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Sperimenta il Biolab Analisi molecolare di mala.e gene0che. Il caso della FIBROSI CISTICA Università degli Studi di Milano
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    03-Jul-2022
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FIBROSI CISTICA DEFINITIVAAnalisi  molecolare  di  mala.e  gene0che.   Il  caso  della  FIBROSI  CISTICA
Università  degli  Studi  di  Milano  
1.  Conoscenze  propedeu<che
1.1  Le  mutazioni   Nella  specie  umana  esistono  23  coppie  di  cromosomi  che  contengono  circa  21.000  geni. Le   mala:e   gene;che   sono   causate   da   mutazioni,   cioè   da   alterazioni   del   corredo   gene;co   (genoma)  di  un  individuo.  Se  le  mutazioni  avvengono  nelle  cellule  che  formano  i  game;,  cioè  nelle   cellule  germinali,  allora  possono  essere  trasmesse  alla  discendenza  dove  saranno  presen;  in  ogni   cellula  dell’individuo  affeFo.  Queste  mutazioni  possono  sorgere  come  mutazioni  nuove  nei  game;   di   uno   dei   genitori   oppure   possono   essere   ereditate   dai   genitori.   Viceversa   le   mutazioni   che   avvengono   nelle   cellule   soma;che   non   sono   trasmesse   alle   generazioni   successive,   ma   determinano   una   differenza   gene;ca   tra   le   cellule   dello   stesso   organismo   (mosaicismo).   La   conseguenza  può  essere  l’insorgenza  e  lo  sviluppo  di  un  cancro.  Le  mutazioni  possono  riguardare  il   numero   dei   cromosomi   (mutazioni   genomiche),   la   struFura   dei   cromosomi   (mutazioni   cromosomiche)  o  i  singoli  geni  (mutazioni  geniche).
1.1.2  Mutazioni  geniche Le   mutazioni   geniche   che   insorgono   all’interno   di   un   gene   possono   alterare   l’espressione   e   la   funzionalità  della  proteina  prodoFa  o,  se  insorgono  all’interno  delle  regioni  di  controllo  di  un  gene,  
possono  invece  influenzarne  il  livello  di  trascrizione.   Le  mutazioni  si  suddividono  in  (fig.  1): • sinonime:  sos;tuzione  di  una  base  del  DNA  con  
un   altro   codone   codificante   per   lo   stesso   amminoacido  
• missenso:  sos;tuzione  di  una  base  del  DNA  che   determina   l’inserzione   nella   proteina   di   un   diverso  amminoacido  
• non-­senso:   sos;tuzione   di   una   base   del   DNA   con   un   codone   di   stop   che   provoca   la   fine   prematura   della   sintesi   della   proteina   o   un   prodoFo  proteico  incompleto  
• frameshiR:  delezioni  o   inserzioni  di  un  numero   di  bp  non  mul;plo  di  3,  che  altera  la  leFura  dei   codoni  
• mutazioni   che   alterano   lo   splicing   (rimozione   degli   introni):   interessa   una   sequenza   nucleo;dica   cruciale   per   il   meccanismo   di   splicing    di  un  trascriFo  primario  di  RNA;  come   conseguenza  si  avrà  il  blocco  o  la  modificazione   dello  schema  di  splicing  di  quel  trascriFo,  con  la   mancata  produzione  del  mRNA  corrispondente   o  la  produzione  di  un  mRNA  modificato  
• ripe;zioni  di  tripleFe  
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Fig.   1:   ;pi   diversi   di   mutazione.   Le   mutazioni   pun;formi   (faFa   eccezione   per   le   mutazioni   sinonime)   e   le   piccole   delezioni   causano   quasi   sempre   la   produzione   di   una   proteina   con   funzionalità  alterata.
Per  descrivere  una  mutazione,   si   usa  una  nomenclatura  par;colare   che  permeFe  di   capire   se   la   mutazione  è  stata  descriFa  in  termini  di  cambiamento  nel  DNA  genomico  (g.),  nel  cDNA  (c.)  o  nella   proteina  codificata  (p.);  nel  caso  in  cui  la  mutazione  cada  in  un  esone,  si  indica  quale  amminoacido   è  coinvolto,   in  quale  posizione  si   trova  e  come  sia   stato  modificato   (se   sia   stato   sos;tuito  da  un   altro  amminoacido,  da  un  codone  di  stop  o  se  sia  stato  deleto);  nel  caso  in  cui  la  mutazione  sia  in   un  introne  si   indica  quale  nucleo;de  è  stato  modificato,   la  sua  posizione  (espressa  rela;vamente   all’ul;mo  nucleo;de  dell’esone  che  lo  precede)  e  con  quale  nucleo;de  sia  stato  sos;tuito.
1.2  Le  leggi  di  Mendel  e  le  malaBe  monogeniche Le   mala:e   ereditarie   monogeniche   sono   determinate   da   mutazioni   in   singoli   geni   che   si   trasmeFono  nelle   famiglie   secondo   leggi  ben  definite   scoperte  dall’abate  Gregorio  Mendel  nella   seconda   metà   dell’OFocento.   Per   questo   mo;vo   le   mala:e   monogeniche   o   monofaForiali   vengono  anche  chiamate  “mendeliane”.  In  par;colare  bisogna  ricordare  che  i  geni  possono  avere   alleli  diversi  (varian;  alterna;ve  di  uno  stesso  gene)  ossia  essere  polimorfici. Gli   organismi   diploidi   hanno   due   copie   di   ogni   gene,   cioè   due   alleli:   se   i   due   alleli   sono   uguali,   l’individuo   è   omozigote   (ad   esempio   ha   geno;po   AA   oppure   aa);   se   i   due   alleli   sono   diversi,   l’individuo  è  eterozigote   (ad  esempio   il  geno;po  è  Aa).  L’allele  dominante  si  manifesta  allo  stato   eterozigote,   quello   recessivo   è   mascherato   dall’allele   dominante   e   si   manifesta   solo   allo   stato   omozigote,   mentre   si   parla   di   codominanza   quando   si   hanno   due   alleli   dis;nguibili   entrambi   espressi  allo  stato  eterozigote,  che  agiscono  sul  feno;po  in  modo  indipendente. La  I   legge  di  Mendel  o  legge  dell’uniformità  della  prima  generazione  ibrida  afferma  che  l’incrocio   tra   individui  della  generazione  parentale,   ciascuno  omozigote  per  due  alleli  diversi  di  uno  stesso   gene   (ad   esempio   AA   x   aa)   e   che   quindi   differisce   dall’altro   genitore   per   una   caraFeris;ca   (ad   esempio  pelo  nero  o  marrone),  dà  una  progenie  cos;tuita  da  individui  tu:  eterozigo;,  iden;ci  tra   loro  (ad  esempio  Aa). Durante   la   meiosi   i   due   alleli   di   un   gene   segregano   e   si   distribuiscono   ciascuno   in   un   gamete   aploide   (II   legge   di  Mendel,   legge   della   segregazione).   Un   individuo   omozigote   produce   un   solo   ;po  di  gamete  (A  oppure  a)  rela;vamente  a  un  dato  locus  (la  posizione  occupata  da  un  gene  in  un   cromosoma).  Un  individuo  eterozigote  produce  due  ;pi  di  game;  (A  e  a)  in  ugual  quan;tà,  cioè  in   una   percentuale   del   50%   ciascuno.   Una   buona   rappresentazione   grafica   della   segregazione   si   o:ene  costruendo  il  “quadrato  di  PunneF”. Alleli  appartenen;  a  geni  diversi  localizza;  su  cromosomi  diversi  segregano  in  modo  indipendente   (III  legge  di  Mendel,  legge  della  segregazione  indipendente). L’1%   circa   dei   neona;   è   affeFo   da   una   mala:a   gene;ca   monogenica.   La   mutazione   genica   è   presente   fin   dal   concepimento   anche   se   non   sempre   si   manifesta   feno;picamente   alla   nascita.   Alcune   di   queste  mala:e   comportano   conseguenze   già   apprezzabili   nel   neonato.   Altre  mala:e   monogeniche  si  manifestano,   invece,  durante  le  età  successive  della  vita.  La  corea  di  Hun;ngton,   ad  esempio,  è  una  mala:a  gene;ca  a  insorgenza  tardiva  che  si  manifesta  solo  in  età  adulta. Si  definisce  mala:a  autosomica  quella  in  cui  l’allele  malato  è  presente  nelle  coppie  di  cromosomi   non  coinvol;  nella  determinazione  del  sesso,  gli  autosomi;  si  parla   invece  di  mala:a   legata  all’X   quella   in   cui   l’allele   si   trova   nel   cromosoma   sessuale   X.   In   questo   caso   la   trasmissione   segue   modalità  par;colari  in  quanto  la  maggior  parte  dei  geni  rappresenta;  sul  cromosoma  X  non  sono   rappresenta;   sul   cromosoma   Y.   Il   cromosoma   Y,   infa:,   è   molto   più   piccolo   e   con;ene   quasi  
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esclusivamente   i   geni   per   la   determinazione   del   sesso.   Nelle   mala:e   autosomiche,   se   l’allele   normale  è  dominante,  la  mala:a  si  rende  manifesta  solo  nella  condizione  di  omozigote  recessivo,   ossia  negli  individui  in  cui  entrambi  gli  alleli  del  gene  sono  altera;  (mala:a  autosomica  recessiva);   se  invece  è  l’allele  alterato  a  prevalere  su  quello  sano,  la  mala:a  si  rende  sempre  evidente,  anche   nella  condizione  di  eterozigote,  ossia  è  sufficiente  che  uno  solo  dei  due  alleli  sia  alterato  perchè  la   mala:a  si  manifes;  (mala:a  autosomica  dominante). Nelle   mala:e   legate   all’X,   se   l’allele   è   recessivo,   come   nella   maggior   parte   dei   casi,   i   maschi   ricevono  l’X  difeFoso  dalla  madre,  ma  non  possono  bilanciarlo  con  un  allele  sano  nell’Y  in  quanto   questo   cromosoma   non   con;ene   l’allele   corrispondente;   le   femmine   invece   manifestano   la   mala:a  solo  nella  condizione  di  omozigote.  Di  conseguenza  la  frequenza  delle  mala:e  recessive   legate  al  cromosoma  X  è  maggiore  nei  maschi  che  nelle  femmine.   Nel   caso   di   mala:e   dominan;   le   femmine   manifestano   la   mala:a   anche   nella   condizione   eterozigote.
1.2.2  Analisi  dei  pedigree Uno   degli   aspe:   della   gene;ca   è   lo   studio   dei   meccanismi   con   cui   i   geni   sono   trasmessi   dai   genitori  ai  figli.  A  tale  scopo  i  gene;s;  effeFuano  accoppiamen;  tra  organismi  della  stessa  specie,   per  analizzare   la  trasmissione  dei  caraFeri.  Nella  gene;ca  umana,  gli  accoppiamen;  sperimentali   ovviamente  non  sono  possibili.  Molte  delle  nostre  conoscenze  sull’ereditarietà  dei  caraFeri  umani   derivano  perciò  dalla  analisi  degli  alberi  genealogici  o  pedigree. In   pra;ca,   il   pedigree   è   la   rappresentazione   sistema;ca   della   storia   familiare   aFraverso   l’uso   di   simboli   standardizza;.   Il   pedigree   viene   s;lato   partendo   da   un’intervista   ai   componen;   di   una   famiglia,   al   fine   di   ricostruirne   la   storia   (anamnesi);   in   questo   modo   è   possibile   seguire   la   trasmissione  di  un  dato  caraFere  aFraverso  parecchie  generazioni  in  una  data  famiglia. L’analisi   del   pedigree   permeFe   di   determinare   se   il   caraFere   ha   una   modalità   di   trasmissione   recessiva  o  dominante  e  se  il  gene  in  ques;one  è  localizzato  su  un  autosoma  o  su  un  cromosoma   sessuale;   permeFe   in   ul;ma   analisi   di   informare   i   membri   di   una   famiglia   sulla   probabilità   di   trasmeFere  queste  mala:e  ai  propri  figli. Nell’analisi  del  pedigree  ci  si  basa  sui  principi  dell’eredità  di  Mendel  per  escludere   le  modalità  di   trasmissione   che   sono   incompa;bili   con   il   pedigree.   Ad   esempio,   la   presenza   nell’albero   genealogico  di  femmine  malate  ci  permeFe  di  escludere  la  trasmissione  legata  all’Y. Dall’analisi  di  un  pedigree  si  può  determinare  (talvolta  non  in  modo  univoco,  in  quanto  un  pedigree   può  essere  compa;bile  con  più  di  una  modalità  di  trasmissione  ereditaria)  come  viene  trasmesso   un  dato  caraFere.   Analizziamo   le   caraFeris;che   dei   pedigree   rela;vi   a   caraFeri   con   differen;   modalità   di   trasmissione: • autosomici   recessivi   (AR):     possono  
essere   affe:   sia   i   maschi   sia   le   femmine;   in  genere  gli   individui  affe:   hanno   genitor i   sani   (portator i   asintoma;ci).   I   genitori,   entrambi   portatori   sani,   hanno   il   25%   di   probabilità  di  avere  figli  mala;  ad  ogni  
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gravidanza;   l’incidenza   della   mala:a   aumenta   in   caso   di   consanguineità.   Tu:   i   figli   di   genitori   entrambi   affe:   (omozigo;)   sono   a   loro   volta   affe:   (fig.  2).  
• autosomici   dominan<   (AD):   possono   essere   affe:   sia   i   maschi   sia   le   femmine;   gli   individui   affe:   possono   essere   presen;   in   tuFe   le   generazioni   e   hanno   sempre   un   genitore   affeFo.   Poiché   i   geni   responsabili   di   mala:e   autosomiche   dominan;   sono   rari,   in   genere   gli   individui   affe:   sono   eteroz igo;.   Rar i ss imi   sono   g l i   omozigo;,   che   possono   nascere   solo   da   genitori   entrambi   eterozigo;.   Ogni   affeFo   (eterozigote)   ha   il   50%   di   probabilità   di   avere   figli   mala;;   individui   non   affe:   del   pedigree   che   sposano   individui   non   affe:   non   hanno   discenden;   affe:.   Genitori   entrambi   affe:   (eterozigo;)   possono   avere   figli   sani   (25%),  mentre   genitori   di  un  bambino  malato  possono  essere   sani,   non   portatori:   in   questo   caso   si   può  dedurre  che  la  mala:a  sia  indoFa   da   una   nuova   mutazione   verificatasi   durante   la   formazione   di   un   gamete   (mutazione  “de  novo”)  (fig.  3).  
• lega<   al   cromosoma   X   recessivi   (XR):   la  frequenza  della  mala:a  è  maggiore   nei  maschi  che  nelle  femmine,  le  quali   possono   essere   portatrici   sane.   Le   donne   portatrici   hanno   un   rischio   del   50%   di   avere   figli   maschi   mala;;   i   maschi   affe:   hanno   figlie   portatrici   sane   e   figli   maschi   sani,   mentre   la   madre   di   un   individuo   affeFo   è   portatrice   sana.   I l   caraFere   si   trasmeFe   a   zig-­zag   con   maschi   affe:   in   generazioni   diverse   (eredità  
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Fig.   2:     albero   genealogico   e   quadrato   di   PunneF   di   una   mala:a   a   trasmissione  autosomica  recessiva.
Fig.  3:  albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una  mala:a  a   trasmissione  autosomica  dominante.
 
 
• lega<  al  cromosoma  Y:  i  pochi  caraFeri   individua;   si   manifestano   solo   nei   maschi   e   sono   trasmessi   direFamente   da   padre   a   figlio   (eredità   olandrica)   (fig.  6).  
1.3  Eterogeneità  gene<ca   Per   alcune   mala:e   ereditarie   monogeniche   tu:   gli   individui   affe:   portano   un’iden;ca   mutazione:  l’anemia  falciforme  ne  è  un  esempio.     Per   molte   altre   mala:e   ci   sono   invece   più   mutazioni   che   possono   produrre   lo   stesso   quadro   patologico.  Quando   le  diverse  mutazioni   sono  a  carico  dello   stesso  gene  si  parla  di  eterogeneità   allelica.  Nel   caso   dell’emofilia   A,   ad   esempio,   il   catalogo  OMIM   riporta   270   varian;   alleliche.   La   fibrosi   cis;ca   è   causata   da   più   di   1000   mutazioni   diverse   nel   gene   CFTR.   Le   diverse   mutazioni   possono  produrre  feno;pi  di  gravità  diversa.     Nel  caso   in  cui   le  mutazioni  avvengono   in  geni  diversi  che  collaborano  alla  determinazione  di  un   feno;po,  si  parla  di  eterogeneità  di  locus.  Ad  esempio,  in  una  stessa  via  metabolica,  mutazioni  in   geni  diversi  possono  portare  alla   stessa  modificazione  del   feno;po.  E’   il   caso  delle  due   forme  di   ipercolesterolemia  familiare  A  e  B  dovute  rispe:vamente  a  mutazioni  del  gene  del  receFore  che   lega  le  lipoproteine  LDL  e  del  gene  della  apoproteina  B-­100  che  media  il  legame  delle  par;celle  LDL   al  receFore.  
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Fig.  5:  albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una  mala:a   a  trasmissione  X-­linked  dominante.  
Fig.  4:    albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una   mala:a  a  trasmissione  X-­linked  recessiva.  
Fig.    6:  albero  genealogico  e  quadrato  di  PunneF  di  una  mala:a   a  trasmissione  Y-­linked.
1.4  Pleiotropia Questo   conceFo   sta   a   indicare   che  un   solo   gene  può  essere   responsabile   di   feno;pi   diversi.  Un   esempio   di   pleiotropia   nell’uomo   è   quello   dell’anemia   falciforme,   una  mala:a   caraFerizzata   da   diversi   sintomi  a   carico  di  organi  e   tessu;  diversi.  Ques;  possibili   effe:   feno;pici  derivano   tu:   dall’azione  di  un   solo  allele  mutato  presente   in  omozigosi.   L’effeFo  direFo  dell’allele  dell’anemia   falciforme   è   quello   di   indurre   i   globuli   rossi   a   produrre   molecole   anomale   di   emoglobina   che   tendono  a  unirsi  fra   loro  e  cristallizzare.  Di  conseguenza,   i  globuli  rossi  si  deformano,  assumendo   forme   a   falce   con   contorni   frastaglia;,   sono   più   fragili   e   lisano   e   tendono   ad   aggregarsi   e   a   occludere  i  capillari.  TuFo  questo  produce  molteplici  danni  a  carico  di  organi  e  tessu;  diversi.
2.  Fibrosi  Cis<ca  
La   fibrosi   cis;ca   (CF)   è   la   mala:a   ereditaria,   autosomica   recessiva,   più   comune   nella   popolazione  caucasica  e  colpisce  un  neonato  su   2500-­3500   na;   vivi;   la   frequenza   dei   portatori   sani   (eterozigo;   asintoma;ci)   è   di   1/25-­30   individui.   La   patologia   interessa   molteplici   funzioni,   come   la   respiratoria,   la   diges;va   e   la   riprodu:va;   colpisce   sia   i   maschi   che   le   femmine   ed   è   caraFerizzata   da   un’anomala   regolazione   del   trasporto   degli   eleFroli;   da   parte  degli  epiteli  e  quindi  da  una  conseguente   alterazione   della   composizione   salina   delle   secrezioni  delle  ghiandole  esocrine  (fig.  7).   Spesso   nella   fibrosi   cis;ca   si   ha   la   completa   perdita   di   funzione   del   canale   del   cloro,   che   causa   la   produzione   di   secrezioni   disidratate   e   di  muco  denso.     In  tu:  gli   individui  colpi;,   le  ghiandole  sudoripare  producono  un  eccesso  di  sale,  nel  pancreas   il   muco   inspessito   blocca   il   trasporto   degli   enzimi   diges;vi,   con   conseguente   graduale   distruzione   della   ghiandola,   i   polmoni   producono   un   muco   denso   e   vischioso,   che   conges;ona   i   condo:   respiratori   rendendo   difficile   la   respirazione,   ed   infine,   nei   maschi,   il   muco   blocca   i   do:   che   portano  lo  sperma  con  la  conseguenza  che  solo  il  2-­3%  dei  maschi  colpi;  dalla  mala:a  è  fer;le.
2.1  Sintomatologia,  terapia  e  prognosi La   fibrosi   cis;ca   è   una   mala:a   cronica   progressiva   complessa,   non   ancora   guaribile,   ma   sicuramente  curabile.  CaraFeris;ca  della  mala:a  è  che   l’esordio,   l’en;tà  dei  sintomi  e   il  decorso   sono   estremamente   variabili.   Alcuni   mala;   possono   presentare   precocemente   gli   aspe:   polmonari  della  mala:a   (infezioni   respiratorie   ricorren;)  e   le  manifestazioni  gastrointes;nali   già   alla  nascita,   segui;  dalla   sindrome  da  malassorbimento  dovuta  all’insufficienza  pancrea;ca;   altri   hanno   sintomi   respiratori   contenu;   fino   all'adolescenza   con   quadro   diges;vo   normale;   per   altri  
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Fig.  7:  struFure  ed  appara;  colpi;  dalla  CF.
ancora   i   sintomi  predominan;   sono  quelli   dell'epatopa;a  o  del   diabete.   Le   forme  della  mala:a   diagnos;cate   in   età   adulta   hanno   come   manifestazione   episodi   di   pancrea;te   ricorrente   e   nei   maschi  frequentemente  si  ha  infer;lità.   La  prognosi  è  determinata  dall'en;tà  della  broncopneumopa;a  che,  nella  maggior  parte  dei  casi,  si   aggrava   nel   tempo,   ma   è   influenzata   anche   dallo   stato   di   nutrizione   (migliore   nei   sogge:   diagnos;ca;  precocemente)  e  dal  programma  di  cure. Gli  approcci  terapeu;ci,  spesso  combina;,  per  curare  la  fibrosi  cis;ca  sono:
• fisioterapia   respiratoria:   per   aiutare   a   liberare   le   vie   aeree   dal   muco   che   può   causare   infezioni  
• esercizio  fisico:  u;le  quale  forma  di  fisioterapia  e  per  il  benessere  generale   • terapie   farmacologiche:   somministrazione   di   diversi   farmaci   (mucoli;ci,   an;bio;ci   ecc.)  
assun;  per  via  inalatoria,  orale  o  endovenosa  per  ripulire  il  muco  e  combaFere  le  infezioni   • nutrizione  ed  assunzione  di  enzimi  pancrea;ci,  per  aiutare  a  digerire  il  cibo   • terapia   delle   complicanze:   specifiche   terapie   per   curare   le   complicanze   tardive   della  
mala:a  (sterilità,  diabete,  epatopa;a,  calcoli  biliari  ecc.)     • trapianto  d’organo,  in  par;colare  polmone  e  fegato  
L'aspeFa;va   di   vita   rimane   poco   prevedibile   individualmente;   mediamente   è   ridoFa   rispeFo   a   quella   della   popolazione   generale,   ma   va   progressivamente   aumentando   e   dipende   dalla   eterogeneità  clinica  della  mala:a.
2.2  La  proteina  CFTR La  fibrosi  cis;ca  è  causata  da  mutazioni  nel  gene  che   codifica   per   una   proteina,   chiamata   cys%c   fibrosis   transmembrane   regulator   (CFTR),   che   regola   la   secrezione   di   ioni   cloro,   sodio   e   bicarbonato   nei   tessu;  epiteliali   (fig.  8).  La  proteina  CFTR  appar;ene   alla   superfamiglia   dei   trasportatori   con   casseFe   che   legano  ATP,   denominate   ABC   (ATP   binding   casse:e),   ed  ha  diverse  funzioni:  proteina  regolatrice  del  pH  di   organelli   citoplasma;ci,   trasportatore   di   membrana,   cana le   i on i co   ed   è   anche   co invo l ta   ne l   processamento  di  glicoproteine.  La  proteina  con;ene   1480   amminoacidi   e   ha  massa   168142   Da,   con   una   localizzazione   intramembrana   di   circa   l’80%.   La   proteina   è   formata   da   due   regioni   idrofobiche   transmembrana,   ciascuna   cos;tuita   da   sei   α-­eliche   (TM   –   trans   membrane   helices)   e   da   una   regionecitoplasma;ca   aFa   a   legare   l’ATP   (NBD   -­   nucleo%de   binding   domain).   Un   grosso   dominio   centrale   di   regolazione   (R   domain)   collega   le   due   par;  della  molecola  e  presenta   si;  mul;pli  di   fosforilazione  da  parte  di  diverse   chinasi,   come   la   proteina  chinasi  AMP  ciclico  dipendente  (PKA)  o  la  proteina  chinasi  C  (PKC).  
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Fig.   8:   La   proteina   CFTR   è   localizzata   nella   membrana   plasma;ca   della   cellula   e   regola   il   movimento   degli   ioni   cloro   tra   i   due   la;   della   membrana.  Nella  maggior  parte  dei  casi  di  CF   la   proteina  è  priva  della  regione  1  di  legame.
Per   la   piena   funzionalità   del   canale   ionico   è   necessaria   la   dimerizzazione   della   proteina   CFTR,   indoFa  mediante  fosforilazione.    
2.3  Il  gene  CFTR Il   gene   CFTR   si   trova   sul   braccio   lungo   del   cromosoma   7,   in   posizione   7q31.2  (fig.  9).  E’  un  gene  molto  grande,  cos;tuito  da  27  esoni  distribui;   su   una   regione   di   lunghezza   pari   a   250188   basi.   La   fibrosi   cis;ca   può   essere   causata   da   più   di   1000   mutazioni   diverse   situate   in   qualunque   punto   del   gene,   ma   quelle   più   comuni   nella   popolazione   sono   rela;vamente  poche  (tab.  1  e  fig.  11);  in  tab.  2  sono  riportate  le  mutazioni   che   ricorrono   nelle   varie   regioni   italiane.   TuFe   le   mutazioni   sono   cambiamen;  di  un   singolo  nucleo;de   (mutazioni  missense,  nonsense)  o   di  un  piccolo  numero  di  nucleo;di  (mutazioni  frameshiR)  e  mutazioni  che   alterano   lo   splicing,   localizzate   prevalentemente   negli   esoni   o   nelle   giunzioni  tra  esoni  ed  introni,  più  raramente  negli  introni.  In  base  al  ;po  di   mutazione  si  hanno  diversi  effe:  sull'espressione  e  sulla  funzionalità  della   proteina.     Sono  state  individuate  sei  classi  di  mutazioni:  
• classe   I   (difeFo   di   produzione):   causano   l'interruzione  prematura  della   trascrizione  e   la   proteina  è  assente  
• classe   II   (difeFo   di   maturazione):   le   proteine   mutate   non   raggiungono   la   membrana   cellulare   e   vengono   degradate   nell'apparato   del  Golgi  
• classe   III   (difeFo   di   regolazione):   le   proteine   mutate   sono   presen;   sulla   membrana   cellulare,  ma  non  possono  essere  a:vate  
• classe   IV   (difeFo   di   trasporto):   le   proteine   mutate   sono   presen;   e   a:ve   sulla  membrana   cellulare,   ma   è   alterato   il   trasporto   degli   ioni   cloro  
• classe  V   (rallentata   sintesi):   si   verifica   la   sintesi   d i   p rote ine   norma l i ,   ma   in   quan;tà   notevolmente  ridoFe  
• classe   VI   (degradazione   precoce):   le   proteine   sono   normalmente   espresse   e   a:ve,   ma   vanno  incontro  a  degradazione  precoce.  
Poiché  la  mala:a  è  autosomica  recessiva,  un  soggeFo  malato  ha  entrambe  le  copie  del  suo  gene   CFTR  mutate  e   le  due  mutazioni  possono  essere  uguali  o  diverse  tra   loro.  Questo  è  una  ulteriore   causa  della  eterogeneità  clinica  della  mala:a.
 9
Mutazione Localizzazione %
c.621+1G>T introne  4 1,0
c.1898+1G>A introne  12 0,9
Tab.  1:  mutazioni  più  frequenti  nel  gene  CFTR;  p  e   c  indicano  rispettivamente  che  la  mutazione  è   descritta  nella  proteina  e  nel  cDNA;    >  significa   “cambia  in”,  X  significa  un  codone  di  stop;    +1   significa  che  è  coinvolto  il  primo  nucleotide   dell’introne  successivo  all’esone  che  termina  con   il  nucleotide  indicato  dal  numero  che  precede  il   segno  +.
 
 
 10
Tab.   2:   frequenza   percentuale   delle   12   più   frequen;   mutazioni   CFTR   nelle   regioni   italiane   (3442   cromosomi  CFTR)  (Rendine  et  al.  1997).
2.4  La  mutazione  p.F508del  (ΔF508) L a   mu t a z i o n e   p . F 5 0 8 d e l   ( d e l e z i o n e   dell’amminoacido  fenilalanina  F  in  posizione  508)   (fig.   10)   è   la   più   comune   nella   popolazione   nordeuropea   e   cos;tuisce   il   70-­80%   di   tuFe   le   mutazioni   della   fibrosi   cis;ca   in   molte   popolazioni.   In   Italia   questa   mutazione   rappresenta   il   51%   del   totale,   ma   con   una   notevole  variabilità  nelle  diverse  regioni.   Questa  mutazione,  appartenente  alla   II  classe,  è   determinata   dalla   delezione   di   tre   paia   di   basi   codifican;   per   la   fenilalanina   al   codone   508   e   causa   il   mancato   processamento   a   livello   del   re;colo  endoplasma;co  della  proteina  CFTR.     La   proteina   non   raggiunge   la   membrana   non   perché  la  sua  struFura  sia  dras;camente  alterata   dalla   mutazione,   ma   in   quanto   la   maturazione   post-­traduzionale  della  proteina  non  può  essere   completata  a  causa  della  mancanza  di  un  segnale   specifico   in   cui   è   coinvolta   la   F508.   La   proteina   con  la  delezione  F508  quindi  non  supera  il  severo   controllo  di  qualità  a  cui  sono  soFoposte  tuFe  le   proteine   a   livello   del   re;colo   endoplasma;co   e   quindi  viene  trasportata  ai  proteasomi  dove  viene   degradata.
2.5  La  diagnosi  di  fibrosi  cis<ca Nonostante   l’alta   frequenza   di   portatori,   per   la   fibrosi   cis;ca   è   difficile   realizzare   un   test   diagnos;co   di  massa   a   causa   della   variabilità   allelica   della  mala:a.   L'alterna;va   pra;cabile   è   la       diffusione  di  un  programma  di  screening  gene;co  nei  sogge:  che  hanno  probabilità  aumentata,   rispeFo  alla  popolazione  generale,  di  essere  portatori  del  gene  FC  o  rischio  aumentato  di  avere  la   mala:a.     Alla  nascita  si  esegue  un  test  basato  sul  dosaggio  della   tripsina  ema;ca  (enzima  pancrea;co  che   serve  per  digerire  le  proteine)  su  una  goccia  di  sangue  del  neonato  u;lizzata  anche  per  la  diagnosi   neonatale  di  altre  mala:e  gene;che.  Se   il   "test  della  goccia"  dimostra  che   i   livelli  di   tripsina  nel   sangue  sono  eleva;  non  è  deFo  che   il  bambino  sia  effe:vamente  affeFo  da  FC,  ma   il   centro  di   screening   richiama   la   famiglia   per   effeFuare   il   secondo   dosaggio,   tra   i   15-­20   giorni   di   vita   del   neonato.  L’elevata  concentrazione  di  tripsina  nel  sangue  è  probabilmente  dovuta  all'ostruzione  dei   do:   pancrea;ci,   condizione   presente   in   quasi   tu:   i   neona;   con   FC,   indipendentemente   dallo   sviluppo  successivo  di   insufficienza  pancrea;ca.   In  caso  di  valori  eleva;  di   tripsina   la  diagnosi  va   confermata  o  esclusa  ricorrendo  ad  altri  test.   Per  la  diagnosi  di  fibrosi  cis;ca,  in  prima  baFuta  si  esegue  un  semplice  esame  per  stabilire  il  livello   di   ioni   Na+   e   Cl-­  nel   sudore.  Un   an;co   proverbio   tedesco   del   XVII°   secolo   così   recitava:   “morirà  
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Fig.  10:  Classi  delle  mutazioni  del  gene  CFTR  e  i  loro  effe:   (Cimino  et  al.  2012).
presto   il   bambino,   la   cui   fronte   sa   di   sale   se   baciata”.   Nei   tempi   an;chi   nell’Europa   del   Nord,   durante   cerimonie  di  purificazione,   si   era   soli;   leccare   la   fronte  di  neona;  e  bambini.   Se   veniva   percepito  un  sapore   salato,   il  bambino  veniva  deFo  stregato  e  des;nato  a  morte  precoce.   In   tal   modo,   la   saggezza   popolare   aveva   già   an;cipato   quanto   l’osservazione   medica   avrebbe   poi   scoperto  negli  anni  ’50  e  la  ricerca  scien;fica  non  ancora  completamente  chiarito.  Infa:  il  testo  di   questo   an;co   proverbio   tedesco   ci   indica,   nella   concentrazione   di   sali   nel   sudore,   il   metodo   di   diagnosi   per   la   fibrosi   cis;ca.   È   proprio   questa   caraFeris;ca   del   sudore   par;colarmente   salato,   avver;to   dalle  madri   quando   baciavano   i   bambini   affe:,   che   farà   chiamare   la   fibrosi   cis;ca   “la   mala:a  del  bacio  salato”.   Per   la   diagnosi   gene;ca   si   usano   analisi   a   vari   livelli:   le   tecniche   di   primo   livello   ricercano   le   mutazioni   più   frequen;   del   gene   CFTR   (Reverse   Dot   Blot,   Amplifica%on   Refractory   Muta%on   Systems,  Oligonucleo%de  Specific  Allele  e  Oligonucleo%de  Liga%on  Assay).  Le  tecniche  di  secondo   livello,   che  analizzano   tu:  gli  esoni  e   le   regioni   limitrofe  cercando  variazioni  di   sequenza,     sono   esami   più   sensibili,   ma   di   più   difficile   interpretazione   perchè   evidenziano   anche  mutazioni   non   patologiche   (Denaturing   Gradient   Gel   Electrophoresi,   Denaturing   High   Performance   Liquid   Cromatography,  sequenziamento  dire:o).    Le  tecniche  di  terzo  livello  ricercano,  infine,  delezioni  ed   inserzioni   nella   sequenza   genica   (Quan%ta%ve   Mul%plex   Polymerase   Chain   Reac%ons   of   Short   Fluorescent  Fragments).  AFualmente  è  possibile  aggiungere  anche  un  quarto  livello  di  analisi  che  si   basa   sullo   studio   del   mRNA   che   permeFe   di   iden;ficare   mutazioni   negli   introni   che,   pur   non   adiacen;  agli  esoni,  causano  alterazioni  nello  splicing.   Nel  caso  della  gravidanza  di  una  coppia  cos;tuita  da  due  portatori  si  può  effeFuare  una  diagnosi   prenatale  per  sapere  se   il  nascituro  ha  ereditato  entrambi   i  geni  difeFosi  presen;  nei  genitori,  e   quindi  se  è  malato  di  fibrosi  cis;ca  o  meno.  Per  poter  eseguire  la  diagnosi  prenatale  è  necessario   aver   in   precedenza   individuato   i   geni   difeFosi   presen;   in   entrambi   i   genitori   e   talora   a   questo   scopo  può  essere  necessaria  un’analisi  gene;ca  in  altri  familiari.  Per  eseguire  la  diagnosi  prenatale   è  necessario  un  campione  di  DNA,  che  abitualmente  viene  oFenuto  con  un  prelievo  di  villi  coriali,   un  tessuto  placentare  che  con;ene  lo  stesso  DNA  del  feto,  eseguito  tra  la  decima  e  la  dodicesima   se:mana   di   gravidanza,   o,   più   raramente,   u;lizzando   cellule   contenute   nel   liquido   amnio;co,   oFenute   tramite   amniocentesi,   eseguita   tra   la   sedicesima   e   la   dicioFesima   se:mana   di   gravidanza.   L’analisi   prenatale   può   essere   effeFuata   anche   dopo   ecografie   che   mostrano   determinate  anomalie,  come  iperecogenicità  (aumento  della  densità)  delle  anse  intes;nali.   Sono  in  fase  di  studio  nuove  tecniche  per  la  diagnosi  prenatale  non  invasiva  (NIPD)  di  fibrosi  cis;ca   con  metodiche  analoghe  a  quelle  già  u;lizzate  per  la  diagnosi  di  patologie  cromosomiche;  durante   la  gravidanza  alcuni   frammen;  di  DNA  del   feto  e  della  placenta  circolano  nel   sangue  materno.   Il   DNA   fetale   è   rilevabile   sin   dalla   quinta   se:mana   di   gestazione,   la   sua   concentrazione   aumenta   nelle   se:mane   successive  e   scompare  dopo   il   parto.   Il   test   si   esegue  mediante   il   prelievo  di  un   campione   di   sangue   della   madre,   a   par;re   dalla   decima   se:mana   di   gravidanza,   da   cui   viene   isolato  il  DNA  fetale  libero,  presente  nel  circolo  materno  che  viene  successivamente  sequenziato.  
2.6  Il  vantaggio  seleBvo  degli  eterozigo< Perché   vi   è   una   notevole   diffusione   delle   mutazioni   del   gene   CFTR   nelle   popolazioni   di   pelle   bianca? La  teoria  del  vantaggio  del  portatore  ipo;zza  che  il  portatore  di  una  mutazione  CFTR  abbia  avuto,   in   tempi   remo;,   un   vantaggio   nella   salute   sugli   altri   individui   non   portatori,   per   la   resistenza   a  
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qualche   mala:a   cui   invece   il   resto   della   popolazione   era   susce:bile,   come   il   ;fo   o   il   colera,   mala:e  che  in  passato  hanno  scatenato  epidemie  gravissime.  Recentemente  una  ricerca  condoFa   in  una  popolazione  indonesiana,  in  un’area  in  cui  il  ;fo  è  endemico,  cioè  presente  abitualmente  in   quella  regione,  ha  confermato  che  effe:vamente  i  portatori  di  FC  hanno  un  rischio  di  contrarre  il   ;fo  molto  più  basso  dei  non  portatori. Nel  1994  Gabriel  et  al.,  usando  dei  modelli  murini  che  correlano  streFamente  con  feno;po  FC  per   quanto   riguarda   il   traFo   intes;nale   (omozigo;   recessivi,   eterozigo;   e   normali   rispeFo   al   CFTR),   hanno   dimostrato   che   i   topi   eterozigo;   per   il   CFTR   mutato   hanno   una   secrezione   (perdita   di   liquidi),  in  risposta  alla  tossina  colerica,  del  50%  inferiore  rispeFo  ai  topi  normali;  nessuna  risposta   è   riscontrata  nei   topi   con  CFTR  mutato  allo   stato  omozigote   in  accordo  alle  preceden;  evidenze   sull’uomo.   Come   nel   modello   animale,   nell’uomo   eterozigote   un   più   basso   livello   di   CFTR   funzionante   a   livello   intes;nale   si   dovrebbe   tradurre   in   un   meccanismo   prote:vo   che   evita   o   riduce  la  disidratazione  in  risposta  alla  tossina  colerica.   È   stato   inoltre   evidenziato   in   vitro   come   altri   baFeri   enteroinvasivi   come   E.   Coli   o   Salmonella   Dublin  possano  modulare  la  secrezione  di  cloro  e  la  funzione  di  barriera  intes;nale.   Pier   et   al.   ipo;zzano   che   il   ΔF508   eterozigote   possa   essere   prote:vo  nei   confron;  della   febbre   ;foide,   contribuendo   a   spiegare   perché   i   ΔF508   siano   così   diffusi   in   alcune   popolazioni.   Una   rassegna  del  U.S.  Cys%c  fibrosis  founda%on  registry  non  è  riuscita  a  trovare  un  solo  caso  di  febbre   ;foide  tra  i  pazien;  FC  (Prince,  1998).    
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Fig.  11:    prevalenza  approssima;va  alla  nascita  di  individui  affe:  da  FC  nel  mondo  e  rela;ve  mutazioni  più   frequen;  in  tali  regioni  (O’Sullivan  BP  and  Freedman  SD,  2009).
2.7  Tecniche  di  laboratorio  per  la  diagnosi  di  fibrosi  cis<ca   Analisi  di  primo  livello   • Reverse  Dot  Blot  (RDB)  
Prevede  una   reazione  di  PCR  mul;pla   in   grado  di   amplificare   contemporaneamente  differen;   regioni  del  gene.  A  questa  fa  seguito  una  reazione  di   ibridazione  colorimetrica  allele-­specifica,   che   si   basa   sull’ibridazione   dei   prodo:   di   PCR   con   sonde   molecolari   oligonucleo;diche   complementari  alla  sequenza  normale  e  alle  sequenze  mutate.  Il  metodo  è  rapido,  affidabile  e   non  prevede  l’u;lizzo  di  strumentazioni  sofis;cate.
• Amplifica0on  Refractory  Muta0on  Systems  (ARMS)   Prevede  una  reazione  di  PCR  (Polymerase  chain  reac%on   -­  amplificazione  di  una  parte  di  DNA   u;lizzando  un  enzima  chiamato  Taq  polimerasi  che  genera  un  nuovo  filamento  di  DNA,  a  par;re   da   un   innesco   chiamato   primer,   complementare   a   quello   in   analisi)   con   uno   dei   due   primer   costruito  in  modo  che  il  nucleo;de  in  posizione  3’  sia  complementare  alla  sequenza  mutata  o  a   quella  normale  del  gene.  Il  DNA  genomico  non  verrà  amplificato  quando  si  userà  il  primer  non   perfeFamente  complementare  alla  sequenza  in  esame.  La  visualizzazione  degli  ampliconi  viene   normalmente  eseguita  mediante  eleFroforesi  su  gel  di  agarosio  (tecnica  di  separazione  del  DNA   in  base  alla  massa  e  alla  generazione  di  un  campo  eleFrico).
• Oligonucleo0de  Liga0on  Assay  (OLA)   E’  basata  sull’u;lizzo  di  sonde  fluorescen;  specifiche  e  della  ligasi  termostabile  rTth,  un  enzima   per   la   riparazione   del   DNA.   La   reazione   di   PCR   con   sonde   complementari   all’allele  mutato   e   normale   è   seguita   da   una   reazione   di   ligasi   che   unisce   le   sonde   che   si   sono   legate   al   DNA   bersaglio,   discriminando   tra   quelle   con   complementarietà   completa   e   incompleta.   La   visualizzazione   dei   risulta;   avviene   mediante   eleFroforesi   capillare   su   sequenziatore   automa;co.  
Analisi  di  secondo  livello Come   per   le   analisi   mutazione-­specifiche,   anche   le   metodiche   di   II   livello   che   permeFono   di   effeFuare  lo  scanning  dell’intero  gene  alla  ricerca  di  eventuali  mutazioni  sono  piuFosto  numerose.   In  passato  il  sequenziamento  dell’intero  gene  CFTR  era  considerato  complesso  e  costoso  e  quindi   applicabile   solo   a   casi   molto   limita;.   Per   questo,   nel   corso   degli   anni   ’90,   sono   nate   e   si   sono   diffuse   numerose   tecniche,   che   permeFono   di   eseguire   uno   screening   delle   variazioni   nucleo;diche,   per   ridurre   al   minimo   le   analisi   di   sequenziamento.   Tra   queste   metodiche   ricordiamo  quelle  che  hanno  dato  i  risulta;  migliori,  permeFendo  di  iden;ficare  il  94%-­98%  delle   mutazioni   (la   percentuale   delle   mutazioni   non   iden;ficate   dipende   dalla   frequenza   dei   riarrangiamen;   genici   e   delle   mutazioni   localizzate   nelle   regioni   introniche):   DGGE   (Denaturing   Gradient  Gel  Electrophoresis)  e  D-­HPLC  (Denaturing  High  PerformanceLiquid  Chromatography).   In   ques;  ul;mi  anni,  vis;  i  progressi  della  tecnologia  legata  al  sequenziamento  del  DNA,  i  laboratori   di  gene;ca  molecolare  preferiscono  procedere  al  sequenziamento  completo  del  gene  CFTR  anziché   effeFuare  all’analisi  D-­HPLC. • Sequenziamento  direIo  del  DNA  
PermeFe   di   leggere   la   sequenza   di   basi   azotate  mutate,   pertanto   questa   tecnica   segue   le   preceden;  per  caraFerizzare  la  mutazione,  con  una  sensibilità  vicina  al  100%.  
• Denaturing  Gradient  Gel  Electrophoresis  (DGGE)  
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SfruFa  il  principio  che  la  temperatura  di  denaturazione  del  DNA  dipende  dalla  sua  sequenza   nucleo;dica  ed  è  peculiare  di  ogni  frammento.  Variazioni  di  un  singolo  nucleo;de  (mutazioni   o  polimorfismi)  modificano  la  temperatura  di  denaturazione  del  frammento  e  di  conseguenza   la  sua  mobilità.  La  variazione  nella  Tm  (temperatura  di  legame)  di  un  dato  frammento  di  DNA   può  essere  controllata  su  un  gel  di  poliacrilammide  a  concentrazioni  di  denaturan;  crescen;   poiché   il   raggiungimento   della   temperatura   di   denaturazione   (in   questo   caso   della   concentrazione   di   denaturante   ad   essa   equivalente)   comporta   una   parziale   apertura   della   doppia   elica   e   quindi   un   rallentamento   nella   progressione   del   frammento   sul   gel.   E’   una   tecnica  con  buona  sensibilità  (>95%),  ma  di  difficile  messa  a  punto  e  non  automa;zzabile.
• Denaturing  High  Performance  Liquid  Cromatography  (DHPLC)   Rappresenta   l’evoluzione   in   automa;co   del   DGGE   e   permeFe   l’iden;ficazione   di   varian;   nucleo;diche   in  brevissimo  tempo.  Si   traFa  di  una  cromatografia   ionica   in   fase   inversa  che   sfruFa,  in  condizione  di  parziale  denaturazione,  la  diversa  ritenzione  delle  molecole  di  DNA   in   assenza/presenza   di   variazioni   di   sequenza.   Ha   una   buona   sensibilità   (>95%)   ed   è   semiautoma;zzabile.  
Analisi  di  terzo  livello Tra   le   metodiche   che   permeFono   la   quan;ficazione   del   DNA   per   rilevare   la   presenza   di   riarrangiamen;   genici,   ricordiamo:   l’analisi   QMPSF   (Quan0ta0ve   Mul0plex   PCR   of   Short   Fluorescent   Fragments)   e   l’analisi   MLPA   (Mul0plex   Liga0on-­dependent   Probe   Amplifica0on).   Entrambe   si   basano   sull’amplificazione   simultanea   di   piccoli   frammen;   di   DNA   seguita   dalla   quan;ficazione   della   fluorescenza   di   ciascun   frammento   amplificato.   In   Italia   le   delezioni/ duplicazioni  hanno  una   frequenza  pari   al  2-­3%  e   le  delezioni  più   frequen;  sono:  delezione  degli   esoni   22-­23;   delezione   esoni   22-­24;   delezione   esone   2;   delezione   esoni   2-­3;   delazione   esoni   17a-­18;  delezione  esone  1.  Recentemente  sono  sta;  riporta;  dei  da;  oFenu;  mediante  la  ricerca   dei   riarrangiamen;   u;lizzando   la   tecnica   dell’array   CGH   (Array   Compara0ve   Genomic   Hybridiza0on),  tecnica  per  valutare  la  perdita  o  acquisizione  di  materiale  gene;co)  che  dimostrano   una   maggiore   sensibilità   e   specificità   del   sistema   e   hanno   permesso   l’iden;ficazione   di   estese   duplicazioni  non  evidenziabili  con  le  tecniche  QMPSF  e  MLPA.
3.  Tecniche  u<lizzate  in  laboratorio  per  la  diagnosi  di  malaBe  gene<che
3.1  Reverse  Dot  Blot  (RDB) La  tecnica  del  Reverse  Dot  Blot  fu  per  la  prima  volta  descriFa  nel  1989  da  Saiki  et  al.  e  u;lizzata  per   la  geno;pizzazione  HLA-­DQA  e  per  l’iden;ficazione  di  mutazioni  che  provocano  la  beta-­talassemia. Su   un   filtro   di   nylon   vengono   applica;   degli   oligonucleo;di   specifici   per   la   variante   normale   o   mutata   di   un   determinato   gene;   si   effeFua   una   ibridazione   sul   filtro   con   DNA   sano   o   mutato   oFenuto  mediante  PCR  con  un  primer  a  cui  è  aFaccata  una  molecola  di  bio;na  o  u;lizzando  dUTP   coniuga;  alla  bio;na  (Chehab  and  Wall,  1992). L’ibridazione   viene   rilevata   dopo   il   legame   della   strepdavidina   con   la   bio;na;   poichè   la   streptavidina  è  coniugata  con  una  perossidasi,   il   legame  tra  DNA  del  paziente  e   l’oligonucleo;de   viene  visualizzato  dalla  reazione  colorimetrica  in  seguito  al  traFamento  con  H2O2  (fig.  12).
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3.2  Sequenziamento Il   processo  di   sequenziamento  del  DNA  permeFe  di   iden;ficare   la   successione  di   nucleo;di   che   cos;tuiscono   il   frammento  da  analizzare.  Questa   tecnica   si  è  affinata  negli   anni,  permeFendo  di   iden;ficare   la   sequenza   di   DNA   di   varie   specie   in   tempi   brevi   e   con   cos;   contenu;   e   progressivamente  diminu;.  Il  sequenziamento  è  diventato  quindi  una  tecnica  di  elezione  anche  per   la  diagnosi  di  mala:e  gene;che. Le  metodologie  di  sequenziamento  del  DNA  sono  state  ideate  verso  la  metà  degli  anni  ’70,  ma  già   dieci  anni  prima   il  gruppo  di  Robert  Holley   fece   i  primi   tenta;vi  per   sequenziare   il   tRNA;  questo   metodo   prevedeva   la   diges;one   dell’RNA   con   RNAsi   sequenza-­specifiche,   il   frazionamento   degli   oligoribonucleo;di   risultan;   e   la   determinazione   dell’ordine   delle   basi   per   ogni   frammento   con   una  diges;one  ad  opera  di  un’esonucleasi.   Successivamente   vennero   fa:   mol;   tenta;vi,   tu:   rilevatesi   poi   poco   adegua;,   per   applicare   questo   metodo   al   sequenziamento   del   DNA,   aFraverso   il   taglio   in   frammen;   più   piccoli   con   l’endonucleasi  IV  o  con  elemen;  chimici.   Dieci   anni   dopo   vennero   proposte   due   nuove   tecniche:   Sanger   mise   a   punto   il   metodo   a   terminazione  di   catena,   in  cui   la   sequenza  di  DNA  single  strand  veniva  determinata  aFraverso   la  
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Fig.  12:   rappresentazione  del  reverse  dot-­blot:  sulle  sonde  posizionate  sul  filtro  viene  ibridato   il   DNA  di  vari  individui  di  una  stessa  famiglia  per  determinarne  il  geno;po.
sintesi  enzima;ca  di  catene  polinucleo;diche  complementari,  di   lunghezza  variabile  e   terminan;   con  nucleo;di  marca;,  mentre  Maxam  e  Gilbert   determinarono   la   sequenza  di   una  molecola   di   DNA  a  doppio  filamento  mediante  traFamento  con  reagen;  chimici  capaci  di  tagliare  la  molecola   in  posizioni  specifiche.   La  facilità  di  automazione  del  metodo  ideato  da  Sanger  e  la  tossicità  dei  reagen;  chimici  usa;  da   Maxam  e  Gilbert  hanno  contribuito  alla  maggior  diffusione  del  metodo  a  terminazione  di  catena.   Sanger  e  Gilbert  hanno  ricevuto  entrambi  il  Premio  Nobel  nel  1980. La  tecnica  di  sequenziamento  ideata  da  Sanger  prevede  l’u;lizzo  di  un  templato  di  DNA  a  singolo   filamento,   di   un   primer   specifico   per   l’avvio   della   reazione   di   polimerizzazione,   di   una   DNA   polimerasi,   di   normali   dNTPs  e  di   3’ddNTPs,   didesossinucleo;di  modifica;   con  un  atomo  di  H   al   posto  del  convenzionale  gruppo  -­OH  sul  carbonio  in  posizione  3’  dello  zucchero,  e  marca;  con  32P,   33P   o   35S   in   modo   da   renderli   iden;ficabili.   Quando   un   ddNTP   viene   incorporato   nel   nuovo   filamento,   a   causa   della   mancanza   del   3’-­OH,   non   può   formare   il   legame   fosfodiesterico   con   il   successivo  dNTP  e  pertanto  la  sintesi  del  filamento  si  arresta.  Poiché  la  polimerasi  non  è  in  grado  di   discriminare   tra   dNTPs   e   ddNTPs,   il   prodoFo   della   reazione   è   cos;tuito   da   una   popolazione   di   catene   di   nucleo;di   di   lunghezza   differente   in   base   alla   distanza   tra   il   primer   e   il   sito   di   incorporazione  del  ddNTP.   I   ddNTPs   vengono  aggiun;   in  quan;tà   inferiore