IZOLACIJA IN BIOLOŠKA AKTIVNOST SARAINOV IZ MORSKE … · tehnikama jedrska magnetna resonanca...

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ENOTA MEDODDELČNEGA ŠTUDIJA MIKROBIOLOGIJE

Lucija RASPOR

IZOLACIJA IN BIOLOŠKA AKTIVNOST SARAINOV IZ MORSKE SPUŽVE Reniera sarai (Pulitzer-Finali)

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij

ISOLATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF SARAINS FROM MARINE SPONGE Reniera sarai (Pulitzer-Finali)

GRADUATION THESIS

Univesity Studies

Ljubljana, 2008

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 II

Diplomsko delo predstavlja zaključek univerzitetnega študija mikrobiologije.

Opravljeno je bilo na Katedri za biokemijo, Oddelka za biologijo, Biotehniške fakultete

Univerze v Ljubljani in v Laboratoriju za bioorgansko kemijo, Oddelka za fiziko Univerze v

Trentu, Italija (Laboratorio di Chimica Bioorganica, Dipartimento di Fisica, Universitá di

Trento).

Po sklepu Študijske komisije univerzitetnega študija mikrobiologije je bila dne 24.5.2006 in

23.6.2008 za mentorico diplomskega dela imenovana prof. dr. Kristina Sepčić, za somentorico

prof. dr. Ines Mancini in za recenzenta prof. dr. Tom Turk.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednica: prof. dr. Ines MANDIĆ MULEC

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Članica: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Članica: prof. dr. Ines Mancini

Univerza v Trentu, Oddelek za fiziko

Član: prof. dr. Tom TURK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Datum zagovora:

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Lucija Raspor

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn DK UDK KG naravni produkti / morski produkti / morska spužva / Reniera sarai / izolacija /

strukturna karakterizacija / saraini / protibakterijsko / hemolitično / anti-acetilholinesterazno delovanje

AV RASPOR, Lucija SA SEPČIĆ, Kristina (mentorica) /MANCINI, Ines (somentorica)/ TURK, Tom

(recenzent) KZ SI- 1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije LI 2008 IN IZOLACIJA IN BIOLOŠKA AKTIVNOST SARAINOV IZ MORSKE SPUŽVE

Reniera sarai (Pulitzer-Finali) TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij) OP XII, 69 str., 6 pregl., 49 sl., 29 vir. IJ sl JI sl/en

AI Sredozemska spužva Reniera sarai (Pulitzeri-Finali) vsebuje velike količine policikličnih alkaloidov sarainov: saraine 1-3, njihove stereoizomere izosaraine 1-3 in saraine A-C. Njihova posebna kemijska struktura in obilna prisotnost v spužvi nas je spodbudila k tej raziskavi. Saraine smo izolirali iz metanolnega ekstrakta spužve ter jih karakterizirali s tehnikama jedrska magnetna resonanca (NMR) in masna spektrometrija (MS) ter preverili njihove biološke lastnosti. Odkrili smo dva do zdaj še neopoznana saraina z molekuskima masama 524 in 442. Ovrednotili smo njihovo protibakterijsko, hemolitično in protiacetilholinesterazno aktivnost.

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Dn DC CX natural products / marine metabolites / sponges / Reniera sarai / isolation /

characterization of structure / saraines / antibacterial / hemolytic / anti-cholinesterase activity

CC RASPOR, Lucija AA SEPČIĆ, Kristina (supervisor) / MANCINI, Ines (co-advisor) / TURK, Tom

(reviewer) PP SI- 1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Interdepartmental Programme in

Microbiology PY 2008 TI ISOLATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF SARAINS FROM MARINE

SPONGE Reniera sarai (Pulitzer-Finali) DT Graduation Thesis (University studies) NO XII, 62 p., 6 tab., 49 fig., 29 ref. LA sl AL sl/en AB The Mediterranean sponge Reniera sarai (Pulitzeri-Finali) contains large amounts of

polycyclic alkaloids saraines: saraines 1-3 their stereoisomers isosaraines 1-3, and sarains A-C. Their particular chemical structure and abundance in the sponge stimulated this investigation. After isolation of saraines from the methanolic extract of the sponge, they were characterized using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Mass Spectrometry (MS), and their biological activities were tested. Two new alkaloids with molecular masses of 524 and 442 were found. Isolated mixtures and pure compounds were evaluated for their antibacterial, hemolytic and anti-cholinesterase activity.

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ..................................................... III

KEY WORDS DOCUMENTATION ...................................................................................IV

KAZALO VSEBINE............................................................................................................... V

KAZALO PREGLEDNIC..................................................................................................VIII

KAZALO SLIK......................................................................................................................IX

SIMBOLI IN OKRAJŠAVE .................................................................................................XI

1 UVOD ..................................................................................................................................... 1

1.1 NAMEN DELA IN HIPOTEZE ...................................................................................... 1

2 PREGLED OBJAV............................................................................................................... 2

2.1 SEKUNDARNI METABOLITI IZ MORSKIH ORGANIZMOV.................................. 2

2.2 SARAINI.......................................................................................................................... 6

2.2.1 Saraini A, B in C...................................................................................................... 6

2.2.2 Saraini 1, 2, 3 in izosaraini 1, 2, 3 .......................................................................... 8

2.2.3 Predlagana biogeneza sarainov.............................................................................. 9

2.2.4 Biološke aktivnosti sarainov................................................................................. 11

2.2.5 Sinteze sarainov ..................................................................................................... 12

3 MATERIALI IN METODE ............................................................................................... 13

3.1 IZVOR SPUŽVE............................................................................................................ 13

3. 2 LOČEVANJE SNOVI IZ ZMESI S KROMATOGRAFSKIMI METODAMI ........... 13

3. 2. 1 Temelji kromatografije....................................................................................... 13

3.2.2 Tankoplastna kromatografija (TLC) .................................................................. 13

3.2.3 Kolonska tekočinska kromatografija .................................................................. 14

3.2.4 Visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC) ............................................. 15

3.3 INSTRUMENTALNE TEHNIKE ZA DOLOČANJE MASE IN STRUKTURE SNOVI.................................................................................................................................. 16

3.3.1 Masna spektrometrija........................................................................................... 16

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 VI

3.3.2 Uvod v spektroskopijo .......................................................................................... 18

3.3.3 Jedrska magnetna resonanca (NMR).................................................................. 19

3.3.4 Infrardeča spektrometrija (Fourier transformed infrared spectrometry, FTIR) ............................................................................................................................... 21

3.3.5 Absorpcijska spektroskopija................................................................................ 22

3.3.6 Optična aktivnost .................................................................................................. 24

3.4 TESTI ZA DOLOČANJE BIOLOŠKE AKTIVNOSTI ................................................ 24

3.4.1 Določanje protibakterijske aktivnosti z difuzijskim testom na agarju ............ 24

3.4.2 Hemolitični test ...................................................................................................... 25

3.4.3 Test inhibicije acetilholinesteraze ........................................................................ 26

4 REZULTATI ....................................................................................................................... 27

4.1 IZOLACIJA IN ČIŠČENJE SARAINOV ..................................................................... 27

4.1.1 Ekstrakcija............................................................................................................. 27

4.1.2 Kromatografsko čiščenje ...................................................................................... 28

4.2 PRIPRAVA PROTONIRANIH SARAINOV ............................................................... 32

4.3 DOLOČITEV KEMIJSKIH LASTNOSTI SARAINOV .............................................. 32

4.3.1 Saraini A, B in C.................................................................................................... 33

4.3.2 Saraini 1, 2, 3 in izosaraini 1, 2, 3 ........................................................................ 37

4.3.3 Novi saraini ............................................................................................................ 39

4.2 BIOLOŠKE AKTIVNOSTI SARAINOV ..................................................................... 45

4.2.1 Protibakterijska aktivnost.................................................................................... 45

4. 2. 2 Hemolitična aktivnost ......................................................................................... 47

4.2.3 Antiacetilholinesterazna aktivnost....................................................................... 49

5 RAZPRAVA IN SKLEPI ................................................................................................... 51

5.1 IZOLACIJA IN DOLOČANJE STRUKTURNIH LASTNOSTI SARAINOV............ 51

5.2 BIOLOŠKA AKTIVNOST SARAINOV ...................................................................... 55

5.2.1 Protibakterijska aktivnost.................................................................................... 56

5.2.2 Hemolitična aktivnost ........................................................................................... 57

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 VII

5.2.3 Acetilholinesterazna aktivnost ............................................................................. 57

5.3 SKLEPI .......................................................................................................................... 58

6 POVZETEK......................................................................................................................... 60

7 VIRI IN LITERATURA..................................................................................................... 61

ZAHVALA.............................................................................................................................. 64

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 VIII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Biološke aktivnosti sarainov (Caprioli in sod., 1992). ..................................................................11

Preglednica 2: Masa snovi v izoliranih frakcijah. .................................................................................................30

Preglednica 3: Minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) testnih spojin proti izbranim bakterijam. MIK je

izražena kot masna koncentracija..................................................................................................46

Preglednica 4: Minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) testnih spojin proti izbranim bakterijam. MIK je

izražena kot molarna koncentracija. ..............................................................................................47

Preglednica 5: Konstante inhibicije in tipi inhibicije vzorcev sarainov.. ...............................................................49

Preglednica 6: Minimalne inhibitorne koncentracije (µg/ml) čistih sarainov proti bakteriji S. aureus..................57

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 IX

KAZALO SLIK Slika 1: Spužve ostajajo najbolj preučevani morski organizmi na področju sekundarnih metabolitov

(Debitus, 2005). .......................................................................................................................................3

Slika 2: Število objavljenih znanstvenih člankov o bioaktivnih naravnih produkih posameznih redov spužev do

leta 2002 (Debitus, 2005). ..........................................................................................................................3

Slika 3: Število naravnih morskih produktov, izoliranih iz spužev, v odnosu na vse morske organizme in glede

na geografsko področje izvora (Debitus, 2005). ........................................................................................4

Slika 4: Porazdelitev bioloških aktivnosti med posameznimi debli morskih organizmov (Debitus, 2005). ............4

Slika 5: Prikaz poti raziskav od biološko aktivne snovi do zdravila. .......................................................................5

Slika 6: Razvoj raziskav morskih metabolitov: število znanstvenih objav v povezavi z razvojem instrumentalnih

tehnik skozi čas (Debitus, 2005) ................................................................................................................6

Slika 7: Sarain A (C32H50N2O3), sarain B (C33H50N2O3) in sarain C (C34H52N2O3) .................................................7

Slika 8: Delna struktura sarainov A-C. Razvidna je amino-dipolarna oblika (A) v ravnotežju z dipolarno

obliko (B) iz katere ob prisotnosti kisline nastane protonirana oblika (C).................................................8

Slika 9: Saraini 1-3 in izosaraini 1-3........................................................................................................................9

Slika 10: Možna retrosintetska pot sarainov A-C (označen z 1-3), sarainov 1-3 (4-6) in izosarainov 1-3 (7-9)

kot je navedena v Guo in sod., 1996 .......................................................................................................10

Slika 11: Biogenetske poti saraina A in manzamina A po Maranzanovem predlogu (Ge in sod., 2006).

Sarain A lahko nastane s kondenzacijo sfingolipida (2), amino aldehida (3) in dveh monoaldehidov ...11

Slika 12: Prikaz poteka ločevanja različno polarnih snovi z adsorpcijsko kromatografijo (Flash

Chromatography, FC) .............................................................................................................................14

Slika 13: Shematski prikaz sistema za visokotlačno tekočinsko kromatografijo (HPLC). ....................................15

Slika 14: Potek ionizacije z elektrorazprševanjem ................................................................................................17

Slika 15: LC-ESI-MS instrument ..........................................................................................................................18

Slika 16: Elektromagnetni spekter .........................................................................................................................19 Slika 17: NMR spektrometer. ................................................................................................................................20

Slika 18: Shema dvožarkovnega spektrofotometra. ...............................................................................................23

Slika 19: Merjenje optične aktivnosti s polarimetrom ..........................................................................................24

Slika 20: ESI-MS spekter vzorca A in B ..............................................................................................................27

Slika 21: Različna načina vizualizacije: pooglenitev s cerijevim sulfatom v kisli raztopini in z jodovimi parami

obarvana TLC plošča. ............................................................................................................................28

Slika 22: Shematični prikaz poteka izolacije sarainov. .........................................................................................29

Slika 23: Kromatogram HPLC frakcije 8 DIOL 15 na koloni Merck 100DIOL LiChrospher...............................31

Slika 24a:Analizi EI-MS surovega izvlečka A morske spužve Reniera sarai. Spekter je bil posnet pri

229 °C 33

Slika 24b:Analizi EI-MS surovega izvlečka A morske spužve Reniera sarai. Spekter je bil posnet pri

335 °C 34 Slika 25: ESI (+)-MS spekter mešanice sarainov A, B in C ..................................................................................34

Slika 26: ESI(+)-MS/MS spektri fragmentov sarainov A, B in C .........................................................................34 Slika 27: Spekter ESI(+)-MS mešanice sarainov A, B in C. Monomeri sarainov A, B in C (v območju m/z 500)

in dimerni skupki različnih kombinacij (v območju m/z 1000). ..............................................................35

Slika 28: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov A, B in C. ....................................................................36

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 X

Slika 29: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov A, B in C z dodatkom trietilamina .............................36

Slika 30: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov A, B in C po obdelavi s trifluoroocetno kislino .........37

Slika 31: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov 1,2 in 3 ........................................................................37

Slika 32: Spekter ESI(+)-MS/MS fragmentiranega vzorca sarainov 2, 1 in 3 ......................................................38

Slika 33: 1H-NMR (400MHz) spekter čistega saraina 1 v topilu CDCl3. ..............................................................38

Slika 34: 1H-NMR (400MHz) spekter čistega saraina 3 v CDCl3. ........................................................................39

Slika 35: Spekter ESI(+)-MS surovega ekstrakta sarainov ...................................................................................40

Slika 36: Spekter ESI(+)-MS/MS snovi z vrhom pri m/z 525................................................................................40

Slika 37: 1HNMR spekter (pri 400 MHz) novega saraina z molekulsko maso 524 ...............................................41

Slika 38: Korelacijske mape 1H-13C iz dvodimenzionalnega spektra, pridobljene z vrsto HSQC spektrov

čistega novega saraina (m/z 525) ............................................................................................................41

Slika 39: UV spekter novega saraina z molekulsko maso 524...............................................................................42

Slika 40: IR spekter novega saraina z molekulsko maso 524.................................................................................42

Slika 41: EI-MS spekter čistega novega saraina z molekulsko maso 442 g/mol ..................................................43

Slika 42: 1H-NMR (400MHz) spekter novega saraina z molekulsko maso 442.....................................................44

Slika 43: Dvodimenzionalen spekter 1H-13C dolgega dosega (HMBC) saraina z molekulsko maso 442. .............44

Slika 44: Spekter IR novega saraina z molekulsko maso 442................................................................................45

Slika 45: Časovni potek hemolize, povzročene z vzorcem 1A pri koncentraciji 0,3 µg/ml ..................................47

Slika 46: Recipročne vrednosti polovičnih časov hemolize (min-1) , povzročene z vzorci 1, 2, 3, 4, 5, 7, 1A

in 1B v odvisnosti od masne koncentracije testiranih spojin (µg/ml) ....................................................48

Slika 47: Dixonovi diagrami inhibicije acetilholinesteraze iz električne jegulje s testnimi vzorci 1-7, 1A in 1B

[saraini – čisti in zmesi] pri treh različnih koncentracijah substrata acetiltioholina................................50

Slika 48: Delna struktura sarainov A-C ................................................................................................................52

Slika 49: Struktura novega saraina (brez stereokemijskih lastnosti) z molekulsko maso 442. ..............................55

Raspor L. Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 XI

SIMBOLI IN OKRAJŠAVE

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AChE Acetilholin esteraza Ara-A 9-β-D-arabinofuranoziladenin Ara-C 1-β-D-arabinofuranozilcitozin B. subtilis Bacillus subtilis C svetlobna hitrost CeSO4 Cerijev sulfat DIOL Stacionarna faza Merck LiChroprep DIOL F245s, 25 – 40 µm DMSO Dimetil sulfoksid DNK Deoksiribonukleinska kislina EE Encimska enota EI-MS Masna spektrometrija z ionizacijo z elektroni (Electron Impact Mass

Spectrometry) ESI-MS Masna spektrometrija z ionizacijo z elektrorazprševanjem (Electrospray Mass

Spectrometry) FC Adsorbcijska kromatografija na trdni fazi (Flash chromatography) FTIR Infrardeča spektrometrija (Fourier transformed infrared spectrometry) GC/MS plinska kromatografija/masna spektrometrija H Planckova konstanta HMBC Heteronuclear Multiple Bond HPLC Visokotlačna tekočinska kromatografija (High performance liquid

chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation I Intenziteta prepuščene svetlobe IK Inhibitorna koncentracija IR Infrardeče Ki Konstanta inhibicije LC/MS tekočinska kromatografija/masna spektrometrija LD letalna doza (Lethal Dose) MIK Minimalna inhibitorna koncentracija (Minimal Inhibitory Concentration) MS Masna spektrometrija NMR Jedrska magnetna resonanca (Nuclaer Magnetic Resonance) NMR HR Jedrska magnetna resonanca visoke ločljivosti (Nuclaer Magnetic Resonance

High Resolution) poliAPS 3-alkilpiridinijeve soli R. sarai Reniera sarai RP Reverzna faza (Reversed Phase) RP Stacionarna revezna faza (Merck RP-18, 40 - 63 µm) S. algalactiae Streptococcus agalactiae S. aureus Staphylococcus aureus SiOH Silanol TLC Tankoplastna kromatografija (Thin Layer Chromatography) TMS Tetrametilsilan UV svetloba Ultravijolična svetloba VIS svetloba Vidna svetloba Z Naboj λ valovna dolžina sevanja

Raspor L.Izolacija in biološka aktivnost sarainov iz morske spužve Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, 2008 1

1 UVOD Morje predstavlja velik, še neraziskan vir tako živih organizmov kot njihovih naravnih produktov. Morske spužve (Porifera) so sesilni organizmi, ki so v visoko kompetitivnem morskem okolju razvili svoje strategije preživetja. Ena od teh je kemijska obramba s produkcijo sekundarnih naravnih produktov. Zato ni čudno, da so prav morske spužve izvor mnogih novih biološko aktivnih spojin. Ene bolj preiskovanih tovrstnih spojin so vodotopne polimerne alkilpiridinijeve soli, imenovane poli-APS, izolirane iz spužve Raniera sarai. So močni in vitro inhibitorji acetilholinesteraze (Sepčić in sod., 1997a), zmerno hemolitični in zmerno citotoksični (Sepčić in sod., 1997b) Poleg uporabe v medicini se v zadnjem času odpirajo možnosti njihove uporabe v protivegetativne namene (Sepčić in Turk, 2006).

1.1 NAMEN DELA IN HIPOTEZE

Kar nekaj zanimivih sekundarnih naravnih produktov, ki jih izdelujejo morske spužve, je topnih v nepolarnih organskih topilih (npr. halitoxin, izoliran iz haploskleridne spužve rodu Haliclona (Schmitz in sod., 1978)). Tako smo se odločili preveriti morebitne biološke aktivnosti nepolarne frakcije spužve Reniera sarai. V okviru programa Erasmus smo iz spužve v Laboratoriju za bioorgansko kemijo Fakultete za fiziko Univerze v Trentu (Italija) izolirali mešanice nepolarnih biološko aktivnih policikličnih alkaloidov sarainov A, B, C in 1, 2, 3, ter posamezne čiste saraine. Nato smo v biokemijskem laboratoriju na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani preizkusili njihove protibakterijske, hemolitične in anti-acetilholinesterazne aktivnosti in poskušali sklepati na njihovo povezanost s strukturo molekul. Pričakovali smo inhibicijo celične rasti in prisotnost tako hemolitične kot anti-acetilholinesterazne aktivnosti. Predvidevali smo tudi razlike v aktivnostih med posameznimi strukturnimi skupinami (saraini 1, 2, 3, izosaraini 1, 2, 3 in saraini A, B, C).


2 PREGLED OBJAV

2.1 SEKUNDARNI METABOLITI IZ MORSKIH ORGANIZMOV

Pojav multirezistentnih sevov bakterij in nekritična uporaba antibiotikov nas sili k nenehnemu iskanju novih strategij za zatiranje bakterjskih okužb. Prav zato je razvijanje novih antibiotikov trenutno na prvem mestu biomedicinskih raziskav (Mancini in sod., 2007). Naravni produkti že od nekdaj igrajo pomembno vlogo v medicini, saj je kar 40 % zdravil zasnovanih na naravnih strukturah. Produkti iz morskih virov pa vedno bolj prevzemajo glavno mesto pri novejših raziskavah možnih zdravil. Pod imenom morski naravni produkti si predstavljamo sekundarne metabolite morskih organizmov, ki za razliko od primarnih (kot so npr. beljakovine, sladkorji, nukleotidi, itd.) niso neposredno vpleteni v osnovne metabolne procese. Uporabljajo se pri interakcijah med organizmi in kot odgovor na zunanje dražljaje: spremembo prehranjevanja, okužbe in kompeticijo. Glavni izzivi, ki jih ponujajo tovrstni metaboliti, temeljijo na naslednjih dejstvih: • V primerjavi s kopenskimi viri, ki jih preučujejo že dalj časa, je biološka raznovrstnost

morskega okolja neizmerno večja, kajti delno neraziskanih ostaja kar 34 od vseh znanih 36 debel več kot 300 000 živalskih in rastlinskih vrst, ki živijo v morju. Zaenkrat namreč le 10 % od vseh 145 000 uporabljenih naravnih spojin izhaja iz v morju živečih organizmov. Najvišja biološka raznolikost je v oceanih, z njo pa je povezana tudi velika kemijska raznolikost

• Spojine iz morskih organizmov so že same po sebi visoko aktivne in selektivne, ker so

»izdelane« v naravi za zaščito določenega organizma, ter izbrane in podvržene selekcijskemu pritisku v nekaj sto milijonih let, da bi dosegle optimalno aktivnost za opravljanje posebnih funkcij (naravna obramba ali spolni mehanizmi).

• Morski organizmi izdelujejo molekule z enkratnimi strukturami s številnimi kiralnimi

centri. Poleg tega v strukturo vgrajujejo halogene atome, kar se na kopnem ne pojavlja pogosto.

Kljub temu, da je v klinični uporabi in na farmacevtskem trgu le malo zdravil morskega izvora (npr. derivati nukleozidov Ara-A in Ara-C iz spužve Cryptotechia crypta, ki imajo tako antivirusno kot antilevkemijsko aktivnost, ali ω-konotoksin iz polža Conus magnus, ki je močan analgetik), jih je še veliko udeleženih v kliničnih in prekliničnih študijah.


Slika 1. Spužve ostajajo najbolj preučevani morski organizmi na področju sekundarnih metabolitov (Debitus, 2005).

Največji del (kar 5300 od 15000, oz. 37 %) morskih sekundarnih metabolitov je bilo izoliranih iz spužev. Te ostajajo najbolj preučevana skupina izmed vseh morskih organizmov (slika 1). Kot je prikazano na sliki 2, ki prikazuje število znanstvenih objav v odvisnosti od posameznih redov spužv, so haploskleridne spužve med najbolj preučevanimi spužvami. V ta red so vključene spužve različnih vrst iz vseh različnih globin, iz katerih sobili izolirani in okarakterizirani številni toksini. Med haploskleride uvrščamo tudi spužvo Halicona (Reniera) sarai, ki smo jo uporabili pri našem delu.

Slika 2: Število objavljenih znanstvenih člankov o bioaktivnih naravnih produkih posameznih redov spužev do leta 2002 (Debitus, 2005). Na sliki 3 je predstavljena relativna količina izoliranih produktov iz morskih spužev in ostalih morskih organizmov glede na geografsko področje. Razvidno je, da sekundarni morski metaboliti iz spužev predstavljajo pomemben delež glede na ostale morske organizme, in to ne glede na lokacijo njihove rasti.


Slika 3. Število naravnih morskih produktov, izoliranih iz spužev, v odnosu na vse morske organizme in glede na geografsko področje izvora (Debitus, 2005). Približno polovica metabolitov, izoliranih iz spužev, pokaže določeno biološko aktivnost. Razmerje med aktivnimi in neaktivnimi metaboliti je večje kot v ostalih morskih organizmih. Med bioaktivnimi spojinami, izoliranimi iz spužev, je večina preučevanih pokazala protitumorsko delovanje, nekoliko manj pa protimikrobne učinke (slika 4).

Slika 4. Porazdelitev bioloških aktivnosti med posameznimi debli morskih organizmov (Debitus, 2005).

Upoštevajoč biogenetski izvor morskih naravnih produktov iz spužev, so najbolj preučevana skupina izoprenoidi (48 %), v manjši meri pa po vrsti poliketidi, alkaloidi in peptidi.


Natančneje predstavlja literatura o alkaloidih 15 % vse literature. Iz sredozemske spužve Reniera sarai izolirane saraine, ki smo jih preučevali v tej nalogi in preverjali njihovo biološko aktivnost, uvrščamo med alkaloide. Preiskave bioaktivnih molekul izoliranih iz narave (še posebej izoliranih iz morskih organizmov) zahtevajo interdisciplinarno delo, ki izkoristi tako biološke (nabiranje materiala, identifikacija vzorca in študije bioaktivnosti) kot kemijske metode (določitev strukturnih značilnosti z uporabo fizikalnih metod in organskih sintez). Interdisciplinarnost in zapletenost poti od vzorca do uporabe bioaktivne snovi traja vsaj 10 let in je prikazana na sliki 5.

Slika 5: Prikaz poti raziskav od biološko aktivne snovi do zdravila.

V šestdesetih letih prejšnjega stoletja je s Paul-om Scheur-jem (1915-2003) s havajske univerze spet narastlo zanimanje moderne kemije za morske produkte. Od takrat je razvoj študij morskih naravnih produktov tesno povezan z razvojem uporabljanih instrumentalnih tehnik. To so za čiščenja uporabna visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC; ang. High Performance Liquid Chromatography), za določitev molekularne strukture pa tehnika jedrske magnetne resonance (NMR; ang. Nuclaer Magnetic Resonance) visoke ločljivostji (HR; ang. High Resolution) in v dvodimenzionalnih izvedbah (paritev vodik-vodik; ang.1H1H coupling in paritev vodik-ogljik; ang. 1H13C coupling). Razvoj teh raziskovalnih tehnik je omogočil preučevanje vedno manjših količin snovi, kar trenutno ustreza nekaj miligramom, izoliranih iz surovega izvlečka (slika 6).


Slika 6. Razvoj raziskav morskih metabolitov: število znanstvenih objav v povezavi z razvojem instrumentalnih tehnik skozi čas (Debitus, 2005). Ostalebiološko aktivne snovi v morski spužvi Reniera sarai Poleg sarainov morska spužva Reniera sarai proizvaja še številne druge biološko aktivne snovi. Najbolj proučevana skupina so 3-alkilpiridinijeve soli (poli-APS), izolirane iz vodnega ekstrakta te spužve. Poli-APS so polimeri z lastnostmi detergenta, ki so se iskazali kot močni inhibitorji encima acetilholinesteraze. Razen tega delujejo hemolitično in citotoksično. S tvorbo prehodnih por v membranah celic omogočajo njihovo stabilno transfekcijo s tujerodno DNK. Imajo tudi protivegetativne učinke, saj reverzibilno preprečujejo pritrjanje ličink rakov vitičnjakov na potopljene površine (Sepčić in Turk, 2006).

2.2 SARAINI

2.2.1 Saraini A, B in C Saraini A-C so alkaloidne policiklične spojine, so bile prvič izolirane iz spužve Reniera sarai, nabrane v Neapeljskem zalivu, ki je bogato poseljen s temi organizmi (Cimino in sod., 1989b). Sestavljeni so iz zapletenih heteropoliciklov, ki vsebujejo dva atoma dušika (slika 7).


Slika 7. Sarain A (C32H50N2O3), sarain B (C33H50N2O3) in sarain C (C34H52N2O3), po Guo in sod 1996a.

Oznake A do C so dobile spojine po naraščujoči molekulski masi. Pri analizah s tankoplastno kromatografijo so molekule puščale lise, ki so absorbirale UV svetlobo. Navadno je ta pojav pogojen s prisotnostjo nenasičenih konjugiranih dvojnih vezi v snovi. Lastnosti njihove strukture so bile določene s tehniko NMR v močnem magnetnem polju in dokončno določene s študijo acetiliranega derivata saraina A z rentgensko difrakcijo (Cimino in sod., 1990). Saraine sestavlja dinitrogentriciklodekan (dva atoma dušika in enajst ogljikovih atomov, ki tvorijo tri cikle), povezan z dvema lateralnima verigama. Saraina B in C sta se izkazala za podobni spojini, le da vsebujeta dodaten eden ali dva ogljikova atoma.

Strukturna značilnost sarainov in razlaga za nepravilno obnašanje pri različnih kromatografskih pogojih je prisotnost aldehidne skupine in terciarnega amina, ki se nahajata blizu drug drugega ter lahko reagirata med sabo z nukleofilno substitucijo med dušikom terciarnega amina in aldehidom. Nastane ionski produkt, ki je veliko bolj polaren od izhodne spojine.

Reakcija tega “efekta bližine” (Cimino in sod., 1990) se lahko premakne v smer proti protonirani obliki (desna struktura na sliki 8) zaradi obdelave s kislino ali pa že samo zaradi kislega obnašanja silikagela, uporabljenega kot stacionarna faza pri tekočinski kromatografiji. Nevtralna oblika (leva struktura na sliki 8) prevladuje, če saraine A-C obdelano z bazičnim NaHCO3 (Cimino in sod., 1989a).


Slika 8. Delna struktura sarainov A-C. Razvidna je amino-dipolarna oblika (A) v ravnotežju z dipolarno obliko (B) iz katere ob prisotnosti kisline nastane protonirana oblika (C).

Dalje so isti avtorji (Guo in sod., 1996b) analizirali NMR podatke sarainskih izomerov, pridobljenih z derivatizacijo hidroksilne skupine (Mosherjeva metoda). Relativna pozicija različnih kiralnih centrov je bila razkrita že prej (Cimino in sod., 1990) z rentgensko difrakcijo. Novi NMR podatki danes omogočajo določitev absolutne konfiguracije v vseh kiralnih centrih molekul sarainov A-C.

Tako zapletena struktura in nenavadno obnašanje sarainov so pritegnili pozornost številnih sinteznih kemikov. Objavljenih je na desetine del o poskusih in strategijah sintez osnovnih enot sarainov, tudi z upoštevanjem biogenetskih poti (Ge in sod., 2006). Kjub temu je znana samo ena sinteza enantiomerno čistega saraina A (Garg in sod., 2006).

2.2.2 Saraini 1, 2, 3 in izosaraini 1, 2, 3 Saraini 1 - 3 so bile prve spojine izolirane iz spužve Reniera sarai, ki spadajo v skupino sarainov (Cimino in sod., 1986a, Cimino in sod., 1986b). Metaboliti so bili prisotni v spužvi v velikem številu (6 % suhe teže spužve), njihovo kromatografsko čiščenje pa je bilo zelo zahtevno zaradi njihovega nenavadnega obnašanja. »Zasluge« za tovrstne težave lahko pripišemo interakcijam med saraini in solmi, prisotnimi v kromatografskih substratih. Tudi strukturna karakterizacija ni bila enostavna, saj so molekule zgrajene na kar kompleksen način (Slika 9). Spojine so bile poimenovane od 1 do 3 po naraščajoči polarnosti. Sarain 2 in sarain 3 sta homologa saraina 1 in se razlikujeta samo v dolžini alkilnih verig (Cimino in sod., 1989b). Kasneje je bil izoliran izosarain 1, ki kaže enako molekularno formulo (C31H50N2O) kot sarain 1 (Cimino in sod., 1989b). Na podlagi NMR analiz sklepamo, da morata biti spojini stereoizomeri, ki se razlikujeta le stereokemijsko v nekaterih kiralnih centrih. Absolutna konfiguracija sarainov 1 in 2 je bila kasneje potrjena z Mosherjevo metodo z modificiranimi analogi, v našem primeru sarainov A-C (Guo in sod., 1996b) kot nato


analogov izosaraina 1 in izosaraina 2 (Guo in sod., 1998). Tako določena struktura je prikazana na sliki 8. Razvidno je, da imajo saraini 1, 2, in 3 enako konfiguracijo na kiralnih centrih C1, C2, C9 in C10, izosaraini 1, 2 in 3 pa imajo nasprotno obrnjene kiralne centre C1, C2, C9 in C10. Kljub podobnemu imenu in molekulski masi se saraini A-C strukturno razlikujejo od sarainov 1-3 in izosarainov 1-3. Za saraine A-C je značilna centralna tetraciklična “kletka” iz dveh povezanih piperidinskih obročev, ki jo obkrožata dve alkilni verigi (Slika 7). Pri sarainih 1-3 in izosarainih 1-3 pa se kvinolizidonski obroč neposredno in z dvema alkilnima verigama veže na nenasičen piperidinski obroč (Slika 9).

Slika 9. Saraini 1-3 in izosaraini 1-3.

2.2.3 Predlagana biogeneza sarainov Kljub temu, da saraini 1-3 in izosaraini 1-3 kažejo drugačno zgradbo od sarainov A-C, s katerimi se pojavljajo skupaj, je za razlago njihovega nastanka predlagana ista biogenetska pot. Podobno kot v Baldwinovem predlogu za manzamine (Baldwin in sod., 1992) je na sliki 10 prikazano, kako naj bi bili ti naravni produkti sintetizirani in vivo, pri čemer je verjetna vpletenost encimov (Guo in sod., 1996a).


Slika 10. Možna retrosintetska pot sarainov A-C (označen z 1-3), sarainov 1-3 (4-6) in izosarainov 1-3 (7-9) kot je navedena v Guo in sod., 1996.

Pred kratkim je Ge s sodelavci (Ge in sod., 2006) sintetiziral glavno ogrodje saraina A, po poti, osnovani na predlagani biogenetski poti, opisani v sliki 11. Kot je razvidno že iz Baldwinove predpostavke, je biogeneza saraina A močno povezana z manzaminom A, alkaloidom, izoliranim iz spužve istega reda (Haplosclerida). Identificirali so tudi endosimbiontsko bakterijo, ki je odgovorna za sintezo manzamina A in živi povezana s spužvo (Ge in sod., 2006 in tam navedena literatura). Saraini bi torej lahko bili tudi produkt endosimbionta, ki živi v spužvi. Kljub temu, da je poročil o sintezi osnovnega ogrodja sarainov veliko, je prva popolna sinteza bila objavljena komaj leta 2006 (Garg in sod., 2006), kasneje pa je sinteza uspela še Overmanovi skupini (Becker in sod., 2007).


Slika 11. Biogenetske poti saraina A in manzamina A po Maranzanovem predlogu (Ge in sod., 2006). Sarain A lahko nastane s kondenzacijo sfingolipida (2), amino aldehida (3) in dveh monoaldehidov.

2.2.4 Biološke aktivnosti sarainov Saraini so predmet obširnih študij, povezanih z njihovo molekularno strukturo. Kljub velikemu številu objavljenih del o delnih sintezah je o njihovih bioloških aktivnostih znanega le malo. Edina tovrstna objava sega v leto 1992 (Caprioli in sod., 1992). Pri sarainih A-C in 1-3 so preizkusili citotoksično, insekticidno, protivegetativno, antimitotično in antibakterijsko aktivnost (Preglednica 1). Avtorji zaključujejo, da je biološka aktivnost pogojena s pH vrednostjo vzorca. Preglednica 1. Biološke aktivnosti sarainov (Caprioli in sod., 1992).

Testirana

spojina

Morski rakci Artemia salina (LD50, µg/ml)1

Krompirjeve rezine, okužene z A.tumefaciens (% inhibicije)

Ustavljen razvoj oplojenih jajčec morskega ježka

(IK, µg/ml)

Protibakterijska aktivnost proti bakteriji Staphylococcus aureus (MIK, µg/ml)2

Sarain A 46.7 35 3.12 12.5

Sarain B 6.8 30 3.12 25.0

Sarain C 4.5 40 1.56 25.0

Sarain 1 3.3 51 6.25 Ni aktivnosti3

Sarain 2 6.4 16 >50.0 50.0

Sarain 3 2.5 55 3.12 6.25

Penicilin G Na - - - 0.04

1 LD = letalna doza (Lethal Dose): količina snovi, ki ubije 50 % testirane populacije; 2MIC = Minimalna inhibitorna koncentracija (Minimal Inhibitory Concentration): najmanjša koncentracija, ki vidno inhibira mikrobno rast; 3Več kot 100 µg/ml.


2.2.5 Sinteze sarainov V splošnem je pridobivanje naravnih produktov s sintezo pomembno, ker potrdi molekularno strukturo spojine, ki smo jo predhodno določili na osnovi spektroskopskih podatkov. Omogoči pa tudi pridobitev večje količine snovi za biološka testiranja spojine same in njenih strukturnih analogov. V člankih o sarainih, ki se pojavljajo v letih 1986 do 1998, lahko opazimo precejšen poudarek na poskusih sinteze sarainov. Zaradi kompleksne strukture so se v prvih člankih ukvarjali s sintezo tricikličnega »jedra« saraina A, kot poroča pregledni članek (Heatchcock, 1995). Sledijo dela o dostopu v osrednji del molekule po vzoru biogenetske strategije in sklenitvi verig v makrocikle. Pred kratkim je skupini prof. Overmana (Garg in sod., 2006 in Becker in sod., 2007) kot prvi uspelo v celoti sintetizirati stereospecifični sarain A.


3 MATERIALI IN METODE

3.1 IZVOR SPUŽVE

Spužva Reniera sarai je bila nabrana spomladi leta 2002 v bližini otoka Cresa (Jadransko morje), v podvodni pečini na globini 40 m. Spužvo je identificiral Dr. Jean Vacelet iz Oceanografskega instituta v Marseilleu (Francija). Pred izolacijo sarainov je bilahomogenizirana v vodi in centrifugirana, saj so je uporabili za izolacijo vodotopnih polimernih alkilpiridinijevih soli (poli-APS, Sepčić in sod., 1997a). Sediment po centrifugiranju je bil liofiliziran in iz njega smo izolirali saraine (vzorec A). Druga spužva je bila nabrana na istem mestuleto kasneje (2003) in liofilizirana brez predhodne obdelave (vzorec B).

3. 2 LOČEVANJE SNOVI IZ ZMESI S KROMATOGRAFSKIMI METODAMI

3. 2. 1 Temelji kromatografije Kromatografska ločitev je rezultat različnih specifičnih interakcij med molekulami vzorca in stacionarno fazo ter molekulami vzorca in mobilno fazo (Synder in Kirkland, 1979) na podlagi velikosti, naboja ali polarnosti vsake komponente. Pri adsorpcijski kromatografiji nam kot stacionarna faza (t.j. adsorbent) služi nosilec, ki na svoji površini tvori intermolekularne interakcije z različno nabitimi oziroma bolj ali manj polarnimi molekulami. Stacionarna faza je trdna, navadno polarna (silikageli, aluminijevi oksidi), za mobilne faze pa uporabimo različna organska topila ali njihove mešanice. Poznamo tudi reverzno stacionarno fazo, kjer so na osnovne nosilce silikagela preko silanolne skupine (SiOH) pripete dolge alifatske verige (med katerimi je najbolj pogosta veriga z 18-imi C atomi, poznana kot reverzna faza (Reversed Phase RP-18), kar močno zamanjša njeno polarnost. Uporabljamo jo za ločevanje polarnješih snovi s polarnimi topili (voda, metanol, acetonitril). Mobilna faza nam omogoča nanašanje vzorca na stacionarno fazo, potovanje po stacionarni fazi in izpiranje iz nje.

3.2.2 Tankoplastna kromatografija (TLC) Ločevanje na osnovi adsorpcijske kromatografije se uporablja v različnih tehnikah: tankoplastni (TLC; ang. Thin Layer Chromatography), kolonski (ang. Column Chromatography) in visokotlačni (HPLC; ang. High Performance Liquid Cromatography). Razlika med kolonsko in TLC kromatogafijo je v nanosu stacionarne faze. Pri tankoplastni kromatografiji stacionarno fazo nanesemo na trdo ravno podlago v tankem sloju (0,25 mm ali 0,5 mm). Na površino na začetek nanesemo vzorec in ga posušimo, nato pa položimo v kromatografsko komoro, ki že vsebuje mobilno fazo. Zaradi efekta kapilarnosti mobilna faza,


ki je raztopila vzorec, potuje navzgor po stacionarni fazi. Vsaka komponenta vzorca prepotuje različno dolgo pot, ki je odvisna od različnih interakcij s stacionarno fazo. V primeru silikatnega gela bo polarna snov tvorila močnejše interakcije s stacionarno fazo in bo zato prepotovala krajšo pot kot manj polarna snov. Nato plošče posušimo in jih obsevamo z UV svetlobo. Če so v ločevani snovi prisotne komponente z nenasičenimi vezmi (kromoforji) vidimo temno liso, ki absorbira ultravijolično (UV) svetlobo (254 nm). Če je nenasičenih vezi veliko, absorbira tudi svetlobo vidnega spektra (400 – 800 nm) in se tvorijo obarvane lise. Dalje jih lahko naredimo vidne z različnimi metodami: lise se obarvajo, ker snov poogleni po obdelavi s CeSO4 v kislem okolju ali s parami joda, ki oksidira komponente in jih zato naredi vidne. Zadnji postopek je uporaben predvsem v postopkih analize snovi z nenasičenimi vezmi. Tankoplastne kromatografije se uporabljajo predvsem v analitične namene pri iskanju ustreznih pogojev za nadaljnjo kromatografsko ločitev s kolonsko kromatografijo.

3.2.3 Kolonska tekočinska kromatografija Pri kolonski tekočinski kromatografiji z nosilcem napolnimo kolono, nanesemo vzorec in spiramo s kontinuiranim, stopničastim ali gradientnim sistemom mobilnih faz, tako da spreminjamo polarnost mešanice mobilne faze. Gravitacija povzroči spiranje vzorca in nastanejo posamezne frakcije, ki jih zbiramo eno za drugo. Za izolacijo sarainov smo uporabili sistem znan pod imenom adsorpcijska kromatografija na trdni fazi (Flash Chromatography, FC). Pri tej tehniki je pretok pospešen z uporabo šibkega podtlaka (približno 20 mm Hg), ki ga s vodno črpalko ustvarimo pod samo kolono (slika 12).

Slika 12. Prikaz poteka ločevanja različno polarnih snovi z adsorpcijsko kromatografijo (Flash Chromatography, FC). Levo je prikazan postopek ločevanja snovi na silikatnem gelu, desno pa kromatografska kolona z na vodno črpalko povezano presesalno nučo, ki omogoča hitrejši pretok. Za boljšo ločitev mešanice moramo upoštevati tudi količino stacionarne faze v sorazmerju s količino vzorca, dimenzije kolone (daljše in ožje ločujejo bolje od širših in krajših) ter enakomerno porazdelitev mobilne faze po stacionarni fazi.


3.2.4 Visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC) Instrumentalna tehnika, osnovana na principu kolonske tekočinske kromatografije, je visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC; ang. High Performance Liquid Chromatography). Glavni napredek pri tej tehniki predstavljajo črpalke, ki ustvarijo velike delovne pritiske, kovinske kolone in odporni nosilci. Tehniko zato odlikuje velika ločljivost ter občutljivost. Kot je prikazano na sliki 13, ločitev poteka tako, da črpalka črpa mobilno fazo in jo skupaj z injiciranim vzorcem vodi skozi kolono, kjer se vzorec loči na posamezne komponente na podlagi kromatografskih principov. Dalje prihaja skozi detektor, ki snovi zazna kot UV/VIS spektrofotometer. Detekcija poteka pri določeni valovni dolžini in jo nastavimo glede na lastnosti ločevane snovi. Detektor zbira podatke in jih prikaže v obliki kromatograma. To je diagram, kjer so na abscisni osi retencijski časi v minutah, na ordinatni osi pa višina vrhov, ki je sorazmerna koncentraciji posamezne komponente izprane ob določenem času.

Slika 13. Shematski prikaz sistema za visokotlačno tekočinsko kromatografijo (HPLC).

Ta instrumentalna tehnika nam omogoča delo tako v preparativne, kot v analitske namene. Pri analitskih pogojih pridobivamo informacije kvalitativnega značaja; z manjšimi kolonami, z manjšim pretoki (1 ml/min), ki so manj zmogljive, a bolj natančne. Na podlagi optimiziranih analitskih pogojev ločujemo preparativno - povečana kolona, večja procesivnost in pretok (5 ml/min). Tako dobimo večje količine snovi. Z upoštevanjem posamezmega vrha, ki ga razberemo s kromatograma, lahko ulovimo frakcijo čimbolj čiste snovi. Tehnika je široko uporabna v izolaciji naravnih produktov, v primeru preučevanih sarainov pa nam ni bila v veliko pomoč zaradi njihove posebne kemijske strukture, kot bo razloženo v diskusiji. Pri svojem delu smo uporabljali HPLC sistem Merck Hitachi L-3000, L- 6200 intelligent črpalko in Jasco UV-975 Intelligent UV/Vis detektor, Merck Hitachi, Nemčija.


3.3 INSTRUMENTALNE TEHNIKE ZA DOLOČANJE MASE IN STRUKTURE SNOVI

3.3.1 Masna spektrometrija Masna spektrometrija (MS) je zelo občutjiva in natančna tehnika, ki nam omogoča določiti molekulsko maso snovi vse do 200 kDa. Z razvojem znanosti tehnike MS postajajo vse občutljivejše in širše uporabne, še posebej ko so združene z ločitvenimi kromatografijami. Takšni so na primer sistemi plinska kromatografija/masna spektrometrija (GC/MS) in tekočinska kromatografija/masna spektrometrija (LC/MS). Masna spektrometrija ima široko območje uporabe: v biotehnologiji (analiza proteinov, peptidov in oligonukleotidov), v farmaciji (odkrivanje zdravil), v klinični medicini (analize hemoglobina, testiranje zdravil), v okoljskih znanostih (kontrola kvalitete vode, kontaminacija hrane) in v geologiji (sestava nafte). V biokemiji naravnih produktov pa nam s točno molekulsko maso pomaga določiti čistost vzorca in potrditi predvidevano strukturo. Masni spektrometer je sestavljen iz treh osnovnih delov: ionizacijskega vira, analizatorja in detektorja. Analizirano snov vodimo najprej na preko ionizacijskega vira, kjer nevtralne molekule postanejo nabite in jih lahko usmerjamo v elektromagnetnem polju na analizator. Tu se ločijo na podlagi razmerja masa/naboj (m/z). Detektor zazna signal in ga posreduje podatkovnemu sistem, ki podatke m/z skupaj s podatki o relativni količni prikaže v obliki m/z spektra. Vrhovi so ozki, njihova višina ustreza intenzivnosti signala, ta pa je odvisna od števila delcev v vzorcu in deleža delcev, ki se ionizirajo. Razmerje posameznih komponent v mešanici izražamo v procentih, kjer 100 % predstavlja tista komponenta, ki jo je največ. Pod vrhom na abscisni osi odčitamo molekulsko maso, skupaj z maso protona, ki se na molekulo pripne ob ionizaciji. Zato moramo od odčitane vrednosti odšteti 1. Spekter čiste snovi je lahko sestavljen iz več vrhov, če je ionizacija vzorca bolj groba (npr. Electron Impact Mass Spectrometry, EI-MS, masna spektrometrija z ionizacijo z elektroni) in molekule fragmentirajo, oziroma samo enega vrha na molekulo, če ionizacija poteka pod milejšimi pogoji (npr. Electrospray Mass Spectrometry, ESI-MS).

3.3.1.1 Masna spektrometrija z ionizacijo z elektrorazprševanjem (ESI-MS) Vzorec raztopimo v hlapnem topilu in s potisnim plinom v visoki napetosti razpršimo v prostor, da nastanejo površinsko nabiti aerosoli, ki se pod vplivom elektromagnetnega polja razpršijo (slika 14). Z vpihavanjem segretega inertnega plina topilo popolnoma odparimo, torej izginejo kohezivne sile topila in ostanejo gole nabite molekule t.j. psevdomolekularni ioni. Skozi vzorčevalno režo jih z magnetnimi lečami usmerimo v analizator, ki deluje v visokem podtlaku.


Slika 14. Potek ionizacije z elektrorazprševanjem.

Pri tej nalogi smo ESI-MS spektre posneli z masnim spektrometrom Bruker Esquire-LCTM (Bruckner Daltonik GmbH, Nemčija), opremljenim z elektrorazprševalnikom (slika 15).

3.3.1.2 Tandemska masna spektrometrija (MS/MS) Uporabljamo jo za pridobivanje informacij o strukturi snovi tako, da fragmentiramo specifično molekulo znotraj masnega spektrometra na ione fragmentov. Iz molekulskih mas fragmentov sklepamo na intaktno molekulo. Poleg tega, tehnika omogoča tudi zaznavanje specifične spojine v kompleksni mešanici na podlagi značilnih fragmentov ali vzorcev fragmentacije. Posebnost instrumenta je, da ima dva analizatorja. Ker težji delci potujejo počasneje od lažjih, delci z enako molekulsko maso pa enako hitro, le ti pridejo hkrati na cilj. Tako s prvim analizatorjem ločimo delce z enako molekusko maso. Izbrani intaktni molekulski ioni gredo skozi kolizijsko celico, kjer jih bombardirajo molekule inertnega plina. Nastanejo fragmenti, ki jih z drugim analizatorjem razvrstimo in jih zaznamo na detektorju. Na podlagi molekulskih mas sklepamo na zgradbo izvornega molekulskega iona.

3.3.1.3 Masna spektrometrija z ionizacijo z elektroni (Electron Impact Mass Spectrometry; EI-MS) Od ESI-MS se EI-MS razlikuje predvsem v načinu ionizacije. Vzorec se ionizira po odparevenju topila pri visoki napetosti tako, da snop elektronov izbije iz vzorčne molekule elektron in nastane molekulski ion, ki je po svoji naravi radikal. Ker je energija elektronskega snopa velika, poleg ionizacije energetski višek povzroči tudi fragmentacijo. Kakšni in koliko fragmentov bo nastalo je poleg energije elektronov odvisno še od temperature ionizacijskega vira in primarne strukture.


Slika 15. LC-ESI-MS instrument - HPLC HP/Agilent, združen s spektrometrom (Bruker Esquire-LCTM , Nemčija) v Laboratoriju za bioorgansko kemijo, Univerza v Trentu (Italija).

3.3.1.4 Masna spektrometrija visoke ločljivosti (high resolution MS) Povečana ločljivost, ki jo dosežemo s magnetnimi ali elektrostatskimi analizatorji, nam omogoči določiti grobo formulo snovi. Navadna MS nam zanesljivo da le vrednost nominalne mase, kar pomeni celo število brez decimalnih mest. Za ilustracijo lahko navedemo primer, ko ima fragment nominalno maso 44. Temu ustrezajo točne mase spojin CS (43.97207), CO2 (43.98980) in C3H8 (44.06264). Vendar na podlagi spektra visoke ločljivosti določimo maso 44.06276 in se odločimo za po masi najbližjo spojino, to je v našem primeru propan. Ko določamo točne mase spojin, upoštevamo vsoto mase protonov in nevtronov. Taka masa se razlikuje od atomske mase, saj ne upoštevamo prispevka deležev drugih izotopov. Pri svojem delu smo za EI-MS spektrometrijo uporabljali Kratos-MS80 mass spectrometer (Kratos Ltd., Manchester, United Kingdom) z računalniško programsko podporo, prirejeno v domačem laboratoriju (slika 15).

3.3.2 Uvod v spektroskopijo Molekulske vezi nihajo z različnimi frekvencami (slika 16), odvisnimi od mase atomov, ki sta povezana, in od tipa vezi. Vsak tip vezi ima specifične frekvence, ki povzročijo njeno nihanje. Po zakonih kvantne fizike te frekvence ustrezajo osnovnemu in vzbujenemu stanju. Spremembo frekvence vezi lahko povzroči absorbcija svetlobne energije določene valovne dolžine. Energija svetlobe (ΔE) se mora natančno ujemati z razliko energije med osnovnim (E0) in vzbujenim stanjem (E1) (glej formulo1, kjer je h = Planckova konstanta, c= svetlobna hitrost, in λ = valovna dolžina sevanja).

ΔE = E1 - E0 = h c / λ …(1)


Slika 16. Elektromagnetni spekter.

3.3.3 Jedrska magnetna resonanca (NMR) Jedrska magnetna resonanca je fizikalni pojav, osnovan na kvantno mehanskih magnetnih lastnostih posameznih jeder. Izkoriščamo ga pri skupini meritvenih metod za preučevanje strukture molekul. Nekatera jedra (v organskih študijah so pomembna predvsem 1H in 13C, lahko pa opazujemo tudi izotope drugih atomov kot so 15N ali 31P) imajo magnetni spinski moment. Te lastnosti povzročijo, da delci interagirajo z zunanjim magnetnim poljem. Tako lahko jedro v močnem zunanjem magnetnem polju zavzame več energijskih stanj: osnovno in vzbujena stanja.

Vzbujanju sledi relaksacija in absorbirana energija se sprošča v okolico. Čas, potreben za relaksacijo merimo in s Fourierovo transformacijo preračunamo v signal v NMR spektru. Kakšen bo kemijski odmik posameznega jedra je odvisno od spina jedra samega, močnega zunanjega elektromagnetnega polja, ki ga ustvari instrument in, kar je najpomembnejše, okolja, to je sosednjih jeder. S pomočjo primerjave z drugimi signali je določen standarden kemijski odmik, kar nam omogoča iz spektra prepoznati glavne zančilnosti kemijske strukture preiskovane spojine. Okolje protona vpliva tudi na obliko signala, ki lahko zavzame obliko singleta (enojni pik), dubleta (dvojni pik), tripleta (trojni pik), itd. Gre za pojav spinskega sklapljanja, ko magnetno polje, ki ga ustvari spin protonskega jedra zazna polja sosednjih jeder vodikov in zaradi njihovega vpliva nekoliko spremeni obašanje v zunanjem elektromagnetnem polju. Med posameznimi vrhovi v signalu izmerimo značilno sklopitveno konstanto, ki pa je povsem neodvisna od jakosti zunajega polja in zato je kot referenca pri meritvah ne različnih instrumentih zelo pomembna.


Slika 17. NMR spektrometer NMR v laboratoriju za bioorgansko kemijo, Univerza v Trentu (Italija).

NMR spekter je prikazan kot diagram, na katerem na abscisno os nanašamo kemijski odmik. Na desnem robu je odmik 0 ppm, kar predstavlja frekvenco standarda, to je tetrametilsilan (TMS). Frekvenca, pri kateri se jedro vzbudi, je odvisna od magnetnega polja merilnega instrumenta, od atoma samega in okolja - atomov, ki ga obdajajo in z njim tvorijo vezi. Bolj elektronegativni kot so sosednji atomi, večji je kemijski odmik. Iz spektra lahko določimo tudi relativno število jeder (torej atomov) z enakim kemijskim odmikom. Z integracijo dveh signalov (računalniški program nam izračuna ploščino, ki ga oklepata krivulja spektra in abscisna os) lahko spoznamo v kakšnem razmerju sta ta dva tipa jeder prisotna v spojini. Največkrat merimo spektra 1H in 13C atomov. 1H spekter nam predstavi različne tipe H jeder in tako lahko sklepamo na prisotnost funkcionalnih skupin. 13C je v naravi veliko redkejši od 1H, saj predstavlja le 1.1% celotnega ogljika v molekuli. Zato je tudi količina vzorca, potrebnega za analizo nekoliko večja. 13C kot spekter nam predstavi vezi med ogljikovmi atomi. Lahko uporabljamo tudi dvodimezionalno zajemanje podatkov. Od teh tehnik smo pri našem delu uporabljali tehniko HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) in HMBC (Heteronuclear Multiple Bond).


HSQC poveže spekter protonskih jeder s spektrom ogljikovih jeder, na katere so neposredno vezani. HMBC pa prikazuje inerakcije med bolj oddaljenimi atomi, to so protoni in ogljikovi atomi dve ali tri C-C vezi daleč. Dvodimenzionalni COSY (COrrelation SpectroscopY), nam omogoča določiti vezi v molekuli z določanjem interakcij protonov z bližnjimi protonskimi jedri (sklopitev, oz. coupling). Tehniko lahko dopolnimo z natančno analizo rezultatov (spin-spin sklopitev) pri visokih ločljivostih.

Pri svojem delu smo uporabljali NMR spektrometer Avance 400 Bruker spectrometer (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Nemčija) na sliki 17.

3.3.4 Infrardeča spektrometrija (Fourier transformed infrared spectrometry, FTIR ) Infrardeča spektroskopija je kemijska analitska tehnika, s katero merimo intenzivnost absorpcije infrardeče svetlobe v odvisnosti od valovne dolžine svetlobe. FTIR zaznava predvsem vibracije, značilne za kemijske funkcionalne skupine v vzorcu. Interakcija snovi z infrardečo svetlobo povzroči različne vrste gibanj molekulskih vezi: simetrično in nesimetrično raztezanje in krčenje vezi, gugajoče upogibanje in upogibanje, podobno gibanju škarij. Kemijske funkcionalne skupine posledično absorbirajo infrardečo svetlobo pri različnih valovnih dolžinah, ne glede na ostali del molekule. Na primer, razteg karbonilne vezi C=O se pojavi pri frekvenci 1700 cm-1 pri različnih molekulah. Tako lahko sklepamo na vsebnost funkcionalnih skupin v celotnem vzorcu. Prednost je tudi to, da ostali pogoji, kot so temperatura, pritisk, vzorčenje in spremembe v ostalih delih molekule ne vplivajo na spremembo frekvence določene funkcionalne skupine. Glavne komponente modernih infrardečih spektrofotometrov so: vir, ki s segreto žico proizvaja infrardeče (IR) žarke, interferometer, ki uravnava intenzivnost IR svetlobe in detektor, ki zbira svetlobo, odbito od vzorca. Interferometer omogoča, da s spektrometrom merimo pri vseh optičnih frekvencah in sočasno uravnava intenzivnost posameznih frekvenc že pred merjenjem. Podatki, ki jih dobimo s tem posopkom se imenujejo interferogramski signali, ki pa jih ni mogoče direktno interpretirati. Z matematično tehniko Furierove transformacije jih pretvorimo v infrardeči spekter, ki je prikazan kot diagram absorbance (ali pa prepustnosti) v odvisnosti od valovnega števila. Pri FTIR meritvah vedno posnamemo dva spektra. Prvi je brez vzorca in predstavlja spekter ozadja, sledi še meritev z vzorcem. Nato interferograma odštejemo. Tako zmanjšamo instrumentalno napako in napako, ki nastaja zaradi sprememb okolja. Tehniko FTIR lahko, razen za analitsko določanje funkcionalnih skupin uporabljamo tudi za kvantitativne meritve komponent v nepoznanih mešanicah. Uporabna je v analizi trdnih, tekočih in plinskih faz. Poleg tega so FTIR instrumenti vse pogosteje računalniško podprti in zato hitrejši in občutljivejši od starejših različic, kar odpira nove možnosti uporabe. Instrument, ki smo ga uporabili pri tej nalogi, je FTIR Equinox 55 Bruker (Nemčija).


3.3.5 Absorpcijska spektroskopija Absorpcijska spektrometrija se ukvarja predvsem s pojavi absorpcije svetlobnega sevanja v območju vidnega polja (350 – 700 nm) in bližnjega ultravijoličnega spektra (200 – 350 nm). Prvo imenujemo VIS (ang. visible) spektroskopija, drugo pa UV (ang. ultraviolet) spektroskopija, vendar ju navadno ne ločujemo, saj uporabljata iste fizikalne osnove, razlikujeta se le v območju meritve. Zato se je uveljavil skupni izraz UV/VIS spektroskopija. Tovrstna absorpcija svetlobe v molekuli povzroči energetski prehod elektronov. Organske molekule imajo tri vrste valenčnih elektronov: σ-elektrone molekulskega skeleta, π-elektrone dvojnih ali trojnih vezi in nevezane (proste) n-elektronske pare na kisikovem, dušikovem ali žveplovem atomu. Te elektrone lahko s svetlobno energijo (160 – 8000 kJ/mol) spravimo na višji energetski nivo – v prosto protivezno orbitalo z višjo energijo. Energetske razlike med vezno in protivezno orbitalo se razlikujejo glede na vrsto valenčnega atoma. Največ energije je potrebno, da vzbudimo σ-elektrone (valovna dolžina sevanja (λ) je 110 nm – 135 nm), sledijo π-elektroni z λ 160 nm – 225 nm, najmanj pa n-nevezni elektroni in sicer je λ daljša od 285 nm. Na primer za vzbujenje π-elektrona iz etena je potrebno sevanje z valovno dolžino 180 nm, medtem ko je za vzbujenje σ-elektrona alifatske verige potrebno energetsko močnejše sevanje (120 nm). Če so torej v molekuli prisotne dvojne vezi, opazimo delokalizacijo elektronov z energetskim zmanjšanjem med vzbujenim in nevzbujenim stanjem. Da se prehod zgodi, je potrebno bistveno manj energije, meritve spektra preidejo iz ultravijoličnega območja v območje vidne svetlobe. Tako lahko ločimo spojine s π-elektroni ali prostim elektronskem parom na dušiku ali kisiku od tistih spojin, ki le-teh nimajo. Vse organske molekule absorbirajo v območju UV svetlobe, absobcija v vidnem polju svetlobe pa obsega predvsem molekule s številnimi konjugiranimi π-vezmi. Tak primer so karotenoidi, ki močno absorbirajo v območju vidnega polja, ker imajo v svoji stukturi vsaj 10 dvojnih konjugiranih vezi med ogljiki. Različne dele molekul, ki absorbirajo svetlobo z valovno dolžino med 180 in 1000 nm, imenujemo tudi kromofori. Pri spektroskopskih meritvah se uporabljajo monokromatski žarki - svetloba niha z eno samo frekvenco. Dejansko pa je težavno pridobiti žarke s to lastnostjo, zato se uporablja svetloba z zelo zoženim spektrom oziroma skoraj monokromatski žarki. Absorbcijo merimo tako, da žarek iz vira svetlobe (navadno volframova pri VIS ali vodikova devterijeva žarnica pri UV spektroskopiji) spustimo skozi selektor valovne dolžine (npr. monokromator) in nato skozi kiveto z vzorcem. Prepuščeno svetlobo vodimo na fotodetektor, ki izmeri intenziteto prepuščene svetlobe (I), ki je manjša od intenzitete vpadne svetlobe (I0). Iz teh dveh podatkov nato izračunamo prepustnost (T; ang. transmitance) po formuli 2, ki nam pove kolikšen del vpadne svetlobe je prešel vzorec, ne da bi se absorbiral. Vrednosti se gibajo med 0 in 1, lahko pa jih izražamo tudi v procentih.

T = I / I0 ...(2)


Bolj pogosto pa absorbirano svetlobo izražamo kot absorbanco (A), ki jo računamo po formuli 3.

...(3)

Po Lambert-Beer-ovem zakonu (formula 4) lahko iz absorbance izračunamo koncentracijo v analiziranem vzorcu. Molarni ekstinkcijski koeficient nam pove, kakšna je vrednost absorbance pri 1 M koncentraciji snovi in pri debelini kivete 1 cm. Njegova vrednost je karakteristična za posamezni kromofor ter je odvisna od vrste vezanih substituent in verjetnosti prehodov elektronov v vzbujeno stanje.

…(4)

Lambert-Beerov zakon; kjer je A = absorbanca, ε = molarni ekstinkcijski koeficient , c = molarna koncentracija, d = debelina kivete, oz. Dolžina optične poti, ki jo svetloba prepotuje pri potovanju skozi vzorec. Vendar Lambert-Beerov zakon velja le za dovolj razredčene raztopine, dokler je zveza med koncentracijo vzorca in njegovo absorbanco še linearna. Instrument za merjenje absorpcije se imenuje spektrofotometer. Najpogostejši sta dve vrsti: enožarkovni in dvožarkovni spektrofotometer. Enožarkovni je zgrajen enostavno in se uporablja za kvantitativne analize manjšega števila vzorcev pri znani valovni dolžini. Dvožarkovni spektrofotometer je sestavljen tako (glej tudi sliko 18), da se žarek razdeli na dva žarka enake intenzivnosti in valovne dolžine. Prvi potuje skozi vzorec, drugi pa skozi slepo probo, kjer izmerimo prispevek topila k absorpciji vzorca. Enako meritev opravimo tudi pri enožarkovnem spektrofotometru, le da v dveh ločenih meritvah. Prav zaradi te možnosti je dvožarkovni spektofotometer ugodna rešitev, ko merimo večje število vzorcev ali pri spreminjajoči se valovni dolžini, ko hočemo posneti celotni absorpcijski spekter.

Slika 18. Shema dvožarkovnega spektrofotometra.

UV spektrofotometer, ki smo ga uporabili pri tej nalogi, je Perkin-Elmer Lambda-3 (ZDA).


3.3.6 Optična aktivnost Optično aktivna snov ima sposobnost rotacije ravnine polarizirane svetlobe. V paru optično aktivnih enantiomer bo vsak enantiomer vrtel ravnino za enako število stopinj, vendar v nasprotno smer. Zato bo racematna zmes, ki vsebuje enako količino obeh enantiomer, dala vtis optično neaktivne snovi, saj se ravnina polarizirane svetlobe ne bo zasukala.

Slika 19. Merjenje optične aktivnosti s polarimetrom

Kot rotacije merimo z napravo, imenovano polarimeter (slika 19). Preiskovano snov raztopimo v topilu do znane koncentracije (c, enota je g/ml). Nalijemo jo v analizno cev znane dolžine (v dm) in pomerimo opazovan kot (θ). S pomočjo formule 5 izračunamo za našo zmes specifičen kot rotacije.

[α] = θ / ( c * l) …(5)

Specifičen kot rotacije je odvisen tudi od valovne dolžine polarizirane svetlobe. Za svetlobni vir uporabljamo natrijevo žarnico in izmerjeno valovno dolžino označimo z [α]D. Pri delu smo uporabili polarimeter Jasco-DIP-181 (Japonska).

3.4 TESTI ZA DOLOČANJE BIOLOŠKE AKTIVNOSTI

3.4.1 Določanje protibakterijske aktivnosti z difuzijskim testom na agarju Protibakterijsko aktivnost izoliranih sarainov smo testirali s standardnim difuzijskim testom na agarju. Kot testne seve smo uporabili pet po Gramu pozitivnih (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus foecalis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis) in pet po Gramu negativnih bakterijskih sevov (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium). Vsi sevi so v zbirki laboratorija za mikrobiologijo Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Omenjene bakterije smo sterilno nacepili v 100 ml erlenmajerice, ki so vsebovale po 10 ml avtoklaviranega tekočega gojišča (Luria broth). Gojišče smo predhodno pripravili tako, da smo v 100 ml deionizirane vode raztopili 2.5 g gojišča Luria broth (Sigma, Zružene države Amerike) in raztopino razdelili v erlenmajerice. Erlenmajerice z nacepljenim gojiščem smo preko noči stresali pri 250 obratov/minuto in 37°C. Naslednji dan smo določili število bakterij tako, da smo 1 ml gojišča sterilno prenesli v plastično kiveto in na dvožarkovnem spektrofotometru (Shimadzu, Japonska) izmerili optično gostoto pri 600 nm. Kot slepi poskus


smo uporabili sterilno Luria Broth tekoče gojišče. Število bakterij smo določili iz optične gostote raztopine s pomočjo standardiziranih umeritvenih krivulj za ustrezne bakterijske seve. Sledila je priprava agarja, ki smo ga naredili z raztapljanjem in mešanjem 25 g gojišča Luria Broth in 15 g agarja (Merck, Nemčija) v 1 litru deionizirane vode. Po 200 ml tako pripravljenega medija smo nalili v 500 ml erlenmajerice, jih pokrili z aluminijasto folijo in avtoklavirali. Še vroče smo prenesli na vodno kopel segreto na 45°C ter počakali 45 min, da se je medij ohladil na isto temperaturo. Medtem smo preračunali volumen tekoče bakterijske kulture, ki ga bomo dodali v medij, tako da bo končna koncentracija bakterijskih kolonij 5x105 v 200 ml gojišča (5x104 na eno ploščo). Preračunani volumen smo sterilno prenesli v ohlajeni medij s temperaturo 42°C, dobro premešali in po 20 ml hitro razlili v prej označene Petrijeve plošče. Na ta način smo pripravili po 10 plošč za en bakterijski sev. Plošče smo do uporabe hranili pri 4°C. Pred uporabo smo s pomočjo steriliziranega plutovrta v vsaki plošči zvrtali 1-8 lukenj premera 1 cm. Za testiranje antibiotične aktivnosti smo v vsako luknjo dodali po 100 μl ustrezne raztopine spojin sarainov. Testirali smo tudi topila, v katerih so bili raztopljeni saraini (etanol in dimetil sulfoksid – DMSO pri vzorcu 6). Po 24-urni inkubaciji pri 37°C smo odčitali polmere inhibicijskih con, ki so se pojavili okrog lukenj. Aktivne testne spojine smo redčili naprej in testirali na isti način dokler inhibicijska cona ni izginila. Na ta način smo določili minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK) za vsako posamezno spojino. Zaradi nizkega inhibitornega učinka na Gram negativne bakterije in omejene količine sarainov smo MIK določili samo Gram pozitivnim sevom Staphylococcus aures, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus foecalis, Bacillus subtilis.

3.4.2 Hemolitični test Eritrocite smo s centrifugiranjem izolirali iz sveže goveje krvi, ki smo ji pri odvzemu dodali citrat, da ni prišlo do strjevanja. Eritrocite smo trikrat sprali s fiziološko raztopino in uporabili za testiranje ali pa spravili v Alseverjevem konzervansu v hladilnik. Tako pripravljene eritrocite lahko uporabljamo dokler se supernatant ne pobarva rdeče zaradi hemolize. Pred uporabo smo konzervirane eritrocite vedno dvakrat sprali s fiziološko raztopino. Za testiranje smo jih resuspendirali v pufru za eritrocite (raztopina 0.13 M NaCl in 0.02 M TRIS.HCl, pH 7.4). Pripravili smo suspenzijo eritrocitov, ki je pri 650 nm imela navidezno absorbcijo 0.5. Hemolitično aktivnost smo zasledovali s pomočjo čitalca mikrotitrnih plošč (Dynex Technologies, ZDA), ki nam omogoča hkratno zasledovanje 96 časovnih potekov. Mikrotitrno ploščo smo napolnili s po 50 μl eritrocitnega pufra. V skrajne desne vdolbine smo dodali še po 137.5 μl eritrocitnega pufra in 62.5 μl testnih spojin (vzorce 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 1A in 1B izoliranih mešanic in čistih sarainov) s koncentracijo 10 mg/ml. Iz skrajne desne vdolbine smo prenašali po 200 μl spojine proti levi s tem, da v zadnjo skrajno levo vdolbino nismo prenesli ničesar. Nato smo v jamice mikrotitrne ploščice dodali še 50 μl eritrocitnega pufra. Redčili smo torej v razmerju 4:5 od najvišje končne koncentracije 0.6 mg/ml do 0.15 25 mg/ml. Po končanem redčenju smo v vsako vdolbinico dodali po 100 μl eritrocitov in pričeli z meritvami. Hemolizo smo opazovali kot padec absorpcije pri 650 nm. Pri vzorcih, ki


so bili aktivni, smo odčitali še polovični čas hemolize (t50), oz. čas pri katerem absorpcija pade na polovico svoje začetne vrednosti. Hemolizo smo zasledovali 20 minut pri 25°C.

3.4.3 Test inhibicije acetilholinesteraze Aktivnost acetilholinesteraze (AChE) in njeno inhibicijo s testnimi spojinami smo zasledovali z Ellmanovo metodo (Ellman in sod., 1961) s pomočjo čitalca mikrotitrnih plošč (Dynex Technologies, ZDA). Kot encim smo uporabili AChE iz električne jegulje (Sigma, ZDA), ki smo jo raztopili v 100 mM fosfatnem pufru pH 7.3 v koncentraciji 500 encimskih enot (EE)/ml. Mikrotitrno ploščo smo napolnili s po 100 μl Ellmanovega reagenta (raztopina 5,5-ditiobis 2-nitrobenzojske kisline (91 mg) in natrijevega hidrogen karbonata (37.5 mg) v 25 mM fosfatnem pufru pH 7.0). V skrajne desne vdolbine smo dodali še po 25 μl in 50 μl Ellmanovega reagenta (v prvo vrstico nismo dodajali Ellmanovega reagent) in po 100 μl, 75 μl in 50 μl testnih spojin (vzorce 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 1A in 1B izoliranih mešanic in čistih sarainov) s koncentracijo 10 mg/ml. Za kontrolo inhibitornih učinkov topila smo uporabili 100 μl, 75 μl in 50 μl etanola. Iz skrajne desne vdolbine smo prenašali po 100 μl spojin proti levi s tem, da v zadnjo skrajno levo nismo prenesli ničesar. Redčili smo torej v razmerju 1:2 od najvišje končne koncentracije 1 mg/ml do 0 mg/ml. Po končanem redčenju smo v vsako vdolbinico dodali po 50 μl substrata (2, 1 ali 0.5 mM acetiltioholin jodida) ter na koncu še 50 μl encima in pričeli z meritvami. Končna koncentracija encima v reakcijski mešanici je bila 6.25 EE/ml. Reakcijo smo zasledovali 5 minut pri 412 nm in 25 °C.


4 REZULTATI

4.1 IZOLACIJA IN ČIŠČENJE SARAINOV

4.1.1 Ekstrakcija

Liofilizat spužve Reniera sarai (vzorec A, suha masa 108,8 g) smo ekstrahirali z metanolom (2 x 700 ml). Material smo dodatno razbili s 15-minutno sonikacijo in 10 minut centifugirali pri 3000 obratih na minuto (centrifuga, 4227, ALC, Italija). Ob prenasičenju se je supernatant ločil na dve fazi: na precipitat (le v vodi topno fazo) in na v metanolu topno fazo (vzorec A/MeOH). Slednjo smo koncentrirali, dodali diklorometan in dvakrat sprali soli z vodo v liju ločniku. Ekstrakt se je ločil na 2 fazi: na fazo, topno v diklorometanu (A/MeOH/CH2Cl2) in na fazo, topno v vodi.

Liofilizat B smo obdelali na podoben način. Dve veliki žlici liofilizirane spužve smo zmleli v terilnici, dodali metanol (100 ml) in tekočo fazo sprali v liju ločniku v diklorometanu in vodi. Nepolarno fazo smo nato analizirali z metodo masne spektrometrije in primerjali s spektrom, pridobljenim z vzorcem A.

Oba ekstrakta smo primerjali s TLC in z masno spektrometrijo, kjer smo posneli ESI-MS spekter direktnega vbrizga. Kot je prikazano na sliki 20 se vsebnost sarainov in njihova relativna količina med obema ekstraktoma praktično ne razlikujeta. Zato smo postopek izolacije nadaljevali samo z vzorcem A.

Slika 20. ESI-MS spekter vzorca A (levo) in B (desno).Vzorca sta bila ekstrahirana po enakem postopku iz dveh organizmov spužev Reniera sarai nabrani na istem mestu v različnih letih: A (2002) in B (2003).


4.1.2 Kromatografsko čiščenje

4.1.2.1 Ločevanje z adsorpcijsko kromatografijo na trdni fazi

Izolacijo smo nadaljevali s kromatografskimi metodami, predvsem z adsorpcijsko kromatografijo na trdni fazi. 2,5 g v diklorometanu topnega ekstrakta smo nanesli na kolono, napolnjeno s silikatnim gelom (Merck LiChoprep Si60, 15 – 25 µm) in spirali gradientno z mešanico CH2Cl2 : CH3OH, v kateri smo postopno povečevali delež CH3OH od 5 do 100%. Sprane frakcije smo koncentrirali z odparevanjem topila z uporabo vodne vakuumske črpalke (Büchi Waterbath B-480) v vodni kopeli ogreti na ne previsoko temperaturo (približno 40°C), ker se s tem izognemo morebitni razgradnji naravnih produktov.

Na začetku smo s pomočjo TLC na različnih ploščah in z uporabo različnih mešanic mobilnih faz iskali najbolj primerno stacionarno fazo za ločevanje sarainov. Uporabili smo naslednje stacionarne faze (TLC plošče) in mobilne faze:

− plošče Merck RP-18 (mobilna faza 100% CH3OH)

− plošče Merck CN F245s (mobilna faza 100% CH3OH, CH2Cl2/CH3OH 9:1 ali heksan/izopropanol 1:1, 1:9)

− plošče Merck DIOL F245s (mobilna faza 100% CH3OH, CH3OH/H2O 9:1, CH2Cl2 /CH3OH 9:1,95:5 ali heksan/izopropanol 1:1)

− plošče Merck NH2 F245s (mobilna faza 100% CH3OH, CH3OH/H2O 9:1 ali CH2Cl2 /CH3OH 9:1)

Na temelju pridobljenih kromatogramov smo se odločili za stacionarno fazo DIOL (Merck LiChroprep DIOL F245s, 25 – 40 µm) namesto silikatnega gela, ki so ga uporabljali drugi raziskovalci sarainov (Cimino in sod. 1986, Cimino in sod. 1989a, Cimino in sod. 1989b, Guo in sod. 1996) . Prav tako smo zamenjali mobilno fazo in izbrali CH2Cl2 namesto CHCl3, da bi preprečili protonacijo snovi.

Izboljšana je bila tudi vizualizacija TLC plošč z uporabo jodovih par namesto veliko bolj uporabljanega cerijevega sulfata v kisli raztopini (slika 21).

Slika 21. Različna načina vizualizacije: levo pooglenitev s cerijevim sulfatom v kisli raztopini, desno z jodovimi

parami obarvana TLC plošča. Nanju so naneseni enaki vzorci (8 DIOL 0, 2, 12 in 14).


Izolacija je potekala kot je nakazano na sliki 22. Šesto (CH2Cl2/CH3OH, 6:4) in osmo (CH2Cl2/CH3OH, 4:6) frakcijo pri kromatografiji na silikatni trdni fazi smo ločevali dalje s kolonsko adsorbcijsko kromatografijo na fazi DIOL na dveh ločenih kolonah. Pri 6. frakciji smo začeli pri razmerju CH2Cl2/CH3OH, 99:1 in povečevali delež metanola. Tako smo pridobili 13,0 mg saraina 1 (6 DIOL 2) pri CH2Cl2 (100%), 2,0 mg saraina 3 (6 DIOL 5) pri CH2Cl2 /CH3OH (95:5) in 1,9 mg še nepoimenovanga saraina z molsko maso 524 g/mol (6 DIOL 13) pri CH3OH (100%).

Iz frakcije 8 smo na stacionarni fazi DIOL ločili 8 DIOL 2, ki vsebuje mešanico sarainov 1,2 in 3. Frakcijo 8 DIOL 3 pa smo po enakem postopku ločili na 1,3 mg saraina 3 (8 DIOL 3/A), 7,8 mg izosaraina 1 (8 DIOL 3/3), 4,7 mg (8 DIOL 3/5) in 8,3 mg (8 DIOL 3/6) saraina 3 še preden smo začeli povečevati vsebnost CH3OH, torej pri začetnem razmerju CH2Cl2 /CH3OH (99:1).

Slika 22. Shematični prikaz poteka izolacije sarainov. A/MeOH/CH2Cl2 = v diklorometanu topen del metanolnega ekstrakta spužve R. sarai. fr.6 in fr.8 = šesta in osma frakcija sprana iz kolone s silikatno trdno fazo, 6 DIOL 2 = druga frakcija kolonske adsorbcijske kromatografije na fazi DIOL, izhodna ločevana snov je bila fr.6, (podobno velja za oznake 6 DIOL 5, 6 DIOL 13; 8 DIOL 2, RP 22 in RP 23 = 22. in 23. frakcija kolonske adsorbcijske kromatografije na fazi RP-18, izhodna ločevana snov je bila fr.8).

Mešanico sarainov A, B in C vsebujejo tudi frakcije 8 DIOL 12 (CH2Cl2/CH3OH, 93:7), 8 DIOL 16 (CH2Cl2/CH3OH, 91:9) in 8 DIOL 17 (CH2Cl2/CH3OH, 9:1), ter 8 DIOL 14/4 (saraina A in C) (CH2Cl2 /CH3OH, 9:1). Do čistega saraina C nam je uspelo priti na fazi RP


(Merck RP-18, 40 - 63 µm) s H2O/ CH3OH, 3:7 do samega CH3OH, nato pa smo povečevali delež CH2Cl2. Šele v kasnejših fazah (8 RP 22 in 8 RP 23; CH2Cl2, 100% ) smo izolirali 1,0 mg in 2,5 mg saraina C.

Še nepoimenovano spojino z molsko maso 442 smo izolirali iz frakcije 8 DIOL 14/3 na stacionarni fazi DIOL. Iz kolone se je sprala z mobilno fazo CH2Cl2 /CH3OH (9:1). Enako spojino smo izolirali tudi iz frakcije 8 DIOL 13 z eluentom CH2Cl2 /CH3OH (97:3) pri čemer smo sprali frakciji 8 DIOL 13/9 (0,9 mg) in 8 DIOL 13/10 (1,4 mg).

Preglednica 2. Masa snovi v izoliranih frakcijah (iz metanolnega ekstrakta A, spužva Reniera sarai)

Spojina frakcija Masa snovi (mg)

Saraini A, B in C 8 DIOL 12 33,4

Saraina A in C 8 DIOL 16

8 DIOL 17

8 DIOL 14

2,5

2,9

5,7

Sarain C 8 RP 22

8 RP 23

1,0

2,5

Saraini 1, 2 in 3 8 DIOL 2 31,6

Sarain 1 6 DIOL 2 13,2

Izosarain 1 8 DIOL 3/3 7,8

Sarain 3 8 DIOL 3/A

8 DIOL 3/5

8 DIOL 3/6

6 DIOL 5

1,3

4,9

4,7

2,0

Še nepoznan sarain z molekulsko maso 442

8 DIOL 13/9

8 DIOL 13/10

8 DIOL 14/3

0.9

1,4

1

Še nepoznan sarain z molekulsko maso 524

6 DIOL 13 1,9


4.1.2.2 Ločevanje s HPLC

Poleg ločevanja z adsorbcijsko kromatografijo na trdni stacionarni fazi je bila raziskana tudi možnost čiščenja sarainov s HPLC. Uporabili smo različne stacionarne faze in eluente ter preizkusili naslednje analitske pogoje:

• Merck 100NH2 LiChrosorb; 10 µm, 250 x 4 mm kolona; pretok topila 1ml/min; UV detektor pri λ 238 nm, kar ustreza maksimalni absorbciji sarainov. Ti pogoji veljajo tudi za ostale preizkušene mobilne in stacionazne faze. Izokratsko smo spirali z mobilno fazo CH3OH/H2O (9:1), CH3CN / H2O (7:3)

• Merck RP18 LiChrosorb; 7 µm, 250 x 4 mm kolona; gradientno spiranje z mobilno fazo CH3CN/H2O (3:7) do 100% acetonitrila (CH3CN) (t = 20 minut)

• Merck 100DIOL LiChospher; 5 µm, 250 x 4 mm kolona; gradientno spiranje z mobilno fazo CH3CN/H2O (3:7) do 100% CH3CN

S HPLC smo ločevali frakcijo 8 DIOL 15, ki smo jo pridobili iz predhodne adsorbcijske kromatografije na stacionarni fazi in je po analizah z ESI-MS vsebovala dve večinski komponenti z m/z 525 in 551 in manjši delež sarainov A in C. HPLC smo izvedli na koloni Merck 100DIOL LiChrospher (10 µm, 250 x 10 mm) z CH3OH/H2O (4:6), ki smo ji dodali 0,5% trifluoroocetno kislino. Pretok je bil 5 ml/min prvih 10 minut in dalje 7 ml/min. Prisotnost vzorca smo zaznavali pri λ= 240 nm. Podatki so podani v kromatogramu na sliki 23. Frakcije, ki smo jih prestregli glede na kromatografske vrhove, smo nato koncentirali z vodno vakuumsko črpalko in injicirali direktno v ESI-MS spektrometer.

Slika 23. Kromatogram HPLC frakcije 8 DIOL 15 na koloni Merck 100DIOL LiChrospher (10 µm, 250 x 10 mm) zmobilno fazo CH3OH/H2O (4:6), ki smo ji dodali 0,5% trifluoroocetno kislino. Čas spiranja je 20 minut.


Vrhova 1 in 2 sta ustrezala sarainu A, vrhova 3 in 5 sarainu C, vrh 4 je mešanica obeh, m/z signalov 525 in 551 pa sploh nismo zaznali. Verjetno je, da so bili zadržani na stacionarni fazi, kar še enkrat potrjuje nenavadno kromatografsko obnašanje sarainov. Zato smo se odločili, da bomo saraine ločili z adsorbcijsko kromatografijo na trdni stacionarni fazi.

4.2 PRIPRAVA PROTONIRANIH SARAINOV

Manjšemu delu (približno 20 mg) frakcije, ki je vsebovala vse saraine (fr.8; glej sliko 22), raztopljene v acetonu (CH3COCH3), smo dodali 2 ml 1 M raztopine mravljične kisline (HCOOH). Mešanico smo koncentrirali na rotavaporju. Ostanek smo nanesli na malo kolono, napolnjeno s stacionarno fazo RP18 in s spiranjem ločili 3 frakcije. Za spiranje prve smo uporabili vodo, nato CH3CN / H2O (1:1) in nazadnje 100% metanol. Tretja frakcija je vsebovala saraine, protonirane na mestih dušikov (terciarni amini imajo bazičen značaj in tako privlačijo protone iz kisline). S podobnim postopkom smo obdelali tudi frakcijo 8 DIOL 12, ki je vsebovala samo saraine A, B in C. Pri obdelavi z bazo smo mešanici sarainov A, B in C (8 DIOL 12) dodali s kapalko 5 kapljic trietilamina (CH3CH2)3N. Raztopino smo koncentrirali na rotavaporju in skupaj s topilom odparili tudi trietilamin. Obdelane mešanice smo nato uporabili pri bioloških testih in njihov vpliv primerjali z neobdelanimi.

4.3 DOLOČITEV KEMIJSKIH LASTNOSTI SARAINOV

Strukturne lastnosti smo v glavni meri določili z analizami NMR in posnetki masnih spektrov, pridobljene podatke pa smo primerjali z že objavljenimi. Poleg spektrov ESI(+)-MS , smo posneli nektere spektre tudi z EI-MS (slika 24).

Slika 24a: Analizi EI-MS surovega izvlečka A morske spužve Reniera sarai. Spekter je bil posnet pri 229°C (povečano območje višjih molekulskih mas). Relativna intenzivnost predstavlja razmere med intenzivnostjo signala izbranega vrha in intenzivnostjo najmočnejšega signala. V tistem vzorcu le ta predstavlja 100 %.


Slika 24b: Analizi EI-MS surovega izvlečka A Reniera sarai. Spekter je bil posnet pri 353°C (povečano območje višjih molekulskih mas). Relativna intenzivnost predstavlja razmere med intenzivnostjo signala izbranega vrha in intenzivnostjo najmočnejšega signala. V tistem vzorcu le ta predstavlja 100 %.

4.3.1 Saraini A, B in C

Spekter ESI-MS mešanice sarainov A, B in C (strukture na sliki 7) smo posneli po ionizaciji s pozitivnimi delci (zato ESI(+)-MS). Vzorec smo vbrizgavali neposredno v elektrorazprševalnik. Vzorec smo pripravili tako, da smo frakciji z ločevalne kolone odstranili topilo, jo raztopili v metanolu in dodali nekaj kapljic mravljične kisline.

Spekter na sliki 25 nam prikaže psevdomolekularne ione [M+H]+ pri m/z 511, 523 in 537. Sledijo tandemski masni spektri (MS/MS), kjer je bil posamezni signal (t.j. spojina) naknadno fragmentiran:

• MS/MS (m/z 511=M+H+ za sarain A): 493[M+H-H2O]+, 475[M+H-2H2O]+, 288 [M+H-223] +, 270 [M+H-241] +

• MS/MS (m/z 523=M+H+ za sarain B): 505 [M+H-H2O]+, 487[M+H-2H2O]+, 300 [M+H-223] +, 282 [M+H-241] +

• MS/MS (m/z 537, M+H+ za sarain C): m/z 519[M+H-H2O]+, 501[M+H-2H2O]+, 314[M+H-223] +, 296[M+H-241] +

Omembe vredno je, da so to prvič objavljeni posnetki, pridobljeni s tehniko ESI-MS, vključno s fragmentacijo MS/MS (slika 26).


Slika 25: ESI (+)-MS spekter mešanice sarainov A([M+H]+= m/z 511), B ([M+H]+= m/z 523), in C ([M+H]+= m/z 537), direktni vbrizg metanolne raztopine vzorca z dodano mravljično kislino.

Slika 26: ESI(+)-MS/MS spektri fragmentov sarainov A, B in C.

Spekter ESI-MS mešanice sarainov raztopljene v metanolu, ampak brez dodatka kisline spet pokaže vrhove pri m/z 511, 523 in 537, poleg tega pa še prisotnost skupkov višjih molekulskih mas, ki nastanejo zaradi tvorbe dimerov (slika 27). Natančneje bi ti vrhovi pripadali spodaj navedenim dimerom (podrobneje bo pojav razložen v poglavju 5.1):

m/z 1021 : [2 x sarain A +H]+ m/z 1033 : [ sarain A + sarain B +H]+

m/z 1045 : [ 2 x sarain B +H]+ m/z 1047 : [ sarain A + sarain C +H]+

m/z 1059 : [sarain B + sarain C + H]+ m/z 1073 : [ 2 x sarain C + H]+


Slika 27: Spekter ESI(+)-MS mešanice sarainov A, B in C, pridobljen z neposrednim vbrizgom metanolne raztopine (brez dodatka mravljične kisline). Levo monomeri sarainov A, B in C (v območju m/z 500), desno pa dimerni skupki različnih kombinacij (v območju m/z 1000).

Pri analizah 1H-NMR smo spektre posneli z vzorci, raztopljenimi v CDCl3 (devterijev triklorometan), ki smo ga pred tem sprali skozi kolono z aluminijem, da bi nevtralizirali sledi kislin, ki so vedno prisotne v topilu, prisotnem na trgu. Okvirna koncentracija vzorca je bila 1-3 mg/ml topila. NMR podatki so bili pomembni za določitev samega značaja sarainov, saj smo se le iz primerjave z objavljenimi NMR podatki lahko odločili ali gre za sarain A, B ali C oziroma 1, 2 ali 3 (slika 28). Kemijske značilnosti sarainov in njihovo čistost smo preverjali preko obojih podatkov: NMR in MS analiz. Vzorec z mešanico sarainov A, B in C smo še dodatno obdelali s trietilaminom tako, da smo neposredno v NMR kapilaro z že pripravljenim vzorcem dodali nekaj kapljic trietilamina. To je povzročilo nastanek aldehidnega signala, in sicer po en singlet pri valovni dolžini 9.5 ppm za vsak tip saraina (slika 29). Le teh pa nismo mogli zaznati ob dodatku trifluoroocetne kisline (CF3COOH) na sliki 30, kjer opazimo spet drugačno obnašanje v magnetnem polju od obnašanja neobdelanega vzorca v nevtralnem okolju. Ti rezultati nam predočijo svojsko obnašanje aminoaldehidnih delov, kar bo podrobneje razloženo v diskusiji.


13 10 5 0 ppm

Slika 28: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov A, B in C s koncentracijo približno 2 mg/0.6 ml CDCl3.

Slika 29: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov A, B in C v CDCl3 po enostavni odelavi z dodatkom trietilamina v cevko NMR z raztopino vzorca v CDCl3..

CH2Cl2

CHCl3

Et3N Et3N


Slika 30: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov A, B in C v CDCl3 po obdelavi s trifluoroocetno kislino.

4.3.2 Saraini 1, 2, 3 in izosaraini 1, 2, 3

Posneli smo spektre NMR in MS vseh frakcij, ki smo jih dobivali tekom postopnega čiščenja.V nadaljevanju bomo prikazali le nekatere.

Slika 31: 1H-NMR (400MHz) spekter mešanice sarainov 1,2 in 3 v CDCl3.

Na sliki 32 so prikazani podatki o fragmentih, ki jim lahko pripišemo njihov nastanek:

• MS/MS(m/z 455=M+H+ za sarain 2): 437 [M+H-H2O]+, 424 [M+H-31]+,218 [M+H-237] +




Slika 32: Spekter ESI(+)-MS/MS fragmentiranega vzorca sarainov 2, 1 in 3 (od leve proti desni). Naveden signali ustrezajo velikosti psevdomolekularnih ionov [M+H]+ .

Kot čiste spojine nam je poleg saraina 3 uspelo izolirati sarain 1 in izosarain 1. Gre za dve izomeri z enako molekulsko formulo, torej tudi z zelo podobnim spektrom MS. Ni ju enostavno ločiti niti preko spektrov NMR (slika 33), občutno pa se razlikujeta v optični aktivnosti.

Specifična sučnost frakcije 6 DIOL 2 [α]D je -43.7° v CHCl3. Na podlagi primerjave s podatki, navedenimi v literaturi (Cimino in sod., 1986b), [α]D = -47.8° v CHCl3 , se lahko odločimo, da ta frakcija predstavlja sarain 1.

Specifična sučnost frakcije 8 DIOL 3/3 [α]D je -20.0° v CHCl3, iz česar lahko, glede na podatke v literaturi (Cimino in sod, 1986b), kjer za izosarain 1 navedena [α]D = -23.1° v CHCl3, sklepamo, da je to izosarain 1. Sicer bi lahko šlo tudi za sarain 3, ampak v tem primeru bo iz spektra MS razbrali višjo molekulsko maso.

Specifična sučnost frakcije 8 DIOL 3/5 [α]D je - 29.6°, v CHCl3. S primerjanjem s podatki v literaturi (Cimino in sod.,1986b and Guo in sod., 1996b), kjer je za sarain 3 velja [α]D = - 27.4° v CHCl3, se lahko odločimo za sarain 3.

Slika 33: 1H-NMR (400MHz) spekter čistega saraina 1 v topilu CDCl3.


Slika 34: 1H-NMR (400MHz) spekter čistega saraina 3 v CDCl3.

4.3.3 Novi saraini

Na ESI-MS spektru opazimo signale tudi za saraine, ki se razlikujejo od že poznanih sarainov A, B, C in 1, 2, 3. Natančneje so taki signali pri m/z 551, 535, 525, 499, 493, 493, 483, 479 in 443. S tehnko MS/MS smo fragmentirali posamezen signal in dobili naslednje fragmente z velikostjo:

• MS/MS (551): 533[M+H-H2O]+, 519[M+H-MeOH]+, 501[M+H-H2O-MeOH]+, 296[M+H-255]+

• MS/MS (535): 517[M+H-H2O]+, 499[M+H-2H2O, nizka intenzivnost]+, 312[M+H-223], 294

• MS/MS (499): 481[M+H-H2O]+, 467[M+H-MeOH]+

• MS/MS (495): 477[M+H-H2O]+

• MS/MS (493): 475[M+H-H2O]+

• MS/MS (483): 465[M+H-H2O]+, 451[M+H-MeOH]+

• MS/MS (479): 461[M+H-H2O]+, 242[M+H-237]+

Mogoče je, da smo izolirali spojine, ki se skladajo z bolj intenzivnimi vrhovi že v izhodnem surovem ekstraktu (A/MeOH/CH2Cl2 = v diklorometanu topen del metanolnega ekstrakta spužve R. sarai na sliki 22). Taki sta spojini m/z 443 in 525.

Uspelo nam je pridobiti sorazmerno majhno količino omenjenih sarainov (približno 1-2 mg), kar nam je še vedno dovoljevalo izvesti analize NMR. Prav z namenom, da bi mogli spojini določiti strukturo še natačneje, vzorcev m/z 443 in 525 nismo testirali z biološkimi testi.


Slika 35: Spekter ESI(+)-MS surovega ekstrakta sarainov iz spužve Reniera sarai. Z rdečo in modro barvo so označeni še nepoznani saraini: z rdečo saraini, v vzorcu prisotni z manjšo intenziteto, ki jih nismo dalje proučevali, z modro pa saraina, v vzorcu prisotna z večjo intenziteto, proučevali smo ju podrobneje.

4.3.3.1 Sarain z molekulsko maso 524 g/mol

Ta še nepoznan sarain je bil izoliran v frakciji 6 DIOL 13, po zgoraj opisanem postopku v poglavju 4.1.2.1 (slika 22). Spekter ESI (+)-MS prikaže signal pri m/z 525, kar ustreza ionu [M+H]+.

Ob fragmentaciji izbranega vrha smo posneli tandemski masni spekter (slika 36) s fragmenti: MS/MS (525): 507 [M+H-H2O]+, 493 [M+H-MeOH]+, 475 [M+H-H2O-MeOH]+, 302 [M+H-223]+, 284 [M+H-241]+ in 270 [M+H-255]+.

Slika 36: Spekter ESI(+)-MS/MS snovi z vrhom pri m/z 525, to je čistega novega saraina z molekulsko maso 524 g/mol.


Na spektru EI-MS nismo dobili vrha pri m/z 524, ampak pri m/z 492 z intenzivnostjo 3,5 %, kar ustreza fragmentu [M –CH3OH].

Količina izolirane snovi nam je zadoščala za obširne NMR analize. 1HNMR spekter (slika 37) nam prikazuje značilne signale v območju 6.5-5.0 ppm, ki so tipični za saraine A, B in C ter singlet pri 3.4 ppm, ki ga pripisujemo OCH3 skupini.

1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm Slika 37: 1HNMR spekter (pri 400 MHz) novega saraina z molekulsko maso 524 v topilu CDCl3.

ppm (f2)1.02.03.04.05.06.07.08.0

50

100

150

ppm (f1

ppm (f2)0.600.700.800.901.001.101.20

20

30

40

50

ppm (f1

Slika 38: Korelacijske mape 1H-13C iz dvodimenzionalnega spektra, pridobljene z vrsto HSQC spektrov čistega novega saraina (m/z 525) v CDCl3; na vodoravni osi 1H spekter, na navpični 13C spekter. Spodnja slika je povečan del zgornjega desnega vogala zgornje slike.

Optično aktivnost smo določili z merjenjem specifične sučnosti vzorca s koncentracijo 1.13 mg/ml v metanolu, kot vir monokromatske svetlobe pa smo uporabili natrijevo žarnico z valovno dolžino λ =589 nm. Izmerili smo sučnost:

[α]D= + 10.5°


Iz spektra absorbcije v UV območju (slika 39) smo izmerili (glej tudi formulo 4) :

UV: A: λ (nm) = 348 (є = 405), 320 (є = 1530), 235 (є = 7350)

za metanolno raztopino z molarno koncentracijo 8.2 x 10-5 M.

Slika 39: UV spekter novega saraina z molekulsko maso 524.

Na sliki 40 je posnet spekter absorpcije IR svetlobe. Iz vzorca smo prej odparili topilo (CH2Cl2). Na spektru je označena tudi absorpcija, ki jo imata čisto topilo in voda.

Slika 40: IR spekter novega saraina z molekulsko maso 524. Svetlomodro je prikazan spekter deionizirane vode, zeleno spekter diklorometana, vijolično pa spekter novega saraina z molekulsko maso 524.


4.3.3.2 Sarain z molekulsko maso 442 g/mol

Sarain, ki ga v ESI-MS spektrih predstavlja vrh [M+H]+ pri m/z 443 (slika 35), smo izolirali v več frakcijah kot je prikazano na sliki 22.

Slika 41: EI-MS spekter čistega novega saraina z molekulsko maso 442 g/mol. Relativna intenzivnost predstavlja razmere med intenzivnostjo signala izbranega vrha in intenzivnostjo najmočnejšega signala. V tistem vzorcu le ta predstavlja 100 %.

Analize ESI-MS v pogojih, kjer je vzorec podvržen pozitivni ionizaciji, pokažejo vrh pri m/z 443, ki ga pripisujemo ionu [M+H]+, enako kot pri vseh ostalih saranih, ki so dobro zaznavni s to tehniko. Vsi namreč vsebujejo atome dušika – amine, ki se zlahka protonirajo.

S tandemsko masno spektroskopijo zabeležimo fragmente velikosti: MS/MS (443): 441 [M+H-H2]+, 412 [M+H-31]+, 218 [M+H-225]+. Posnetek spektra EI-MS je na sliki 41. EI-MS ( m/z, %): 443 (M+· +1, 11); 442 (M+· , 28), 441 (M+·-1, 10), 238 (22), 237 (18), 138 (28), 36 (100).

S tehniko EI-MS visoke ločljivosti (HR, High resolution) smo dobili naslednje predloge molekulske formule, ki so bili najverjetnejši za dano molekusko maso:

HR(EI)MS: 442.42795 ±0.002 (C30H54N2, zračunano 442.42870); 441.42005 ±0.003 (C30H53N2, zračunano 441.42087); 237.23320±0.003(C15H29N2, zračunano 237.23307);

Na spektru 1H-NMR (slika 42) signal pri 5 ppm pripisujemo CH2Cl2, ki smo ga uporabljali kot topilo in je ostal ujet v vzorcu, signali v območju 2.0 – 1.0 ppm pa so razširjeni. Ta razširitev nastane verjetno zaradi prisotnosti dovolj velikih obročev, ki se konformacijsko gibljejo zelo hitro – rotirajo okrog C-C vezi in jih zato z NMR tehniko pri okoljski temperaturi ne moremo ločiti med sabo.


Slika 42: 1H-NMR (400MHz) spekter novega saraina z molekulsko maso 442 v topilu CDCl3.

ppm (f2)1.001.50

20

30

40

50

60

70

ppm (f1

Slika 43: Dvodimenzionalen spekter 1H-13C dolgega dosega (HMBC) novega saraina z molekulsko maso 442 v topilu CDCl3.

Optično aktivnost smo določili z merjenjem specifične sučnosti vzorca s koncentracijo 0.80 mg/ml v metanolu, kot vir monokromatske svetlobe pa smo uporabili natrijevo žarnico z valovno dolžino λ =589 nm. Izmerili smo sučnost:

[α]D= +20.6°


Iz spektra absorbcije v UV območju smo izmerili (glej tudi formulo 4):

UV: A: λ (nm) = 276 (є = 685), 240 (є = 1890)

za metanolno raztopino vzorca z molarno koncentracijo 1.15 x 10-4 M.

Na sliki 44 je posnet spekter absorpcije IR svetlobe. Iz vzorca smo prej odparili topilo (CH2Cl2). Na spektru je označena tudi absorpcija, ki jo imata čisto topilo in voda.

.

Slika 44: Spekter IR novega saraina z molekulsko maso 442. Svetlomodro je prikazan spekter deionizirane vode, zeleno spekter diklorometana, rdeče pa spekter novega saraina z molekulsko maso 442.

4.2 BIOLOŠKE AKTIVNOSTI SARAINOV

4.2.1 Protibakterijska aktivnost

Ker smo imeli na razpolago omejeno količino vzorca, smo se odločili za predhodne presejalne teste, s pomočjo katerih smo izbrali občutljivejše vrste bakterij. Na ploščah z nacepljenimi bakterijami Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae in Bacillus subtilis smo odčitali cono inhibicije, ki jo je povzročil neočiščeni ekstrakt spužve s koncentracijo 1 mg/ml. Pri prvih štirih (G-) so cone merile od 1 do 2 mm, pri ostalih štirih (G+) pa 7 do 5 mm. Tako smo test nadaljevali samo z Gram pozitivnimi bakterijskimi vrstami.

Pri najvišji koncentraciji (5 mg/ml) so inhibirali rast bakterij vsi vzorci razen vzorca 6, ki se je hkrati v etanolu tudi močno obarjal. Da bi se prepričali o vzroku neaktivnosti smo raztopini za redčitev dodali 10% (v/v) DMSO in s tem uspešno preprečili obarjanje, vzorec pa je ostal neaktiven.


Ostale vzorce smo redčili dalje in jih glede na njihove minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) pri posamezni bakteriji ločili na tri razrede: izrazito (MIK je 0.1–25 µg/ml), srednjo (0.05-0.5 mg/ml) in rahlo (0.5–1.5 mg/ml) antibakterijsko aktivnost. Gre za masne koncentracije, saj smo delali tako z mešanicami kot čistimi spojinami. Do izrazite inhibicije pride pri bakterijah Streptococcus agalactiae in Bacillus subtilis pri večini vzorcev (vzorci 1, 2, 3, 1A in 1B) in vzorec 5 (sarain 3). Med srednje aktivne spadajo vzorci 4 in 7 pri bakterijah S. agalactiae in B. subtilis ter vzorci iz družine sarainov A, B, C, vključno z obdelanimi vzorci (1A in 1B) za bakterije Staphylococcus aureus in Staphylococcus epidermidis. Še manj so rast slednjh bakterij inhibirali vzorci 4, 5 in 7 iz družine sarainov 1, 2, 3 (MIK je 0.5 do 1,5 mg/ml). Testirano topilo ni v nobenem primeru pokazalo inhibicijo rasti, kot tudi ne topilo z dodatkom dimetilsulfoksida. Minimalne inhibitorne koncentracije vseh testiranih spojin proti uporabljenim bakterijam so prikazane v preglednici 3.

Preglednica 3: Minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) testnih spojin proti izbranim bakterijam. MIK je izražena kot masna koncentracija.

n.a. = ni aktivnosti.

MIK (mg/ml) Staphylococcus

aureus Staphylococcus

epidermidis Streptococcus

agalactiae Bacillus Subtilis

Vzorec 1 saraini A, B, C 0.05 0.15 0.05 0.0045

Vzorec 2 Saraina A in C 0.25 0.25 0.01 0.01

Vzorec 3 Sarain C 0.25 0.15 0.025 0.025

Vzorec 4 Saraini 1, 2, 3 0.8 1 0.5 0.3

Vzorec 5 Sarain 3 > 1 1,5 < 0,1 < 0,1

Vzorec 6 Izosarain 1 n.a. n.a. n.a. >1

Vzorec 7 Sarain 1 1 1.5 0.15 0.4

Vzorec 1A Protonirani saraini

A, B, C 0.45 0.45 < 0.0001 0.025

Vzorec 1B S trietilaminom

obdelani saraini A, B, C

0.15 0.15 < 0.0001 < 0.0001

Kljub temu, da imamo opraviti tudi z mašanicami, smo za boljšo predstavo preračunali tudi molarne minimalne inhibitorne koncentracije. Zbrane so v preglednici 4. Pri mešanicah smo predpostavili, da so snovi zastopane v razmerju 1:1 oz. 1:1:1 in uporabili njihovo povprečno molekulsko maso.


Preglednica 4: Minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) testnih spojin proti izbranim bakterijam. MIK je izražena kot molarna koncentracija. MIK mešanic spojin so osenčene s sivo barvo.

n.a. = ni aktivnosti.

MIK (µM) Staphylococcus

aureus Staphylococcus

epidermidis Streptococcus

agalactiae Bacillus

subtilis Vzorec 1

Saraini A, B, C 96 290 96 8,6

Vzorec 2 Saraina A in C 480 480 19 19

Vzorec 3 Sarain C 460 280 46 46

Vzorec 4 Saraini 1, 2, 3 1700 2100 1100 640

Vzorec 5 Sarain 3 >2100 3100 <210 <210

Vzorec 6 Izosarain 1 n.a. n.a. n.a. >2100

Vzorec 7 Sarain 1 2100 3200 320 860

Vzorec 1A Protonirani saraini

A, B, C 860 860 <0.19 47

Vzorec 1B S trietilaminom

obdelani saraini A, B, C

290 290 <0.19 <0.19

4. 2. 2 Hemolitična aktivnost Hemolitično aktivnost so pokazali vzorci 1, 1A, 1B in 3. Liza, povzročena z vzorcem 3 je bila dvakrat manjša od ostalih iz skupine 1. Nizko aktivnost zaznamo pri vzorcih 2, 4 ter 7, medtem ko sta vzorca 5 in 6 nista bila aktivna (slika 46). Etanol ni imel v testiranih koncentracijah nobenih hemolitičnih učinkov. Tudi dodani DMSO ni kazal nobene hemolitične aktivnosti.

Slika 45: Časovni potek hemolize, povzročene z vzorcem 1A pri koncentraciji 0,3 µg/ml.


0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,40

1

2

3

4 vz1 vz2 vz3 vz4 vz5 vz6 vz7 vz1A vz1B

1/t 50

Koncentracija saraina (μg/ml)0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

1

2

3

4 vz1

1/t 50

Vzorec 1 (μg/ml)0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

1

2

3

4 vz2

1/t 50

Vzorec 2 (μg/ml)

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,40

1

2

3

4 vz3

1/t 50

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,40

1

2

3

4 vz4

1/t 50

Vzorec 4 (μg/ml)0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

1

2

3

4 vz5

1/t 50

Vzorec 5 (μg/ml)

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,40

1

2

3

4 vz7

1/t 50

Vzorec 7 (μg/ml)0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

1

2

3

4

Vzorec 3 (μg/ml)

vz1A

1/t 50

Vzorec 1A (μg/ml)0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

1

2

3

4 vz1B

1/t 50

Vzorec 1B (μg/ml)

Slika 46: Recipročne vrednosti polovičnih časov hemolize (min-1) , povzročene z vzorci 1, 2, 3, 4, 5, 7, 1A in 1B v odvisnosti od masne koncentracije testiranih spojin (µg/ml). Masne koncentracije 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2,

1.4 µg/ml ustrezajo molarnim 0.37, 0.74, 1.12, 1.49, 1.87, 2.24 µM za čisti vzorec 3, 0.41, 0.83, 1.25, 1.67, 2.08, 2.50 µM za čisti vzorec 5, in 0.43, 0.86, 1.29, 1.72, 2.15, 2.57 µM za čisti vzorec 7.


4.2.3 Antiacetilholinesterazna aktivnost Preden smo spremljali morebitno antiacetilholinesterazno aktivnost testnih spojin, smo preizkusili, ali le-te reagirajo z reduciranim Ellmanovim reagentom in povzročajo njegovo razbarvanje, kar bi lahko pripeljalo do napačne interpretacije rezultatov. Rezultati so pokazali, da nobena od spojin v najvišji testirani koncentraciji (0.1 mg/ml) ne povzroči znižanja absorpcijskega spektra tiobisnitrobenzoata za več kot 10%. Ker so bile spojine, ki so kazale sposobnost inhibicije AChE, aktivne pri bistveno nižjih koncentracijah, smo to interakcijo zanemarili.

Opravljeni poskusi so jasno pokazali, da vsi vzorci inhibirajo AChE. Časovni potek je bil povsod linearen. Preizkusili smo tudi učinek topila in ugotovili, da encim ni bil inhibiran. Delež inhibicije smo izračunali po formuli 5:

Delež inh.[%] = (1 – (izmerjena vrednost A412 v prisotnosti inhibitorja/izmerjena vrednost A412 v odsotnosti inhibitorja))*100% ...(5)

Preglednica 5: Konstante inhibicije in tipi inhibicije vzorcev sarainov. n.i. = ni inhibicije.

Vzorec Sarain Ki (µg/ml) Ki (µM) Tip inhibicije

1 A,B,C 3 Zmes Kompetitivna

reverzibilna

2 A,C 2 Zmes Kompetitivna

reverzibilna

3 C 4.5 8.4 Kompetitivna

reverzibilna

4 1,2,3 1 Zmes Kompetitivna

reverzibilna

5 3 3 6.3 Kompetitivna

reverzibilna

6 Izosarain 1 5 10 Kompetitivna

reverzibilna

7 1 3 6.4 Kompetitivna

reverzibilna

1A A,B,C z dodano

kislino 4 Zmes Kompetitivna

reverzibilna

1B A,B,C z dodano

bazo 7 Zmes Kompetitivna

reverzibilna

Dobljene rezultate pri različnih koncentracijah substrata smo brez večjih problemov obdelali in prikazali s pomočjo Dixonovih diagramov. Pri delu nam je bil v veliko pomoč čitalec


mikrotitrnih plošč, na katerem smo lahko istočasno spremljali 96 kinetik. S tem smo močno zmanjšali napako pri delu, skrajšali čas dela, in lahko naredili več ponovitev istega poskusa. Dixonov diagram ponazarja odvisnost recipročne vrednosti hitrosti encimsko katalizirane reakcije od koncentracije encimskega inhibitorja. Iz presečišča krivulj, dobljenih s spremljanjem reakcije pri različnih koncentracijah substrata, lahko sklepamo na vrsto inhibicije in izračunamo konstanto inhibicije (Ki). Dixonovi diagrami za inhibitorne vzorce 1-7, 1A in 1B so prikazani na sliki 47.

Konstante inhibicije in tipi inhibicije vzorcev sarainov so povzeti v preglednici 5. Za čiste spojine smo konstante inhibicije preračunali tudi v molarne koncentracije.

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ki = 3 μg/ml

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

1/v 0

vzorec 1 (μg/ml)-10 0 10 20 30

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Ki = 2 μg/ml

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

1/v 0

vzorec 2 (μg/ml)-10 0 10 20 30 40 50 60 70

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ki = 4.5 μg/ml

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

1/v 0

Vzorec 3 (μg/ml)

-10 0 10 20 30

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

Ki = 1 μg/ml

1/v 0

Vzorec 4 (μg/ml)

-10 0 10 20 30

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

Ki = 3 μg/ml

1/v 0

vzorec 5 (μg/ml)-10 0 10 20 30 40 50 60 70

0,2

0,4

0,6

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

Ki = 5 μg/ml

1/v 0

Vzorec 6 (μg/ml)

-10 0 10 20 30 40

0,2

0,4

0,6

0,8

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

Ki = 3 μg/ml

1/v 0

Vzorec 7 (μg/ml)-10 0 10 20 30 40 50 60 70

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

Ki = 4 μg/ml

1/v 0

Vzorec 1A (μg/ml)

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

S = 1 mM S = 0.75 mM S = 0.5 mM

Ki = 7 μg/ml

1/v 0

Vzorec 1B (μg/ml)

Slika 47: Dixonovi diagrami inhibicije acetilholinesteraze iz električne jegulje s testnimi vzorci 1-7, 1A in 1B [saraini – čisti in zmesi] pri treh različnih koncentracijah substrata acetiltioholina:1 (■), 0.75 (■) in 0.5 (■) mM.


5 RAZPRAVA IN SKLEPI

5.1 IZOLACIJA IN DOLOČANJE STRUKTURNIH LASTNOSTI SARAINOV

Čiščenje in ločevanje sarainov je bilo zahtevno zaradi njihovega posebnega obnašanja, ki ga pripisujemo nenavadni strukturi teh metabolitov, kar bomo podrobneje razložili v nadaljevanju. Že ob njihovi prvi izolaciji so opazili, da se spojine ne podrejajo splošnim pravilom porazdelitve med stacionarno in mobilno fazo pri adsopcijski kromatografiji (Cimino in sod., 1989a ter Guo in sod., 1996a). Omenjeni avtorji so preko zapletenih kromatografskih postopkov s silikatno stacionarno fazo ločili dve vrsti podobnih sarainov: saraine A, B, C in saraine ali izosaraine 1, 2, 3 (strukture na slikah 7 in 9). Zapleteni in dolgi postopki ločevanja do posamezne čiste snovi nam dajejo slutiti, da ločevanje ni bilo enostavno. Cimino (Cimino in sod., 1986a) že od začeka pravi, da bi težave pri čiščenju snovi lahko nastajale zaradi tvorjenja kompleksov med molekulami sarainov in solmi, prisotnimi v kromatografskih substratih. Ta sposobnost tvorjenja kompleksov razlaga tudi njihovo vlogo katalizatorjev pri faznem prenosu v organskih reakcijah (Cimino in sod., 1986b).

V tej diplomski nalogi smo potrdili primernost silikatne stacionarne faze z vezano diolno skupino za ločevanje sarainov. Spirali smo po običajnem postopku gradientnega spiranja s topiloma CH2Cl2/CH3OH (glej odstavek 4.1), kar nam je omogočilo kar najboljšo ločitev kot poroča Cimino (Cimino in sod., 1989a). Z uporabo adsorbcijske kromatografije na trdni fazi z rahlo kislo raztopino CH2Cl2/CH3OH smo tako pridobili zadovoljive rezultate. Potrdili smo, da se zmes bolje ločuje, če dodana kislina spada med močne kisline (uporabili smo trifluoroocetno kislino), kajti ob dodatku šibke mravljične kisline se vrhovi niso dobro ločili. Obarvanje lis na TLC ploščah z jodovimi parami se je izkazalo za primernejše od standardne metode obarvanja s cerijevim sulfatom v kisli raztopini, kot je prikazano na sliki 21.

Preizkusili smo različne pogoje, ki bi nam omogočili ločevanje posameznih sarainov z metodo HPLC. Spreminjali smo tako stacionano kot mobilno fazo, vendar nismo mogli doseči zadovoljivih pogojev, ki bi nam omogočili delo v preparativnih količinah. Na sliki 23 je najboljši kromatogram, ki nam ga je uspelo dobiti. Razvidni so slabo ločeni vrhovi, poleg tega pa posamezni vrh ne vsebuje čistih sarainov, kot smo ugotovili z MS analizo. S trifluoroocetno kislino nismo mogli izboljšati ločitve, ker v tem primeru ne bi mogli uporabiti tekočinske kromatografije, sklopljene z masno spektrometrijo (HPLC/MS), saj ta tehnika dovoljuje samo uporabo hlapnih in šibkih kislin. Kljub tovrstnim težavam, nam je uspelo očistiti nekatere saraine do čiste snovi in preveriti njihove biološke aktivnosti.

Vzrok takega nepravilnega obnašanja sarainov A-C pripisujemo dejstvu, da se njihova aminska in aldehidna skupina prostorsko nahajata tako blizu, da reagirata med seboj. Kot je ponazorjeno na sliki 48, je molekula v nevtralnem okolju lahko v amino-aldehidni obliki, ki je v ravnotežju z dipolarno obliko. Med skupinama poteče nukleofilna substitucija, pri kateri igra nukleofilno vlogo terciarni amin, elektrofilno pa karbonilni ogljik v aldehidu, »efekt bližine« pa še dodatno olajša njen potek. Nastane v celoti nevtralna spojina, vendar z dvema nasprotnima nabojema, od katerih je odvisno kromatografsko obnašanje molekul. V kislem


okolju (npr. pri interakciji s silikatom v kromatografski koloni ali s sledmi kisline, prisotnimi v CDCl3 za komercialno uporabo, uporabljenem pri pripravi NMR vzorcev) protonacija določi strukturo amino skupine in spojina postane veliko bolj polarna od začetne. Cimino in sodelavci (1989a, 1990) so v svojih delih opozorili na ta pojav, ki povzroči velike spremembe kemijskih in spektroskopskih lastnosti sarainov, kar se odraža na podatkih, pridobljenih z IR in NMR.

Slika 48: Delna struktura sarainov A-C. Razvidna je amino-dipolarna oblika (A) v ravnotežju z dipolarno obliko (B) iz katere ob prisotnosti kisline nastane protonirana oblika (C).

S spreminjanjem pogojev smo tudi mi posneli različne 1HNMR spektre. Spekter na sliki 28 je posnetek raztopine sarainov A-C v CDCl3 brez sledi kisline, saj smo topilo predhodno vodili čez kolono, napolnjeno z bazičnim aluminijem. Nahajajo se v dipolarni obliki, skicirani na sliki 48, struktura B. Izjemno stabilen obroč s šestimi členi, pozitiven naboj na dušiku terciarnega amina in negativen na kisiku, ki je zelo elektronegativen atom so razlogi dodatne stabilnosti dipolarne oblike B. Objavljene so bile študije o efektu bližine pri sintetiziranih spojinah s podobnimi amino-aldehidno skupinami in prav tako so opazili, da je ciklizacija pospešena v organskih topilih (kot je metanol), ki stabilizirajo dipolarno obliko tipa B (Davies in sod., 2003).

Po dodatku trietilamina v cevko NMR smo posneli NMR spekter (slika 29), ki prikazuje pojav treh singletov (po enega za vsak sarain A-C) v območju 9.5-9.7 ppm, kar je tipično za proton –CHO, prisoten v amino-aldehidni skupini (oblika A na sliki 48). Protonirana C oblika bi morala ustrezati spektru na sliki 30, ki smo ga posneli, potem ko smo raztopini sarainov A-C dodali trifluoroocetno kislino.

V tem diplomskem delu smo prvič s temi spojinami uporabljali tehniko ESI-MS. Izkazala se je za zelo primerno metodo, saj nam je pomagala ločiti med saraini A-C, ki dajo praktično zelo podobne NMR spektre, na spektrih EI-MS pa je »ionizacija s trčenjem« (ang. impact electronic) nizko intenzivna. Fragmenti, dobljeni z ESI-MS/MS analizo posameznih izbranih ionov z molekulsko maso M (slika 26), so posledica izgube enakih delov vseh treh molekul, kar kaže na to, da le te spadajo v skupino podobnih spojin, ki se med seboj razlikujejo le po številu metilenskih skupin (-CH2-). Signali pri m/z 493/505/519 in 475/493/501 so nastali z odcepitvijo ene ali dveh molekul vode iz [M+H]+ ionov sarainov A, B in C. Iz zadnjih podatkov lahko sklepamo na prisotnost dveh hidroksilnih skupin v njihovi strukturi.


Ti izmerjeni podatki se ujemajo z objavljenimi lastnostmi sarainov A-C (Cimino in sod., 1989a, Guo in sod., 1996a), ugotovljenimi na podlagi analiz z visokoločljivostno masno spektrometrijo. Dalje smo s tehniko ESI-MS pojasnili še nove strukturne lastnosti teh spojin. Spekter na sliki 27 je posnetek vbrizgane raztopine sarainov A-C v metanolu brez dodatka mravljične kisline. Poleg signalov, ki ustrezajo psevdomolekularnim ionom M+H+ pri m/z 511, 523, 537, spekter pokaže tudi kompleksni skupek z velikostjo v območju m/z 1000. Lahko smo ugotovili, da gre za dimerne strukture, ki so nastale z intermolekularnimi interakcijami med dvema sarainoma v vseh mogočih kombinacijah (sarain A-A, sarain A-B, sarain A-C, sarain B-B, sarain B-C, sarain C-C), kar je povsem mogoče, ker so spojine lahko prisotne v amino-aldehidni ali ionsko dipolarni (ustreza tipu B na sliki 48) obliki, saj vbrizganemu vzorcu nismo dodali mravljične kisline, ki bi stabilizirala protonirano C obliko (slika 48). Manj polarne frakcije, sprane s stacionarne faze DIOL (slika 22) so vsebovale saraine in izosaraine tipa 1, 2, 3. Brez velikih težav smo jih lahko ločili od sarainov A-C. Poleg tega jih zlahka razlikujemo od sarainov A-C preko 1HNMR spektrov, kar opazimo s primerjanjem spektrov prikazanih na slikah 28 in 31, še posebej v območju pri 5.5-6.5 ppm, ki ustreza frekvenci protonov v dvojnih vezeh C=C. Analiza izvornega izvlečka sarainov z EI-MS nam poda naslednje informacije:

1. Saraine 1, 2, 3 pridobivamo v bolj blagih pogojih kot saraine A-C. Zadnji dajo manj intenziven molekularni vrh in to samo ob precej povišanih temperaturah (slika 24), kar se sklada z njihovo dipolarno naravo, ki je manj primerna za ta tip ionizacije kot ESI-MS.

2. Glede na lastnosti tehnike EI-MS se poleg molekularnih ionov tvorijo tudi fragmenti, ki so lahko pomembni za določitev strukture; še posebej spekter pri visoki ločljivosti prikaže signal pri m/z 327, za katerega je navedena zgradba C21H31N2O (Cimino in sod.,1989b) ki je skupna vsem sarainom 1, 2 in 3.

Čeprav je lahko ločiti saraine A-C od sarainov/izosarainov 1, 2, 3, se težave pojavijo tedaj, ko hočemo določiti ali spojina spada med saraine 1, 2, 3 ali izosaraine 1, 2, 3. Imena nam povedo, da gre za izomerne spojine, to je, da imajo enako molekulsko zgradbo (torej je signal MS pri isti vrednosti), ampak se razlikujejo po konfiguraciji v nekaterih asimetričnih centrih, kot je narisano na sliki 9. Samo dvodimenzionalni heterokorelacijski NMR spektri nam prikažejo majhne razlike med sarainom 1 in izosarainom 1 ali med sarainom 3 in izosarainom 3 (Guo in sod, 1996b). Izomerne spojine pa imajo drugačno optično aktivnost:

Sarain 1 : [α]D - 47,8° v CHCl3 (Cimino in sod., 1986b) Izosarain 1 : [α]D -23.1° v CHCl3 (Cimino in sod., 1989b) Sarain 3: [α]D -27.4 v CHCl3 (Guo in sod.,1996 b) Izosarain 3: [α]D -16.3°v CHCl3 (Guo in sod,1996 b)


Tako smo lahko na podlagi primerjanja objavljenih in izmerjenih sposobnosti rotacije opredelili katero od dveh izomer saraina obravnavamo. Določili smo, da čisti saraini predstavljajo sarain 1 (frakcija 6 DIOL 2), izosarain 1 (frakcija 8 DIOL 3/3) in sarain 3 (frakcija 6 DIOL 5, 8 DIOL 3/A, 3 DIOL 3/5, 8 DIOL 3/6). Spekter ESI-MS izvornega izvlečka kaže še številne vrhove, katerih število je višje od znanih sarainov. Na osnovi fragmentacijskih analiz, ki so navedeni v odstavku 4.3.3 bi ti vrhovi lahko ustrezali:

1. Novim članom te družine spojin, pri kateri imajo nekatere spojine na mestu –OH skupine –OCH3 skupino, saj so snovi z m/z 551, 499, 483 pri fragmentaciji izgubile eno molekulo CH3OH in eno molekulo vode.

2. Novim strukturnim različicam sarainov, kakršna bi lahko bila spojina z m/z 479 glede na sarain ali izosarain 3 (-H2). Fragmentaciji sta si zelo podobni: izguba ene molekule vode in dela vrednosti m/z 237. Žal jih zaradi časovnih razlogov nismo uspeli očistiti in tako bolj podrobno proučiti z drugimi spektroskopskimi metodami.

3. Signalom, ki jih pripisujemo skupkom molekul znanega saraina z vodo ali metanolom (topil, ki smo ju uporabljali za pripravo raztopine za vbrizgavanje). Ta hipoteza bi bila možna le za spojino z m/z 499, ki edina tvori tak fragment, ki bi ustrezal velikosti znanega saraina.

Izmed teh novih sarainov, prisotnih v manjši količini smo podrobno proučevali dva bolj prisotna. Sarain, ki pri ESI(+) tvori ion z m/z 525, torej ima molekulsko maso 524, pri fragmentacijski analizi izgubi molekulo vode in molekulo metanola, kar nakazuje na podobnost sarainom tipa A, B, C. Dalje lahko iz razlike v masi in dejstva, da mora vsebovati eno skupino -OCH3 namesto -OH, sklepamo, da spojina ustreza sarainu A, ki ima eno od dveh –OH skupin zamenjano s skupino -OCH3. To se sklada tudi z 1H-NMR spektrom (slika 37), kjer singlet pri 3.4 ppm pripisujemo trem ekvivalentnim protonom skupine -OCH3.

V frakcijah 8 DIOL 13/9, 8 DIOL 13/10 in 8 DIOL 14/3 (glej sliko 22) nam je uspelo, čeprav v manjši količini, izolirati do čiste spojine sarain, ki pri analizah MS tvori ion m/z 443. Njegov 1H-NMR spekter prikaže razširjene signale, ki so najverjetneje tipična posledica prisotnosti velikih obročev, ki se konformacijsko gibljejo tako hitro, da jih z NMR tehniko pri sobni temperaturi ne moremo proučevati. Dvodimenzionalne spektre korelacije 1H-13C smo izvedli v kanalu, kjer navadno snemamo protonske spektre, torej tudi z občutljivostjo meritve protonskega spektra, ki je višja od občutljivosti meritev spektra 13C, saj je tega izotopa v vzorcu zelo malo. Ti pogoji meritve nam omogočajo zaznavanje povezave različnih protonov v molekuli na ogljikova jedra: tako neposredno vezanih protoniov (v nadaljevanju impulzi HSQC) kot bolj oddaljenih (HMBC, slika 43).

Zares odločilna pa je bila masna spektrometrija, saj smo na podlagi meritev visoke ločljivosti odkrili, da gre za spojino z molekulsko formulo C30H54N2, ki je pokazala odsotnost -OH ali -CO skupine, ki je prisotna v ostalih sarainih. To se sklada tudi z dejstvom, da pri ESI-MS ne opazimo fragmentov, ki bi jih pripisali izgubi molekule vode, kar je sicer tipično za do zdaj odkrite saraine. Da je molekulska formula fragmenta m/z 237 C15H29N2, smo sklepali iz


meritve visoke ločljivosti. Ta fragmet je skupen sarainom in izosarainom 1, 2, 3 pri rezultatih EI-MS meritev, upoštevajoč tudi dejstvo, da te molekule ustvarjajo dobre spektre EI-MS v nasprotju z saraini A, B, C. Torej sklepamo, da ta nov sarain z m/z 525 spada med tip sarainov 1, 2, 3.

Na osnovi pravila za preračunavanje števila nenasičenih vezi (Ring double bond equivalent), smo ugotovili število nenasičenih vezi. Izračun lahko poenostavimo tako, da:

a) vsak trivaleten dušikov atom nadomestimo s CH

b) C30H54N2 ustreza C32H56N2

c) za spojine, ki vsebuje samo ogljikove in vodikove atome, lahko uporabimo formulo, pri kateri je:

št. nenasičenih vezi = [(2C+2)-H]/ 2 = [(2·32 +2)-56]/2 = 5

To pomeni, da sarain z molekulsko formulo C30H54N2 vsebuje 5 nenasičenih vezi, kjer pod nanasičene vezi štejemo dvojne, trojne vezi in obroče. Ker pri NMR analizah nismo zaznali dvojnih ali trojnih vezi, sklepamo, da gre za obroče. Strukture sarainov 1, 2, 3 so sestavljene iz petih obročev in z različnim številom dvojnih vezi (C=O ali C=C). Nov sarain, ki ima enako število ogljikovih atomov kot sarain ali izosarain 3, ima (brez upoštevanja stereokemijskih lastnosti) naslednjo strukturo (slika 49):

N

N

Slika 49: Struktura novega saraina (brez stereokemijskih lastnosti) z molekulsko maso 442.

5.2 BIOLOŠKA AKTIVNOST SARAINOV

Edino delo, ki obravnava biološke aktivnosti sarainov (Caprioli in sod., 1992) navaja 7 različnih testov. Od tega tri proučujejo potencialno insekticidnost in zaviranje razvoja žuželk (Macrosiphum euphorbiae, Tetranychus urticae, Aedes aegypti), ostali pa učinke na smrtnost morskih rakcev Artemia salina, inhibicijo tvorbe rastlinskih tumorjev z bakterijo Agrobacterium tumefaciens, inhibicijo razvoja jajčec morskega ježka in antibakterijsko aktivnost proti bakteriji Staphylococcus aureus. Dobljene minimalne inhibitorne koncentracije v µg/ml so 12.5 za sarain A, 25.0 za sarain B, 25.0 za sarain C, 50.0 za sarain 2, 6.25 za sarain 3, sarain 1 pa je bil označen za neaktivnega (njegova MIK je bila večja od 100 µg/ml).


5.2.1 Protibakterijska aktivnost Preverili smo vpliv sarainov na rast po Gramu negativnih in po Gramu pozitivnih bakterij ter ugotovili, da je inhibitorni učinek na G+ bakterije veliko večji. Med njimi lahko dalje ločimo dve skupini, znotraj katerih imata po dve bakteriji podoben profil inhibicije. Taki sta bakteriji Staphylococcus aureus in Staphylococcus epidermidis ter bakteriji Streptococcus agalactiae in Bacillus subtilis. Če primerjamo med sabo posamezne mešanice sarainov A, B in C v vzorcih 1, 2 in 3, ne opazimo velikih razlik med njimi, saj se njihove MIK gibljejo v enakem rangu, kar je v skladu tudi z že objavljenim delom (preglednica 3). Iz tega lahko sklepamo, da dolžina alifatskih verig v variabilnem delu ne vpliva bistveno na protibakterijske sposobnosti posameznega saraina, ampak je heteropoliciklično jedro tisto, ki določa biološko aktivnost. Vzorci 1, 1A in 1B vsebujejo enako mešanico sarainov (A, B, C), le da sta druga dva obdelana s kislino (A) oziroma bazo (B). Pri vseh bakterijah se kaže porast aktivnosti ob dodatku baze in padec le-te ob zakisanju vzorca (razen v primeru bakterije S .agalactiae). To potrjuje »efekt bližine«, razložen na začetku diskusije, ko se zaradi pH tvori protonirana oblika C (slika 48) in se ob tem spremenijo strukturno kemijske lastnosti in očitno tudi biološke lastnosti. MIK druge družine sarainov so višje, posebno pri obeh bakterijah vrste Staphylococcus, medtem ko pri bakterijah S. agalactiae in B. subtilis izstopa vzorec 5 (sarain 1), vzorec 6 (izosarain 1) pa je neaktiven. Mešanica inhibira rast bakterij bolj kot posamezna čista snov. Iz tega lahko zaključimo, da sta za biološko aktivnost pomembni tako velikost kot orientacija na heterocikle pripetih verig. To je prvi opravljen test o aktivnosti izosarainov. V literaturi objavljene MIK so nižje (glej preglednico 6), poleg tega jim je uspelo izolirati več čistih spojin, manjkajo pa spojine iz družine izosarainov. Kljub temu, da se MIK čistih spojin pri bakterji S. aureus ne ujema z našimi rezultati, so lastnosti inhibicije zelo podobne kot pri bakterijah S. algalactiae in B. subtilis. Vzroki za višje dobljene MIK so lahko prisotnosti nečistoč v vzorcu (raztopljen silikat) in morda različno občutljivi bakterijski sevi. Preglednica 6: Minimalne inhibitorne koncentracije (μg/ml) čistih sarainov proti bakteriji S. aureus. n.d. = ni določeno.

Caprioli in sod., 1992 Ta diplomska naloga Sarain A 12.5 n. d. Sarain B 25.0 n. d. Sarain C 25.0 250 Sarain 1 > 100 1000 Sarain 2 50.0 / Sarain 3 6.25 >1000


5.2.2 Hemolitična aktivnost Časovni potek hemolize je vedno imel začetno lag-fazo, nato pa strm potek hemolize, kar je značilno za hemolizo zaradi formiranja por v steni eritrocitov (slika 45). Iz tega lahko sklepamo, da ne gre za detergentsko delovanje, saj bi v takem primeru manjkala začetna lag faza. Saraini A, B, C imajo večjo hemolitično aktivnost od sarainov 1, 2, 3. Vzrok za to bi lahko bila drugačna zgradba, predvsem jedra, ki je pri sarainih A, B, C bolj strnjeno, nabite funkcionalne skupine so si bližje. Iz razlike med vzorcema 2 in 3 lahko ugotovimo, da sarain C povzroči hemolizo eritrocitov učinkoviteje od saraina A. Podobno kot pri protibakterijskem testu izosarain 1 ne kaže nikakršne aktivnosti. Vzorci 1A, 1B in 1 kažejo enako stopnjo hemolize. Zaključimo lahko, da protonacija ne vpliva na hemolitično aktivnost. To so prvi tovrstni podatki, saj Caprioli in ostali ne poročajo o testiranju membranskih aktivnosti sarainov.

5.2.3 Acetilholinesterazna aktivnost Časovni poteki inhibicije AChE so linearni, kar pomeni, da se inhibitor (v našem primeru sarain) v aktivno mesto encima veže reverzibilno s šibkimi vezmi. Encim acetilholinesteraze v sinaptičnih špranjah hidrolizira nevrotransmiter acetilholin. Hidroliza acetilholina poteka na dnu aktivnega žepa, globokega 2 nm, kjer ležita esterazno mesto z aktivnim serinom ter anionsko mesto s številnimi negativno nabitimi aminokislinskimi ostanki. Na samem vhodu v aktivni žep obstaja še eno aktivno mesto - periferno anionsko mesto (Quinn, 1987). Med ireverzibilnimi inhibitorji acetilholinesteraze so znani bojni strupi in insekticidi, med reverzibilnimi pa so tudi uporabni farmakološki pripomočki za zdravljenje ali blaženje simptomov nekaterih bolezni, povezanih z disfunkcijo encima ali s pomanjkanjem acetilholina, na primer Alzheimerjeve bolezni ali myastheniae gravis. Saraine na podlagi velikosti Ki uvrščamo med zmerno močne inhibitorje acetilholinesteraze. Na Dixonovih grafih se premice sekajo nad abscisno osjo in ne na njej, kar nam pove, da gre za reverzibilno kompetitivno inhibicijo. Tako sklepamo, da se saraini vežejo na anionsko mesto znotraj aktivnega žepa. To nam potrjuje tudi primerjava jakosti inhibicije protoniranega vzorca (1A), ki je bolj aktiven od enakega, vendar z bazo obdelanega vzorca (1B). Aktivnosti neobdelanega vzorca sarainov A, B, C (1) in protoniranega vzorca sta zelo podobni, kar nakazuje na to, da so saraini v pogojih testa najverjetneje v delno protoniranem stanju. Poleg naboja vpliva na inhibicijo tudi prisotnost planarnih aromatičnih obročev, ki se vežejo v aktivno mesto. Protonirano mesto saraina ionsko privlači dušik vezan v drugem obroču iste molekule, zato se


struktura postane rigidnejša in se laže in hitreje veže na z negativnimi naboji bogato aktivno mesto v žepu. Zmesi so bolj aktivne od posameznega čistega vzorca. To vidimo pri vzorcih 1 in 2 proti 3, ter 4 proti 5, 6 in 7. Zmes sarainov A, C je aktivnejša od zmesi sarainov A, B, C, najmanj aktiven pa je čisti sarain C. Sklepamo lahko, da je najaktivnejši sarain A, sledi B, kot zadnji pa C. Med saraini 1,2,3 ima predvidoma najvišjo aktivnost neizolirani sarain 2, saj je mešanica sarainov 1,2,3 občutno aktivnejša od ostalih izoliranih čistih sarainov, ki so si po aktivnosti enakovredni. Ne opazimo pa večje razlike med aktivnostjo sarainov 1,2,3 in A,B,C, čeprav so si po strukturi kar različni. Med saraini 1,2,3 ima nekoliko večjo Ki le izosarain 1, kar bi lahko bilo povezano s stereokemijskim značajem spojin. Dobljenih rezultatov ne moremo primerjati z drugimi avtorji, saj so to prvi tovrstni podatki za saraine.

5.3 SKLEPI

• Uspelo nam je izolirati skupino sarainov A, B, C in sarainov 1,2,3 in znotraj teh skupin tudi nekatere čiste komponente. Kot že prejšnji avtorji (Cimino in sod.) smo naleteli na številne nepravilnosti in težave ob izolaciji. Novejše tehnike (npr. HPLC) so se pri tej izolaciji izkazale za neuporabne.

• Molekule smo identificirali in njihovo strukturo karakterizirali z optično aktivnostjo,

predvsem pa z jedrsko magnetno resonanco (mono- in bidimenzionalno) ter masno spektrometrijo.

• Masna spektrometrija tipa ESI je bila prvič uporabljena pri študiju sarainov.

Omogočila nam je nov vpogled v strukturo sarainov A, B, C in pridobili smo nove informacije o teh spojinah.

• Izolirani in tudi delno okarakterizirani so bili dosedaj še neobjavljeni tipi sarainov.

Odločili smo se, da zaradi majhnih količin izolirane snovi ne z njimi bomo opravili bioloških testov.

• Saraini inhibirajo rast G+ bakterij Streptococcus agalactiae in Bacillus subtilis pri

koncentraciji od 0.1µg/ml do 0.5 mg/ml, Staphylococcus aureus in Staphypococcus epidermidis pa od 0.05 mg/ml do 1.5 mg/ml. Izosarain 1 ne inhibira rasti nobene od teh bakterij.

• Saraini povzročajo lizo govejih eritrocitov. Saraini A,B,C so membransko aktivni pri

masni koncentraciji 0.4 µg/ml, saraini 1,2,3 pa pri nekoliko višji masni koncentraciji (1 µg/ml).


• Saraini delujejo kot zmerno močni reverzibilni kompetitivni inhibitorji encima

acetilholinesteraze.


6 POVZETEK

Morske spužve zaradi svoje starobitnosti in edinstvene vloge v ekosisitemu že od nekdaj predstavljajo vir spojin nenavadnih kemijskih struktur in zanimivih bioloških aktivnosti. Med take spojine spadajo tudi saraini, izolirani iz kruhaste spužve Reniera sarai. Zaradi strukturne posebnosti “učinka bližine” je bila njena izolacija zapletena in dolgotrajna. Vendar nam je uspelo po večih zaporednih delnih ločitvah z adsorpcijsko kromatografijo na trdni fazi. Posamezne frakcije smo nato analizirali z masno spektrometrijo, optično spektrometrijo in jedrsko magnetno resonanco. Masni spektri so nam poleg znanih sarainov pokazali še dimere po dveh sarainov in še nepoznane spojine, ki bi tudi lahko spadale med saraine. Podrobneje smo očistili in opisali spojini z molekulsko maso 524 in 442, posneli njune tandemske masne spektre, NMR spektre, sučnost, UV spekter in IR spekter. Spojini z molekulsko maso 442 smo predvideli njeno strukturo. Ker nas je zanimal vpliv pH na biološke aktivnosti, smo mešanico sarainov A,B,C obdelali z dodatkom kisline oziroma baze in uporabili pri bioloških testih. Saraini inhibirajo celično rast testiranih G+ bakterij Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Bacillus subtilis. Pri tem so saraini A,B,C nekoliko učinkovitejši. Podobno velja za hemolitično aktivnost, oboji, tako saraini 1,2,3 kot A,B,C pa delujejo kot detergent na eritrocitno membrano. Zmerno močno inhibirajo acetilholinesterazo in sicer tako, da se s šibkimi vezmi reverzbilno veže v aktivno mesto. Vpliv obdelave s kislino oziroma bazo je viden pri antiacetilholinesterazni aktivnosti, na hemolizno aktivnost pa obelava ne vpliva. Izosarain 1 ni nima nobene od bioloških aktivnosti, testiranih v tej nalogi. Rezultati naloge niso revolucionarno odkritje, so pa pomemben, zaokrožen prispevek k študijam sekundarnih metabolitov morskih spužev in njenih aktivnosti. Novo odkrite spojine pa dokazujejo, da je prav na tem področju še veliko neodkritega zato zanimiv predmet raziskovanja.


7 VIRI IN LITERATURA

Aizenberg, J., Sundar, V.C., Yablon, A.D., Weaver, J.C., Chen, G. 2004. Biological glass fibers: correlation between optical and structural properties. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101:3358–3363

Becker, M. H.; Chua, P.; Downham, R.; Douglas, C. J.; Garg, N. K.; Hiebert, S.; Jaroch, S.; Matsuoka, R. T.; Middleton, J. A.; Ng, F. W.; Overman, L. E. 2007. Total Synthesis of (-) - Sarain A. Journal of the American Chemical Society, 129, 39:11987-12002

Baldwin, E.J., Whitehead, R.C., 1992. On the biosynthesis of manzamines . Tetrahedron Letters, 33: 2059-2062 Cha J.N., Shimizu K., Zhou Y., Christiansen S.C., Chmelka B.F., Stucky G.D., Morse D.E. 1999. Silicatein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 96: 361–365 Caprioli, V., Cimino, G., De Giulio, A., Madaio, A., Scognamiglio, G., Trivellone, E. 1992. Selected biological activities of sarains. Comparative Biochemistry and Physiology, 103b: 293-296 Cimino G., De Rosa S., De Stefano S., Sodano G. 1986a. Marine natural products: new result from Mediterranean intervebrates. Pure and Applied Chemistry, 58, 3: 375-386

Cimino G., De Stefano S., Scognamiglio G., Sodano G., Trivellone, E. 1986b. Sarains: a new class of alcaloids from the marine sponge Reniera sarai. Bulletin de la Société Chimique, 95, 9-10:783-800

Cimino G., Mattia C.A., Mazzarella L., Puliti R., Scognamiglio G., Spinella A., Trivellone E. 1989a. Unprecedented alkaloids skeletion from the mediterranean sponge Reniera sarai: X-ray structure of an accetate derivate of sarain A. Tetrahedron 45, 12: 3863-3872

Cimino G., Puliti R., Scognamiglio G., Spinara A., Trivellone E. 1989b. Amazing new alkaloid skeletions from the marine sponge Reniera Sarai. Pure and Applied Chemistry 61, 3: 535 - 538

Cimino G., Sgognamiglio G., Spinella A., Trivellone, E. 1990. Structural studies on saraine A. Journal of Natural Products 53, 6, 1519 – 1525

Davies J. E., Kirby J. A., Komarov I. V., 2003. Structural correlations for nucleophilic addition to the C=O group:The Solvation Angle, Helvetica Chimica Acta, 86: 1222-1233


Debitus C. 2005, Secondary metabolites of sponges. Pharmacological applications, lecture on Training course on biodiversity, phylogeny and ecology of Porifera. Toulouse (Francija), (julij 2005) http://www.marbef.org/documents/training/porifera/lectures/CecileDebitus/secondarymetabolitesofspongespharmacologicalapplications.pdf (april 2006): 48 str.

de Hoffman E., Charette J., Stroobant V. 1996. Mass spectrometry: principle and applications. 2nd ed. Paris, John Willey and sons, Masson Editeur: 340 str.

Denney R. C., Sinclar R. 1993. Visible and ultraviolet spectroscopy.5th ed. London, John Willey and sons:197 str.

Diamond P. S., Denman R. F. 1973. Laboratory techniques in chemistry and biochemistry. 2nd ed. London, Boston, Butterworths: 523 str.

Drevenšek P., Golobič A., Turel I., Poklar N., Sepčič K., 2002. Crystal structure characterisation and biological activity of cooper (II)-ciprofloxacin ionic compound. Acta Chimica Slovenica 49: 857 -870

Eğe N. S. 2004. Organic chemistry, structure and reactivity. 5th ed. Boston, Hughton Mifflin Company. 1164 str.

Ellman G. L., Courtney D., Andres V., Featherstone R. M. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology, 7: 88-95

Fusetani, N. (2004) Biofouling and antifouling. Natural Products Reports, 21:94–104

Garg, N. K., Hiebert, S., Overman L. E. 2006. Total synthesis of (-)- sarain A. Angewandte Chemie, International Edition, 45,18: 2912-2915

Ge S. C., Hourcade S., Ferdenzi A., Chiaroni A., Mons S., Delpech B. in Marazano C. 2006. A biogenetically based strategy towards the polycyclic core skeletion of sarain A. European Journal of Organic Chemistry, 18: 4106-4114

Guo Y., Madaio A., Trivellone E., Scognamiglio G., Cimino G. 1996a. Structural and stereochemical studies of saraines: macrocyclic alkaloids of sponge Reniera sarai. Tetrahedron 52, 24: 8341-8348

Guo Y., Madaio A., Trivellone E., Scognamiglio G., Cimino G.1996b. Further structures of Saraine-3 and Isosaraine-3; Absolute Stereochemistry of Saraine-1 and Saraine-2. Tetrahedron 52, 47: 14961-14974

Guo Y., Trivellone E., Scognamiglio G., Cimino G. 1998. Absolute stereochemistry of isosaraine-1 and isosaraine-2. Tetrahedron Letters. 463-466

Heathcock C. H., Clasby M., Griffith D. A., Henke B. R., Sharp M. J. 1995. Progress toward the synthesis of sarain A. Synlett, 467-474


Mancini I., Defant A., Guella G. 2007. Recent syntesis of marine natural products with antibacteria activities. Anti-Infective Agents in Medicinal Chemistry, 32: 17 – 48

Quinn, D. M. 1987. Acetylcholinesterase: enzyme structure, reaction dymanics, and virtual transition states. Chemical Reviews. 87: 955-979

Schmitz F.J., Hollenbeak K.H., Campbell D.C. 1978. Marine natural products: halitoxin, toxic complex of several marine sponges of the genus Haliclona. Journal of Organic Chemistry, 43:3916–3922

Sepčić K., Guella G., Mancni I., Pietra F., Dalla Sera M., Manestrina G., Tubbs K., Maček, P.,Turk T. 1997a. Characterization of acetilholinesterase-active 3-alkylpyrimidinium polymes from the marine sponge Reniera sarai in aqueous solutions. Journal of Natural Products, 60: 991 - 996

Sepčić K., Batista U., Vacelet J., Maček P., Turk, T .1997b. Biological activities of acqueus extracts from marine sponges and citotoxic effects of 3-alkylpyridinium polymers from Reniera sarai. Comparative Biochemistry and Physiology, 117C: 47 – 53

Sepčić K., Turk T. 2006. 3-alkylpyridinium compounds as potential non-toxic antifouling agents. V: Antifouling Compounds. Fusetani N, Clare A.S. (eds.). Berlin, Springer-Verlag: 105-124

Silverstein R. M., Webster, F.X. 2006. Identificazione spettroscopica di composti organici. za italiansko izdajo odgovorni: Casiraghi G., Pinna L. 2nd ed. Milano, Casa Editrice Ambrosiana: 481 str.

Synder L. R., Kirkland J. J., Lloyd R. 1979. Introduction to modern liquid chromatography. New York, John Wiley and Sons: 63 str.


ZAHVALA Za ponujeno možnost opravljanja praktičnega dela v tujini, stalno skrbno spremljanje, strokovne posvete, vsestransko pomoč in bližino, za spodbude in pohvale, ure posvečenega časa, izjemno razpoložljivost in človeško toplino mentorici prof. Kristini Sepćič. Desidero ringraziare la cara prof.ssa Ines Mancini per l’accoglienza premurosa, per la fiducia e la stima sincere, per l'aiuto nell'organizzazione del lavoro, per la pazienza dinanzi alla mia fatica di comunicare in una lingua diversa (sopratutto all'inizio), per avermi permesso di participare a vari corsi di biotecnologia e biologia molleculare, per le lezioni private di chimica organica e chimica strumentale, per la pofessionalità, la serietà e l’entusiasmo nelle ricerche, e infine per la sua disponibilità ad aiutarmi nei momenti in cui non riuscivo a risolvere i problemi.

Il prof. Graziano Guella per avermi ospitato nel suo dipartimento e per l’aiuto finanziario. Per la pazienza immensa nei miei primi passi nel laboratorio chimico, per la disponibilità e ogni “brava” senza prezzo un grazie grandioso a Mario Rossi.

Adriano Sterni per le centinaia di campioni anallizzati, la sua precizione e il suo aiuto tecnico.

Rita Frassanito, Andrea Defant, Claudia e Petra per la ospitalità nel loro ufficio e laboratorio, per l’aiuto, le informazioni nelle cose sia quotidiane che professionali. Per una nuova storia nata insieme con questa tesi, ma che continua ancora al mio fidanzato Stefano Dall’Olio. Hvala Heleni F., Mirjani ter sošolkam in sošolcem, ki so z mano delili koristne informacije in izkušnje. Nenazadnje hvala mojim staršem Janji in Stanotu Raspor, bratoma in sestram za potrpežljivost, spodbudo in podporo.

IZOLACIJA IN BIOLOŠKA AKTIVNOST SARAINOV IZ MORSKE … · tehnikama jedrska magnetna resonanca...

Documents

Transcript of IZOLACIJA IN BIOLOŠKA AKTIVNOST SARAINOV IZ MORSKE … · tehnikama jedrska magnetna resonanca...