fasa gerak yang paling non polar. Asam

lemak merupakam senyawa non polar sehingga digunakan campuran fasa gerak

yang lebih non polar terlebih dahulu agar asam lemak lebih cepat terpisah. Kolom

yang digunakan adalah kolom tekan, sehingga kecepatan alir dari fasa gerak dapat

diatur. Semakin cepat kecepatan alir fasa gerak, semakin kecil tekanan dalam

33


commit to user

kolom kromatografi sehingga reaksi semakin cepat tetapi reaksi tidak maksimal

sehingga hasil pemisahan kurang sempurna. Sebaliknya, semakin lambat

kecepatan alir fasa gerak, semakin besar tekanan dalam kolom dan semakin

maksimal reaksi yang terjadi sehingga akan diperoleh hasil pemisahan yang lebih

sempurna. Kecepatan alir yang digunakan dalam penelitian ini adalah 26 tetes per

menit dan hasil pemisahan ditampung pada tabung reksi kecil setiap 3 ml.

Fraksi yang pertama tertampung berwarna kuning yang merupakan

campuran asam lemak dalam bentuk trigliserida dan β-karoten yang telah bereaksi

dengan MnO2. Kemudian warna kuning tersebut semakin lama semakin hilang

secara keseluruhan.

Hasil elusi yang telah ditampung dalam tabung masing-masing diuapkan

dari pelarutnya dan ditimbang serta diuji dengan plat silika gel menggunakan

larutan pengembang petroleun eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1. Berat

yang diperoleh dapat dilihat pada gambar 14.

Gambar 14. Grafik perubahan massa tabung hasil pemisahan dengan kromatografi kolom flash. Diagram berat eluat dari pemisahan kolom modifikasi menghasilkan dua

puncak yang kemudian eluat yang membentuk kedua puncak tersebut

dikumpulkan menjadi satu sehingga didapat dua fraksi. Masing-masing tabung

dianalisis dengan KLT menggunakan plat silika gel murni untuk

mengelompokkan ke dalam fraksi yang sama. Harga Rf dari masing-masing fraksi

dapat dilihat pada tabel 5.

Asam lemak dalam ekstrak buah kuning terdapat dalam bentuk trigliserida

dan pada pemisahan asam lemak dengan kromatografi kolom yang terpisah

34


commit to user

pertama kali adalah trigliserida dan diikuti dengan asam lemak bebasnya,

digliserida dan monogliserida (Holme,2005). Asam lemak bebas merupakan asam

lemak yang telah terpisah dari trigliserida, digliserida dan monogliseridanya.

Tabel 5. Harga Rf, warna dan berat total tiap fraksi

Fraksi

ke-

Tabung

ke-

rf warna Berat total Identifika

si dengan

rodamin

Identifi

kasi

dengan

SbCl3

1 9-19 0,74 Kuning ± 681 mg Merah

keunguan

merah

2 20-29 0,40 Tak

berwarna

± 23 mg Merah

keunguan

merah

3 30-40 0,15 Tak

berwarna

± 221 mg Merah

keunguan

jingga

· Bentuk spot tidak sama dengan hasil sebenarnya

Gambar 15. Perbandingan Rf plat silika gel awal dengan Rf dari eluat

Masing-masing fraksi dianalisis KLT menggunakan plat silika gel dan

masing-masing fraksi dihasilkan satu spot. Perbandingan mengunakan plat silika

gel awal dengan plat silika gel dari fraksi yang telah melalui modifikasi diperoleh

bahwa asam lemak dalam ekstrak buah kuning dapat mengalami perubahan yaitu

adanya asam lemak bebas yang diturunkan dari hasil modifikasi. Spot ketiga

merupakan asam lemak bebas karena oksidasi dari asam lemak dapat

meningkatkan kadar asam lemak bebasnya. Uji skrining fitokimia terhadap fraksi

35


commit to user

kedua dihasilkan bahwa komponen senyawa dari fraksi kedua mengandung asam

lemak dan karotenoid. Asam lemak yamg dihasilkan pada fraksi kedua

dimungkinkan adalah sisa trigliserida yang tidak bereaksi dengan MnO2 dan

senyawa antioksidan, sedangkan karotenoid pada fraksi kedua adalah sisa karoten

yang tidak bereaksi dengan MnO2.

Ekstrak buah kuning yang dipisahkan dengan plat silika gel menggunakan

eluen PE:dietil eter (1:1) diperoleh satu spot dengan rf 0,8. Setelah dilakukan

modifikasi dengan kolom kromatografi masing-masing tabung dianalisis KLT

dengan plat silika dan diperoleh spot tambahan untuk fraksi yang mengandung

asam lemak yang mengindikasikan asam lemak yang semula tidak terpisah

menjadi terpisah. Fraksi yang dianalisis adalah fraksi pertama dengan harga rf

0,74. menurut Holme (2005) dinyatakan bahwa jika asam lemak dipisahkan

dengan silika yang terpisah pertama kali adalah fraksi trigliserida diikuti oleh

asam lemak bebas kemudian digliserida/monogliseridanya. Dengan kondisi yang

sama pada Holme dapat diperoleh hasil yang sama yaitu fraksi pertama adalah

fraksi trigliserida. Pada penelitian ini diambil hanya fraksi pertama saja yaitu

dengan berat terbanyak karena penelitian hanya ditekankan pada fraksi yang

semula tidak terpisah dengan plat silika saja menjadi terpisah dengan modifikasi,

selain itu dengan modifikasi yang sama yang dilakukan pada ekstrak buah merah

ada senyawa turunan yang masuk pada fraksi trigliserida.

Identifikasi Senyawa

Fraksi pertama diencerkan dengan PE dan dianalisis dengan IR untuk

mengetahui gugus fungsi apa saja yang terdapat pada fraksi pertama. Analisis

spektrofotometer FT-IR terhadap fraksi pertama dari ekstrak buah kuning

memberikan puncak-puncak serapan pada daerah bilangan gelombang seperti

yang ditunjukkan pada gambar 16.

36


commit to user

Gambar 16. Puncak-puncak serapan analisis FT-IR terhadap fraksi pertama.

Dari hasil analisis spektroskopi FT-IR memberikan puncak spektrum

dengan puncak-puncak pada daerah bilangan gelombang 2924,09 cm-1 dan

2854,65 cm-1 menunjukkan vibrasi stretching dari C-H sp3 serta didukung pada

daerah bilangan gelombang 1458,18 cm-1 yang menunjukkan vibrasi bending dari

C-H sp3, munculnya puncak serapan pada daerah bilangan gelombang 1743,65

cm-1 menunjukkan adanya vibrasi gugus karbonil C=O dan pada daerah bilangan

gelombang 1165,00 cm-1 menunjukkan vibrasi C-O-C dari ester yang merupakan

serapan ester dari trigliserida serta didukung vibrasi dari alkil rantai panjang ((-

CH2)n) pada daerah bilangan gelombang 725,23 cm-1.

Setelah diketahui gugus fungsi dari fraksi pertama dilakukan analisis lebih

lanjut untuk mengetahui golongan senyawa dengan GC-MS. GC-MS digunakan

untuk mengidentifikasi senyawa yang dihasilkan pada fraksi pertama. Identifikasi

ini digunakan untuk mengetahui jenis asam lemak apa saja yang terdapat pada

fraksi pertama dan kemungkinan senyawa turunan yang dihasilkan. Sebagai dasar

dilakukan analisis yang sama untuk ekstrak awal yaitu ekstrak buah kuning yang

belum dilakukan pemisahan dengan kolom. Ekstrak awal dan fraksi pertama

dianalisis dengan GC-MS model Shimadzu QP2010S dengan kondisi operasi

tertera pada lampiran 2. Hasil kromatogram GC-MS disajikan dalam gambar 17.

C-H sp3

C=O O-C-O

(-CH2)n

C-H sp3

37


commit to user

Fraksi yang dianalisis ditransesterifikasi terlebih dahulu untuk menurunkan titik

didihnya sehingga senyawa yang akan teridentifikasi adalah bentuk metil ester

dari asam lemaknya.

a

b

Gambar 17. (a). Kromatogram GC ekstrak buah kuning murni (b). kromatogram GC fraksi trigliserida

Dari hasil analisis GC pada ekstrak dan ekstrak trigliserida diperoleh dua

puncak utama yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa hampir tidak ada

perbedaan antara ekstrak awal dengan fraksi trigliserida setelah dipisahkan dengan

kromatografi kolom. Sehingga dimungkinkan reaksi oksidasi yang dimungkinkan

terjadi pada ekstrak selama dikolom terhalang oleh keberadaan senyawa

antioksidan dalam ekstrak buah kuning.

Identifikasi lebih lanjut dilakukan dengan spektroskopi massa, dari hasil

spektroskopi massa akan diperoleh spektra massa dari masing-masing puncak

yang terdeteksi pada kromatogram GC. Analisis spektra massa didasarkan pada

nilai Similiarity Indeks (SI) yang dibandingkan dengan spektra dari library yaitu

Wiley 229.LIB. spektra massa yang teridentifikasi dan spektra massa senyawa

standar dari Wiley 229.LIB ditunjukkan pada lampiran 3 dan 4.

Berikut analisis spectra massa senyawa yang terdeteksi dengan GC-MS

38


commit to user

yang terkandung dalam ekstrak buah kuning awal dan dalam fraksi trigliserida dan

dibandingkan dengan spectra massa senyawa standar dari Wiley 229 L.IB.

a. Analisis terhadap ekstrak awal

1. Senyawa puncak 1

Senyawa puncak 1 dengan waktu retensi 25,627 menit dan kelimpahan 20,31 %

dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitat dengan Similiarity

Indeks sebesar 96%. Metal palmitat mempunyai rumus molekul C17H34O2 dengan

m/z 270.

2. Senyawa puncak 2


dibandingkan dengan library adalah senyawa metil oleat dengan Similiarity Indeks

sebesar 96%. Metil oleat mempunyai rumus molekul C19H36O2 dengan m/z 296.

39


commit to user

b. Analisis terhadap fraksi trigliserida

1. Senyawa puncak 1


dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitoleat dengan Similiarity

Indeks sebesar 95 %. Metal palmitoleat mempunyai rumus molekul C17H32O2

dengan m/z 236.

2. Senyawa puncak 2


dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitat dengan Similiarity

Indeks sebesar 96 %. Metil palmitat mempunyai rumus molekul C17H34O2 dengan

m/z 270.

40


commit to user

3. Senyawa puncak 3


dibandingkan dengan library adalah senyawa glikol-1-palmitat dengan Similiarity

Indeks sebesar 74 %. Glikol-1-palmitat mempunyai rumus molekul C21H44O3

dengan m/z 272.

4. Senyawa puncak 4


dibandingkan dengan library adalah metil oleat dengan Similiarity Indeks sebesar

96 %. Metil oleat mempunyai rumus molekul C19H36O2 dengan m/z 296.

41


commit to user

5. Senyawa puncak 5


dibandingkan dengan library adalah metil stearat dengan Similiarity Indeks

sebesar 95%. Metil stearat mempunyai rumus molekul C19H38O2 dengan m/z 298.

6. Senyawa puncak 6


dibandingkan dengan library adalah 1-0-oktadekanoil-1,2-etanediol(bentuk

senyawa diol) dengan Similiarity Indeks sebesar 72%. 1-0-oktadekanoil-1,2-

etanediol mempunyai rumus molekul C20H40O3 dengan m/z 292.

42


commit to user

7. Senyawa puncak 7


dibandingkan dengan library adalah metil heptakosanoat dengan Similiarity

Indeks sebesar 80%. Metil heptakosanoat mempunyai rumus molekul C28H56O2

dengan m/z 283.

Berdasarkan hasil analisis dapat diketahui bahwa tidak ada perbedaan

signifikan antara ekstrak murni sebelum dikolom dengan fraksi pertama setelah

dikolom. Terdapat persamaan pada dua puncak utama yaitu metil palmitat dan

metil oleat dengan % area berbeda. Pada ekstrak murni % area untuk metil

palmitat sebesar 20,31% sedangkan untuk metil oleat sebesar 79,69%. Pada fraksi

pertama dari hasil pemisahan terdapat penurunan dari keduanya yaitu metil

palmitat sebesar 15,95% dan metil oleat sebesar 77,48%. Hal ini mengindikasikan

bahwa keberadaan senyawa lain dalam suatu komponen mempengaruhi hasil

analisisnya. Esterifikasi tidak dapat mengubah seluruh trigliserida yang terdapat

pada ekstrak murni menjadi metil ester karena adanya pengaruh senyawa lain

yang dapat mengganggu proses esterifikasi dan memperbesar luas puncaknya.

Kromatografi kolom mampu memisahkan senyawa dari komponen yang lain.

Hasil analisis pada fraksi pertama yang sudah dipisahkan dengan kromatografi

kolom menunjukkan luas area yang lebih sempit dengan puncak yang lebih tajam

dan memaksimalkan proses esterifikasi sehingga puncak-puncak yang tidak

terdeteksi pada ekstrak murni dapat muncul pada fraksi yang telah dipisahkan

dengan kromatografi kolom.

43


commit to user

Tabel 6. Perbandingan data GC-MS dengan kandungan dalam ekstrak

buah kuning Data GC-MS Asam Lemak dalam

Ekstrak Buah kuning (Budi,2004)

Ekstrak murni Fraksi pertama %

Area senyawa %

area senyawa Asam

Lemak %

Kandungan - - - - Asam

myristat

0,055

- - - - Asam

pentadekanoat

0,182

20,31 metil palmitat

15,95 metil palmitat Asam

palmitat

10,083

- - 1,51 metil stearat Asam stearat 3,154

- - 0,88 metil palmitoleat

Asam

palmitoleat

1,377

79,69 Metil oleat

77,48 metil oleat Asam oleat 49,83

- - - - Asam

linolenat

0,504

- - - - Asam linoleat 6,307

- - - - Asam

eikosanoat

0,159

- - - - Asam behenat 0,852

- - 1,16 Metil heptakosanoat

- -

- - 1,38 1-0-oktadekanoil-1,2-ethanadiol

- -

- - 1,62 glikol-1-palmitat

- -

Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan senyawa dari ekstrak murni.

Pada saat pemisahan akan terjadi degradasi warna dari senyawa murni yang

berwarna kuning pekat hingga diperoleh fraksi-fraksi yang berwarna kuning

sampai warna kuning hilang secara permanen. Adanya degradasi ini

44


commit to user

mengindikasikan adanya pemisahan senyawa sehingga pada saat dianalisis,

kromatogram menunjukkan waktu retensi yang berbeda untuk senyawa yang

dideteksi sama, yaitu metil palmitat dan metil oleat pada ekstrak murni dan fraksi

trigliseridanya. Berdasarkan literatur disebutkan bahwa selain asam oleat dan

asam palmitat, ekstrak buah kuning juga mengandung asam pentadekanoat, asam

myristat, asam stearat, asam palmitoleat, asam linoleat, asam linolenat, dan asam

eikosanoat. Pada hasil GC-MS senyawa murni asam lemak ini tidak muncul,

tetapi pada hasil GC-MS fraksi pertama muncul asam palmitoleat sebagai asam

palmitoleat, asam stearat sebagai metil stearat.

Berdasarkan hasil analisis teridentifikasi tiga senyawa baru yang tidak

terindetifikasi pada ekstrak murni maupun penelitian yang dilakukuan sebelumnya

oleh Budi (2004). Senyawa tersebut adalah 1-0-oktadekanoil-1,2-ethanadiol

dengan rumus formula C20H40O3 dan glikol-1-palmitat dengan rumus formula

C21H44O3. Munculnya senyawa glikol dan diol terbentuk karena dua atom H pada

trigliserida tersubsitusi oleh atom OH. Asam lemak tak jenuh dalam trigliserida

dapat mengalami oksidasi yang diawali dengan terbentuknya radikal bebas dengan

oksigen membentuk glikol. Adanya senyawa glikol dan diol dihasilkan dari

oksidasi tidak sempurna pada trigliseridanya. Senyawa yang lain adalah metil

heptakosanoat yang mengindikasikan bahwa dalam ekstrak buah kuning

mengandung asam heptakosanoat. Apabila di bandingkan hasil identifikasi fraksi

pertama dengan ekstrak buah kuning murni selisih % kandungan terbanyak adalah

pada metil palmitat sehingga terbentuknya senyawa baru tersebut berasal dari

asam palmitat yang terdapat pada fraksi trigliserida. Sememtara pada fraksi

trigliserida dari ekstrak buah merah selisih % kandungan terbanyak dengan

ekstrak murninya terdapat pada metil oleatnya. Hal ini mengindikasikan

terbentuknya senyawa dioktil pthalat berasal dari asam oleatnya.

D. Pengaruh Penambahan Alumina dan MnO2

Alumina yang digunakan dalam penelitian ini adalah alumina basa, sifat

kebasaan dalam alumina sering menyebabkan reaksi sekunder. Sebagai misal, ia

dapat menyebabkan kondensasi dari aldehid-aldehid dan keton-keton, hingga bila

45


commit to user

hal ini terjadi dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai senyawa seperti

terpen dan sterol (Sastrohamidjoyo, 2002). Alumina merupakan katalis basa yang

mempunyai atom oksigen dengan muatan yang tinggi serta pH mendekati 10.

Adanya alumina dapat meningkatkan aktivitas dari MnO2 sebagai oksidator yaitu

dengan memberikan elektronnya pada MnO2 sehingga MnO2 dapat dengan mudah

melepaskan oksigennya.

Pada konsentrasi MnO2 3%, kemungkinan yang terjadi adalah asam lemak

yang berada dalam bentuk trigliserida bereaksi terlebih dahulu dengan

oksidatornya meskipun reaksi akan terhalang oleh keberadaan senyawa

antioksidan yang berupa β-karoten dan tokoferol mengingat kedua senyawa ini

adalah senyawa yang mudah teroksidasi. Kemungkinan yang terjadi β-karoten

akan teroksidasi terlebih dahulu untuk melindungi oksidasi asam lemaknya.

Setelah β-karoten habis oksidasi asam lemak terjadi tetapi terhalang oleh senyawa

antioksidan yang lain. Kemungkinan yang lain asam lemak teroksidasi terlebih

dahulu tetapi dihalangi oleh keberadaan senyawa antioksidan mengingat

kandungan terbesar dalam ekstrak adalah asam lemak.

E. Pengaruh keberadaan antioksidan dalam ekstrak buah kuning

Antioksidan yang terdapat pada ekstrak buah kuning adalah β-karoten dan

tokoferol. Kedua senyawa ini merupakan senyawa aktif dalam ekstrak buah yang

mampu menangkal adanya radikal bebas dalam tubuh. Keduanya juga merupakan

senyawa yang mudah teroksidasi. Pada saat ketiganya berada bersamaan dengan

konsentrasi oksidator tertentu, maka akan terjadi reaksi yang dapat menyebabkan

perubahan dan dimungkinkan bersifat toksik.

Dari hasil kromatogram GC-MS pada fraksi asam lemak tidak dideteksi

adanya senyawa turunan dari asam lemak. Hal ini mengindikasikan bahwa ada

pengaruh dari senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak buah kuning yaitu β-

karoten dan tokoferol. Penambahan antioksidan dalam konsentrasi rendah dapat

menghambat dan atau mencegah reaksi autooksidasi pada lipida. Penambahan ini

menghalangi reaksi oksidasi lipida pada tahap terminasi maupun propagasi.

Mekanisme ini sering digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan.

46


commit to user

Mekanismenya adalah pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam

lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan

sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). pada tahap

selanjutnya, yaitu propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen

membentuk radikal peroksi (reaksi 2). Radikal peroksi lebih lanjut akan

menyerang asam lemak menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak

baru (reaksi 3).

Inisiasi : RH R* + H* (1)

Propagasi : R* + O2 ROO* (2)

ROO* + RH ROOH +R* (3)

Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi

lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti

aldehida dan keton. Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan

mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks

bukan radikal (reaksi 4).

Terminasi : ROO* +ROO* non radikal (reaksi 4)

R* + ROO* non radikal

R* + R* non radikal

Antioksidan yang baik akan bereaksi dengan radikal asam lemak segera

setelah senyawa tersebut terbentuk. Dari berbagai antioksidan yang ada,

mekanisme kerja serta kemampuannya sebagai antioksidan sangat bervariasi.

Seringkali, kombinasi beberapa jenis antioksidan memberikan perlindungan yang

lebih baik (sinergisme) terhadap oksidasi dibanding dengan satu jenis antioksidan

saja (Medikasari, 2002). Kombinasi antara β-karoten dan tokoferol dalam ekstrak

buah kuning dapat menghalangi oksidasi asam lemaknya. Hal ini dibuktikan dari

tidak adanya derivat asam lemak pada spektra GC-MS.

Fenomena ini berbeda dengan pemisahan pada ekstrak buah merah. Pada

ekstrak buah merah murni yang dipisahkan dengan modifikasi yang sama

dihasilkan senyawa turunan asam lemak yaitu dioktil p-thalat. Perbedaan hasil ini

dimungkinkan karena perbedaan kadar asam lemak tak jenuh dan perbedaan

47


commit to user

kadar senyawa antioksidan yaitu β-karoten dalam ekstrak buah merah dan

ekstrak buah kuning.

Berdasarkan penelitan ini dapat diketahui bahwa keberadaan senyawa

antioksidan dalam ekstrak buah kuning mampu menangkal radikal bebas yang

dihasilkan dari reaksi oksidasi asam lemaknya. Sehingga ekstrak buah kuning

aman dikonsumsi secara langsung. Kelebihan asam lemak dalam tubuh akan

disimpan dalam bentuk trigliserida sebelum masuk pada jalur asam lemak.

48


commit to user

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Dari hasil penelitian dan pembahasan dapat diambil kesimpulan bahwa

dengan teknik kromatografi kolom yang dimodifikasi fasa diamnya yaitu

dengan penambahan alumina basa pada silika dan MnO2 3% trigliserida

terpisah dari asam lemak bebas pada ekstrak buah kuning yang terbentuk

dari hasil modifikasi.

2. Dari hasil pemisahan ini pada fraksi trigliseridanya tidak dihasilkan

senyawa turunan dioktil pthalat sebagai senyawa turunan asam lemak.

Sedangkan untuk fraksi trigliserida pada ekstrak buah merah dapat

dihasilkan senyawa dioktil pthalat. Perbedaan hasil ini disebabkan karena

perbedaan jenis asam lemak yang bereaksi dengan oksidator.

B. Saran

Berdasarkan kesimpulan diatas hendaknya dilakukan penelitian lebih lanjut

mengenai:

1. Mekanisme penghambatan reaksi oksidasi oleh β-karoten dan tokoferol

dalam pemisahan trigliserida menggunakan teknik modifikasi fasa diam

kromatografi untuk mengetahui manakah yang dominan menghambat

reaksi oksidasi.

2. Identifikasi fraksi kedua jika fraksi dipisahkan dan dikumpulkan dalam

jumlah yang banyak sehingga dapat diketahui jenis asam lemak dan

senyawa lain.

49

MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK … · Dari dasar hati penulis menyampaikan terima kasih...

Documents

Transcript of MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK … · Dari dasar hati penulis menyampaikan terima kasih...