Facultad de Química-Farmacia Departamento de Farmacia

2009-2010

Facultad de Química-FarmaciaDepartamento de Farmacia

Autora: Saily Quesada Yero.

Tutora: Dra. Liliana Vicet Muro.Lic. Xiomara Cadenas Pérez.

Título: Evaluación preliminar de la capacidadantioxidante de extractos provenientes de las

hojas de Capraria Biflora. L.

Trabajo de diploma

“Por muy larga que sea la tormenta, el sol siempre vuelve a brillar entre lasnubes”.

Khalil Gibran

Dedicatoria

Saily Quesada YeroEvaluación preliminar de la capacidad antioxidante de los extractos provenientes de las hojas deCapraria Biflora.L

DEDICATORIA

A las personas que más quiero en la vida, Mis Padres por su esfuerzo continuo y

apoyo incondicional en cada camino que recorro y porque sin su apoyo no hubiese

podido culminar este trabajo y todas las metas que me he propuesto.

A mis abuelos por el amor y cariño que siempre me han dado.

Agradecimientos


AGRADECIMIENTOS

A mis padres por confiar siempre en mi y estar a mi lado cada ves que los he

necesitos.

A una persona que significa mucho para mí, Rafa, por haberme apoyado, y

por su constante preocupación.

A mi familia que siempre está a mi lado, tanto en tiempos buenos como

difíciles.

Agradezco a mis tutoras Liliana y Xiomarita por su dedicación y su paciencia,

a pesar de los tiempos difíciles que pasamos.

A la profesora Elisa que a pesar que no fue mi tutora directamente me dedicó

parte de su tiempo pasando también momentos difíciles junto a mí.

A los profesores del Departamento de Farmacia; gracias por ayudar en mi

formación profesional.

A mis hermanas Indira y Dunia por ocupar el lugar de esa persona que

siempre anhelé y que nunca pude tener.

A Clara y Carlos Alberto por enseñarme a crecer profesionalmente y por los

consejos que me dieron.

A todos mis amigos, a los de los viejos tiempos y a los de los nuevos también,

gracias por su grandiosa ayuda.

A mis compañeros de aula y de universidad por pasar momentos buenos y

malos.

A aquel que un día me dio una hoja y me prestó su lápiz, al que en algún

momento amargo me hizo sonreír, al que me escuchó, al que se mostró

espontáneo, al los que confiaron en mí y sacrificaron deliciosas horas de

sueño, en fin a todos aquellos que de una u otra forma me ayudaron.

Resumen

Saily Quesada YeroEvaluación preliminar de la capacidad antioxidante de extractos provenientes de las hojas deCapraria Biflora.L

ResumenCapraria biflora L. es una especie silvestre muy abundante en el Caribe, las Antillas y

en el continente americano. Conocida como esclaviosa o majuito, es utilizada para

enfermedades asociadas con el dolor y la inflamación. El presente trabajo tiene como

objetivo evaluar el efecto antioxidante de los extractos etéreo, etanólico y acuoso

obtenidos de hojas de Capraria biflora L. El material vegetal seco y molinado se

extrajo con éter de petróleo y etanol en equipo de Soxlhet y con agua por reflujo. Se

caracterizaron los extractos mediante el tamizaje fitoquímico y cromatografía en capa

delgada comprobándose la presencia de ácidos grasos, triterpenos y esteroides,

azúcares reductores, saponinas, fenoles y/o taninos y flavonoides. Se cuantificó el

contenido de flavonoides totales utilizando el ensayo con AlCl 3 y como resultado se

obtuvieron los valores de 53.33, 143.00 y 33.3 miligramos equivalentes a rutina por

gramo de extracto seco (mgER/gs) para los extractos etéreo, etanólico y acuoso

respectivamente. La actividad antioxidante se determinó evaluando la capacidad de

capturar radicales libres utilizando el método del 1.1- difenil-2-picrilhidracil (DPPH) y

el poder de reducir el Fe3+ a Fe2+ (poder reductor), como resultados se obtuvo que

los extractos poseen pobre actividad antioxidante en las condiciones evaluadas.

Índice

INTODUCCION 1

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

1.1. Consideraciones generales sobre el uso actual de las plantas

medicinales.

4

1.2. Scrophulariacea. 4

1.2.1. Antecedentes en el estudio químico de la familia Scrophulariacea. 5

1.3. Género Capraria. 5

1.3.1. Principales usos atribuidos a Capraria biflora L. 6

1.3.2. Antecedentes en los estudios químicos y biológicos de Capraria

biflora L.

6

1.4. Actividad antioxidante. 8

1.4.1. Generalidades. 8

1.4.2. Definiciones. 8

1.4.3. Principales fuentes de radicales libres. 9

1.4.4. Daños producidos por los radicales libres. 10

1.4.5. Enfermedades asociadas a procesos oxidativos. 11

1.5. Métodos para evaluar la actividad antioxidante. 11

1.5.1. Capacidad antioxidante total. 11

1.5.2. Métodos utilizados en estudios de la actividad. 12

1.6. Fitoterapia antioxidante. 14

1.7. Consideraciones finales. 15

2. MATERIALES Y METODOS 17

Reactivos, utensilios y equipos de medición. 17

Equipos empleados: 18

2.1. Recolección. 18

2.2. Secado y molinazo. 18

2.3. Obtención de los extractos. 19

2.4. Evaluación fitoquímica de los extractos. 19

2.4.1. Tamizaje fotoquímico. 19

2.4.2. Evaluación cromatográfica. 22

2.5. Determinación de flavonoides totales. 22

2.6. Actividad antioxidante de los extractos. 22

2.6.1 Actividad estabilizante del radical DPPH. 23

2.6.2. Medida del poder reductor. 23

3.RESULTADOS Y DISCUCION 26

3.1. Recolección. 26

3.2. Secado y molinazo. 26

3.3. Obtención de los extractos. 26

3.4. Evaluación fitoquímica de los extractos. 27

3.4.1. Tamizaje fotoquímico. 27

3.4.2. Evaluación cromatográfica. 28

3.5. Determinación de flavonoides totales. 31

3.6. Actividad antioxidante de los extractos. 32

3.6.1. Actividad estabilizante del radical DPPH. 32

3.6.2. Medida del poder redactor. 36

CONCLUSIONES 38

RECOMENDACIONES 39

BIBLIOGRAFIA 40

Introducción| 1 |

Saily Quesada YeroEvaluación preliminar de la capacidad antioxidante de extractos provenientes de las hojas de CaprariaBiflora.L

INTRODUCCIÓN

El uso de plantas como recurso terapéutico natural se remonta a tiempos muy remotos.

Muchas de las drogas, obtenida de plantas, que se encuentran incluidas en la terapéutica

moderna tuvieron un origen folklórico y se incluían en los sistemas tradicionales de salud

(Borgi, 2007). A pesar de la invasión farmacológica mundial, las personas siguen

recurriendo a los remedios vegetales para aliviar sus enfermedades comunes, por ello un

esfuerzo por regresar a los productos naturales representa un aporte muy significativo ya

que son un recurso que debe conocerse, usarse y cuidarse como parte del rico patrimonio

natural del país (Núñez, 1982).

El conocimiento de las propiedades terapéuticas de las plantas es un verdadero desafío

para la ciencia moderna, día a día se suman importantes investigaciones clínicas y se

descubren o confirman numerosos efectos benéficos, muchos de ellos ya conocidos por

culturas milenarias. Las plantas, en todo el mundo, no sólo han sido nuestra principal

fuente de alimentación y medicinas, sino la fuente de muchas de las aspiraciones, de los

mitos, de los significados simbólicos y de las conductas rituales humanas (Colaboradoresde Wikipedia, Fitoterapia)

Es indudable la importancia de las plantas para la medicina moderna. Durante mucho

tiempo los remedios naturales y las plantas medicinales fueron el principal e incluso el

único recurso del que disponía el médico; todas las culturas, a lo largo y ancho del planeta

y en todos los tiempos, han usado las plantas medicinales como base de su propia

medicina (Núñez, 1982). La industria farmacéutica se ha basado en los conocimientos

tradicionales para la síntesis y elaboración de fármacos, y el proceso de verificación

científica de estas tradiciones continúa hoy en día, descubriéndose constantemente

nuevas aplicaciones (Colaboradores de Wikipedia, Plantas medicinales). La sociedad

actual, demanda productos con menos aditivos químicos ya que, algunos de estos poseen

cierto grado de toxicidad. Es así, como los productores han sido forzados a remover

completamente el uso de antioxidantes químicos y adoptar alternativas para el

mantenimiento o extensión de la vida útil de sus productos. Es por ello que en los últimos

Introducción| 2 |


años se ha detectado un interés creciente por parte de la industria y de multitud de grupos

de investigación en estudiar especies vegetales, en busca de fuentes de antioxidantes

naturales con el fin de satisfacer las exigencias de los consumidores.

Los estudios sobre la actividad antioxidante constituyen, hoy en día, una parte muy

importante dentro del desarrollo de nuevos fármacos, el objetivo de los mismos es eliminar

los radicales libres de oxígeno del organismo los cuales son los causantes del daño

oxidativo y este se ha visto implicado en la etiología o patología de más de cien

enfermedades diferentes, entre las que se encuentran distintos tipos de cáncer,

enfermedades cardíacas y vasculares, diabetes y desórdenes neurovegetativos (Céspedes,2000).

La flora cubana presenta una diversidad tal que justifica el interés de su estudio

sistemático, con el objetivo de detectar la presencia y abundancia de productos que

puedan ser interesantes como materias primas de valor en diversos campos industriales o

de aplicación farmacéutica. Es importante destacar dentro de esta vegetación, la presencia

de numerosas plantas, endémicas o introducidas, que se han adaptado a nuestra

geografía y clima.

En Cuba, el uso de las plantas medicinales, como recurso terapéutico, ha adquirido en los

últimos años una relevancia fundamental por su probada efectividad e inocuidad, ya que

constituye la base para la elaboración de sistemas de medicina alternativa, como fuente de

materia prima para la industria farmacéutica, en la sustitución de materia prima de

importación para la elaboración de medicamentos y como arma terapéutica de los

sistemas médicos y fitoterapéuticos tradicionales (Areces, 2000).

Una de las plantas estudiadas en Cuba es la especie Capraria biflora L. conocida como

esclaviosa. Es una hierba silvestre usada frecuentemente por la población, especialmente

por la femenina, dadas sus múltiples aplicaciones (Roig, 1988). Esto ha despertado gran

interés en las investigaciones con esta planta medicinal comprobándose en estudios

anteriores varias acciones terapéuticas para el extracto acuoso (Acosta y col, 2003; Loy ycol, 2003; Vicet y col, 2004,) así mismo se identificó la presencia de varios flavonoides

Introducción| 3 |


(naringenina, derivados metoxilados de luteolina y apigenina, ácido 7-O-β-

apigeninglucurónico), un derivado clorofílico (feoforbide) y el manitol, informados por

primera vez para la especie (Vicet, 2009). A pesar de estos estudios la información

disponible para otros extractos de la planta y los mecanismos a través de los cuales se

ejerce la actividad farmacológica aun resulta insuficiente por lo que se requiere

profundizar en el conocimiento sobre este recurso natural por lo cual se plantea el

siguiente problema científico.

Problema Científico:

Según referencias bibliográficas la especie Capraria biflora L., presenta compuestos

químicos a los cuales se les atribuye la actividad antioxidante, pero este potencial no ha

sido evaluado para extractos procedentes de esta planta. Estos estudios pudieran

justificar un posible mecanismo de acción para sus propiedades terapéuticas.

Por tales razones en el presente trabajo se plantea la siguiente hipótesis:

Hipótesis:

La presencia de flavonoides en la especie Capraria biflora L., pudiera atribuir actividad

antioxidante a sus extractos.

Para comprobar dicha hipótesis se plantean los siguientes objetivos:

Objetivo General

Evaluar el efecto antioxidante de diferentes extractos obtenidos de hojas de Capraria

biflora L.

Objetivos Específicos

1. Caracterizar por tamizaje fitoquímico y cromatografía en capa delgada extractos

procedentes de Capraria biflora L.

2. Cuantificar los flavonoides como metabolitos con potencial antioxidante en los extractos

obtenidos a partir de las hojas de Capraria biflora L.

3. Evaluar el efecto antioxidante a través de técnicas in Vitro de los extractos en estudio.

Capítulo I: Revisión Bibliográfica |


4|

Capítulo I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1. Consideraciones generales sobre el uso actual de las plantasmedicinales.

Aunque no existe documentación escrita que permita determinar exactamente desde

cuando el hombre utiliza las plantas con funciones medicinales, resulta evidente que

esto ocurrió desde etapas muy tempranas de la evolución, e incluso mucho antes de

que apareciera la escritura y el lenguaje. Se dice, además, que los conocimientos

relacionados con las plantas medicinales se transmitían verbalmente de generación

en generación y no fue hasta que apareció la escritura que quedaron plasmados

estos conocimientos. El primer texto escrito sobre el uso de plantas medicinales tiene

unos 4000 años de antigüedad y aparece en una tablilla de arcilla en la cultura de los

sumerios, un antiguo pueblo que vivía al sur de los ríos Éufrates y Tigris, lo que

equivaldría al actual Irak (Euskaltegi, 2001). El hombre empleaba estas plantas

como métodos curativos o para aliviar de cierta forma las enfermedades o dolores

que le aquejaban. Así se descubren muchas propiedades de las mismas,

denominadas desde ese entonces “plantas medicinales”; las cuales son un conjunto

de especies que poseen principios químicos conocidos como metabolitos activos,

que proporcionan diferentes utilidades a la nutrición y que se aplican al campo de la

medicina. (Wu, 2000).

Actualmente, ha cobrado vigencia y gran interés, la utilización de los productos

naturales, dentro de los cuales se encuentran las plantas medicinales, no solo para

tratar padecimientos ya existentes, si no también para prevenir la aparición de los

desórdenes de la salud; esto, fundamentalmente guiado por la existencia de

numerosas evidencias de su actividad terapéutica y porque en la mayoría de los

casos, son más seguros en función de presentar menores contraindicaciones y

efectos secundarios, que los encontrados en los productos de síntesis.

1.2. Scrophulariacea



5|

La especie objeto de estudio en este trabajo pertenece a la familia Scrophulariacea,

orden Scrophulariales (Cronquist, 1981). Esta familia esta compuesta por

aproximadamente 220 géneros y unas 3 000 especies. Las plantas suelen ser

herbáceas, anuales o perennes, algunas semiparásitarias y en pocas ocasiones

árboles. Son caracteres anatómicos, los pelos glandulosos en los que las glándulas

están divididas solamente por membranas verticales y los estomas rodeados por tres

o mas células epidérmicas. Algunas especies son medicinales y otras muy útiles

como ornamentales (Evans, 2000).

1.2.1. Antecedentes en el estudio químico de la familia Scrophulariacea

De manera general los compuestos que más se informan son saponinas,

naftaquinonas y antraquinonas, auronas, iridoides, esteroides y triterpenos, y

heterósidos cianogénicos, (Grayer-Barkmeijer, 1973; Taskova y col., 2002;Evans, 2000). La presencia de flavonoides parece ser muy común en esta familia

(Nikolova y Asenov, 2006; Saracoglu y col. 2004) en especial en los géneros

Verónica y Digitalis (Senatore y col., 2007; Doo-Youn Choi y col., 2005). Los

géneros más conocidos son Digitalis, Verbascum, Calceolaria, Linaria y Verónica,

entre otros (Evans, 2000).

1.3. Género Capraria

El género Capraria al que pertenece la especie Capraria biflora es de los menos

conocidos y poco abordados en la literatura especializada. Las plantas de este

género se utilizaron como bebida por los aborígenes americanos al igual que por los

pobladores de origen europeo (Edwin, 1971). La especie Capraria biflora L. en

particular es usada como té de hierbas (Tanaka, 1976; D’Arcy, 1979; Morton 1981)y algunos autores le atribuyen una acción análoga al té de China (Edwin, 1971;Ideker, 1996) y es la única de su género a la que se le confieren usos medicinales.

Esta planta se conoce en nuestro país por varios nombres, escabiosa o esclaviosa,

magüiro o magüira, majuito o viuda (Roig, 1988). Es conocida por otros nombres en

otros países del área caribeña, como té del país en Puerto Rico, escobo en



6|

Colombia, en México como claudiosa; coat-weed en EUA y Jamaica (Morais y col.,1995), fregosa en Venezuela; en Martinica como the d´Amerique; the du pays en

Guadalupe y chá-de-Calcada en Brasil (Matos, 1994).

1.3.1. Principales usos atribuidos a Capraria biflora L.

La medicina Natural le ha atribuido muchos usos medicinales a esta especie, así por

ejemplo, Roig (1988), la reconoce como tónico digestivo, antidiarreico, útil en las

neumatosis y como astringente en las heridas; en baños o loción en afecciones

ováricas y uterinas; en tratamiento a recién paridas, en la leuco y gonorrea, y en la

diabetes. Delens y col (1992) la informan para el tratamiento de la fiebre provocada

por la malaria y Morais y col (1995) como sudorífica, febrífuga y en afecciones del

tracto urinario. Las hojas son usadas además para aliviar algunos desordenes

dérmicos, como escabiosis y escozor (Craveiro y col, 1984). También se refiere su

uso en el tratamiento de dolor de oído, hemorroides, reumatismo y procesos

inflamatorios (Scofield, 2002).

En Perú se emplea para el tratamiento del asma bronquial como planta sintomática

por su acción como descongestionante local y disminución del estado de ansiedad,

permitiendo un mejor efecto terapéutico de otras plantas curativas o de sostén (Villary Villavicencio, 1994). En Brasil, se preparan tinturas antisépticas, a partir de la raíz,

que se aplican en forma de compresas y lavados como tratamiento local y preventivo

en heridas infectadas (Matos, 1994). En Jamaica es empleada para el tratamiento

de la fiebre, la influenza e indigestiones (Mitchell y Ahmad, 2006).

En estudios desarrollados recientemente se comprobó que el extracto acuoso

obtenido a partir de la planta, posee un potente efecto antiinflamatorio; relacionado

con la presencia de flavonoides en su composición (Vicet, 2009).

1.3.2. Antecedentes en los estudios químicos y biológicos de Capraria biflora L

Los primeros trabajos fitoquímicos se desarrollaron por Gongalves de Lima en1954, al aislar a partir de las raíces de la planta, un principio activo con actividad

antimicrobiana frente a bacterias gram positivas y otros gérmenes. La sustancia



7|

denominada biflorina, se identificó como una naftoquinona, a través de técnicas

espectroscópicas (Prelog y col, 1958; Comin y col., 1963). Otras investigaciones

desarrolladas con esta molécula permitieron verificar la actividad citotóxica y el

potencial antioxidante de la biflorina tanto in vitro (Vasconcellos y col., 2005) como

in vivo (Vasconcellos y col., 2007). En 1995, Morais y col, reportaron la presencia

de compuestos tipo taninos, en abundancia en los extractos acuosos de la planta,

aunque no se informaron las características estructurales de los mismos.

En otro estudio realizado en el año 2000 en el Departamento de Química de la

Universidad de Indias Occidentales (Jamaica), Collin y col, informaron el aislamiento

de cuatro compuestos de estructura sesquiterpenoide, a partir del extracto de n-

hexano de las partes aéreas de Capraria biflora L., donde dos de estos compuestos

presentaron acción insecticida, dosis dependiente, frente al Cylos formicarius

elegantulus (gorgojo del boniato). Recientemente, Fonseca y col (2006) realizaron la

caracterización por cromatografía gaseosa acoplada a espectrofotometría de masa

del aceite esencial obtenido por hidrodestilación de las hojas, demostrando la

presencia de 9 compuestos, siendo los sesquiterpenos β-caryofileno y el γ-muroleno,

los componentes mayoritarios.

Estudios fitoquímicos desarrollados al extracto acuoso procedente de las hojas de

esta planta permitieron identificar la presencia de naringenina, derivados metoxilados

de luteolina y apigenina, un derivado glucosilado de apigenina (ácido 7-O-β-

apigeninglucurónico), un derivado clorofílico (feoforbide) y el manitol, informados por

primera vez para la especie. Se identificaron, por cromatografía gaseosa, los ácidos

laúrico, palmítico y hendecanoíco (Vicet, 2009).

Es importante destacar que la presencia en la planta de las moléculas citadas en

este epígrafe, no explican la totalidad de los usos de Capraria biflora, L. en la

medicina popular, particularmente sus acciones en enfermedades asociadas a

procesos oxidativos, lo cual justifica el desarrollo de la presente investigación.



8|

1.4. Actividad antioxidante

1.4.1. Generalidades

La relación que existe entre la concentración de radicales libres y el estado de salud

de los seres humanos es un hecho aceptado en la actualidad por la comunidad

científico-médica. Vocablos nuevos, tales como estrés oxidativo, actividad

prooxidante y producto antioxidante, son cada vez más comunes y el interés sobre el

tema es también más creciente, lo que ha provocado la aparición de miles de

productos, de origen natural o sintético, con el calificativo de «antioxidantes», con lo

cual se quiere significar la capacidad de disminuir la concentración de radicales libres

en el organismo humano y, por tanto, mejorar el estado de salud de quien lo

consume (Martínez y col., 2003).

1.4.2. Definiciones

Una especie oxidante es aquella capaz de aceptar electrones de modo que va a

generar un desequilibrio electrónico en las moléculas vecinas. En tanto un radicallibre es una especie química definida, que tiene en su estructura uno o más

electrones no pareados, caracterizada por su elevada reactividad y capacidad de

formar otros radicales libres por reacciones químicas en cadena. A diferencia de las

especies químicas que poseen una carga eléctrica (iones), que son generalmente

estables en los medios más comunes, muchos radicales libres son inestables, por lo

que tienden a reaccionar muy rápidamente con otros componentes químicos

(Martínez y col., 2003).

El término especies reactivas del oxígeno es un término colectivo que incluye

radicales libres (·OH, ROO·, HOO·, O2·-, NO·, RO· y NO2·) y ciertas especies no

radicales (O2, O3, ROOH, HClO, HNO2, NO2+, ROONO, ONOOH, HBrO, H2O2 y

ONOO·) que son oxidantes y/o se convierten fácilmente en radicales libres

(Góngora, 2002; Halliwell y Whiteman, 2004 y Schinella y col. 2004).

El balance oxidativo del organismo humano es esencial para la regulación

metabólica, la producción de energía metabólica, la activación o inactivación de



9|

biomoléculas, la transducción de señales, el recambio celular y el control del tono

vascular, entre otros. Si este balance entre los sistemas oxidantes (generadores de

especies reactivas) y los antioxidantes (preventivo, secuestrador y reparador) se

desequilibra a favor de los primero se estará en presencia de lo que se conoce como

estrés oxidativo. Este desbalance puede deberse ya sea por la producción excesiva

de especies reactivas o el debilitamiento de los sistemas antioxidantes o incluso por

un efecto combinado (Martínez y col., 2003).

Un antioxidante se define entonces, como cualquier sustancia que cuando está en

presencia de un sustrato oxidable, retrasa o previene la oxidación del mismo (Mataixy Battino, 2002). A pesar del daño oxidativo que pueden originar los radicales libres

y especies reactivas, el organismo cuenta con una serie de sistemas de defensa

antioxidante que intentan neutralizar la agresión. Estos sistemas de defensa

antioxidante están constituidos por compuestos de naturaleza enzimática como:

superóxido dismutasa, catalasa, glutation peroxidasa, y compuestos de naturaleza no

enzimática como: vitamina E, β-caroteno, vitamina C, glutation reducido, albúmina,

flavonoides y metales de transición como Se, Cu, Zn, entre otros (Kusoski y col.,2004).

1.4.3. Principales fuentes de radicales libres

Aunque ciertas condiciones ambientales favorecen la formación de especies

reactivas y radicales libres, los procesos fisiológicos normales del organismo generan

cierta tasa de estas sustancias oxidantes. Las principales fuentes endógenas de

especies oxidantes y radicales libres en el organismo son: la respiración mitocondrial

(O2·-), la activación de polimorfonucleares (HOCl, 1O2, HO· y H2O2), el metabolismo

del ácido araquidónico (O2·-), las acciones enzimáticas (O2·-), NO y H2O2) y la

catálisis por liberación de hierro y cobre (HO·), entre otras (Fang y col, 2002 y Lee ycol, 2004).

Dentro de las fuentes de producción exógena de radicales libres se destacan la

acción de factores externos, entre los cuales se encuentran la contaminación



10|

ambiental, las radiaciones, los hábitos tóxicos (tabaco, alcohol y estupefacientes), la

alimentación inadecuada, la exposición a sustancias tóxicas (fertilizantes y

pesticidas), el metabolismo de algunos fármacos, un elevado estrés físico y/o

psíquico y la acción de células del sistema inmunológico (Beckman y Ames 1998;Martínez y col, 2003).

1.4.4. Daños producidos por los radicales libres

Los radicales libres alteran el buen funcionamiento de las células de nuestro

organismo, atacando a componentes estructurales claves de las mismas, tales como

carbohidratos, lípidos y proteínas de la membrana celular, enzimas e incluso al ADN,

responsable del funcionamiento y renovación celular, produciendo efectos como los

que se describen a continuación:

Carbohidratos: Son dañados en menor proporción que otras moléculas.

Monosacáridos como la glucosa, el manitol y ciertos desoxiazúcares pueden

reaccionar con el radical hidroxilo produciendo sustancias reactivas (Blake y col,1987).

Lípidos: Los ácidos grasos poliinsaturados, son las moléculas biológicas más

susceptibles a desarrollar procesos de oxidación no controlados, inducidos por

radicales libres (estrés oxidativo). Esto se traslada en daños significativos en las

membranas celulares, desestabilizándolas y alterando todos los procesos

bioquímicos celulares (peroxidación lipídica) (Cheeseman y Slater, 1993).

Esta peroxidación es el efecto más importante de los radicales libres en la célula, ya

que la destrucción de los ácidos grasos poliinsaturados, junto con la formación de

puentes disulfuros en las cadenas protéicas y su ruptura, provoca un

desmoronamiento de la estructura de la membrana que conduce a la pérdida de la

permeabilidad y, por tanto, a la muerte celular (Ursini y col, 1982).

Proteínas: Las consecuencias biológicas más graves son la oxidación de enzimas,

con la consiguiente pérdida de la funcionalidad y de las proteínas estructurales, lo



11|

que produce alteraciones graves en la arquitectura celular (Halliwell y Gutterid,2000).

ADN: Las reacciones del radical hidroxilo tanto con bases púricas como pirimidínicas

así como con las pentosas ribosas y desoxirribosa, produce aberraciones

cromosómicas, reacciones de entrecruzamientos y, en muchos casos la ruptura de

las hebras del ADN. Los daños producidos pueden escapar a los mecanismos de

reparación, dando lugar a mutaciones, cáncer o a la muerte celular (Davies, 1994).

1.4.5. Enfermedades asociadas a procesos oxidativos

Las evidencias experimentales sugieren que los radicales libres (RL) y las especies

reactivas de oxígeno (ERO) pueden estar relacionadas con un gran número de

enfermedades.

El estrés oxidativo y la peroxidación lipídica son los causantes de un gran número de

enfermedades crónicas que incluyen cáncer, enfermedades cardiovasculares ,

cataratas, enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, diabetes mellitus,

artritis reumatoide, neurodegeneración en enfermedades de las neuronas motoras,

inflamación y fallo renal (Cheng y col, 2003)

1.5. Métodos para evaluar la actividad antioxidante.

La actividad antioxidante se relaciona con compuestos capaces de proteger un

sistema biológico del efecto potencialmente dañino de procesos que causan excesiva

oxidación, involucrando especies reactivas del oxigeno. Existen diversos métodos

para la evaluación de la capacidad antioxidante de muestras biológicas. Algunos de

ellos utilizan la producción de un radical orgánico o especies reactivas del oxígeno y

otros se basan en la oxidación-reducción de iones metálicos. Un ensayo universal de

la actividad antioxidante in vitro no existe, debido a que la actividad antiradicalaria

depende fundamentalmente de la naturaleza del radical y del método de generación

del mismo. (Aruoma, 2003).

1.5.1. Capacidad antioxidante total



12|

Se han desarrollado varios métodos espectrofotométricos para la determinación del

potencial antioxidante de diferentes sistemas bioquímicos. La eficacia antioxidante de

las muestras ensayadas se compara con patrones conocidos como ácido ascórbico

(vitamina C), tocoferol (vitamina E), hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno

butilado (BHT), entre otros. Estos métodos se basan generalmente en la captación o

secuestro de radicales libres generados en la mezcla de reacción (O2· -, · OH, ROO·,ONOO-, etc.), mientras que otros están basados en la reducción de iones metálicos

tales como el Fe3+ o el Cu2+ (Arnao y col, 1999 y Prior y col, 2005).

Como regla general no es adecuado utilizar un sólo método para establecer el

potencial antioxidante de los extractos de plantas, debido a su compleja composición

química, así dos o más métodos deberían ser siempre empleados para evaluar el

efecto antioxidante total de los vegetales (Maestri y col, 2006).

1.5.2. Métodos utilizados en estudios de la actividad

A. Actividad secuestradora del radical libre DPPH: El fundamento de esta técnica

consiste en la medición a 517 nm de la reducción del radical estable DPPH (2,2-

difenil-1-picril-hidracilo). La absorbancia característica de este radical, que posee un

color violeta intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (AH) u otro radical

(R·). Por tanto, es posible cuantificar la capacidad captadora de radicales libres que

poseen determinados compuestos mediante la determinación del grado de

decoloración que provocan a una disolución etanólica de DPPH (Brand-Williams ycol, 1995).

DPPH· + AH DPPH-H + A·

DPPH· + R· DPPH-H

B. Poder reductor: Es una medida de la habilidad reductora de los antioxidantes y

es evaluada por la transformación del Fe3+ a Fe2+ en presencias de las muestras de

extractos. La habilidad de reducir el Fe3+ puede estar atribuida a la donación de

hidrógenos de los compuestos fenólicos, lo cual está relacionado con la presencia de

agentes reductores. Además, el número y posición del grupo hidroxilo en los



13|

compuestos fenólicos juega un papel importante en la actividad del antioxidante

(Huda-Faujan y col., 2009). Cuando el hierro es reducido a la forma ferrosa toma un

color azul intenso que presenta un máximo de absorción a 700 nm y cuya intensidad

de color es proporcional a la capacidad reductora del compuesto o compuestos

ensayados (Benzie y Strain, 1996).

C. Método del tiocianato férrico (FTC, siglas en inglés): Se basa en la incubación

a 40º C y en la oscuridad de una mezcla de extracto etanólico de la muestras,

tampón fosfato, agua destilada y una disolución alcohólica de ácido linoléico. Los

peróxidos formados durante la oxidación del ácido linoléico reaccionan con el cloruro

ferroso formando el ión férrico, que al unirse con el tiocianato de amonio forma el

tiocianato férrico, que es un pigmento de color rojo que se mide

espectrofotométricamente a 500 nm a diferentes intervalos de tiempo durante la

incubación (Sánchez-Moreno y Larrauri, 1998).

D. Métodos para evaluar la peroxidación lipídica: La peroxidación lipídica es un

proceso en cadena mediado por radicales libres que causa la degradación de los

lípidos, siendo en particular interesante su acción a nivel de las membranas

celulares; transcurre en tres fases: iniciación, propagación y terminación. Sánchez-Moreno y Larrauri (1998) proponen una nueva clasificación de los métodos para

evaluar la oxidación lipídica, basados en la medida de los compuestos que se

obtienen en las diferentes fases de la oxidación. Como productos finales del proceso

están, los hidroperóxidos, hidroxiácidos grasos, epoxiácidos grasos, aldehídos

poliinsaturados, hidroxialdehídos, dialdehídos, cetonas y otros. Estos métodos

incluyen entre otros:

Valor de peróxidos (VP): Los peróxidos aparecen en la fase de propagación

de la oxidación. Este método se basa en la capacidad de los peróxidos lipídicos

de oxidar el ión yoduro (I-) a yodo (I2), que puede determinarse con una valoración

volumétrica con tiosulfato de sodio (Sánchez-Moreno y Larrauri, 1998).



14|

Valor de anisidina: El n-alquenal aparece en la fase final de la oxidación.

Este tiene la capacidad de formar un cromógeno amarillo naranja con el p-

anisidina que se mide espectrofotométricamente a 350 nm. (Sánchez-Moreno yLarrauri, 1998 y Singh y col. 2007)

Valor de ácido tiobarbitúrico (TBA, siglas en inglés): El malonaldehído

aparece en la fase final de la oxidación. Este tiene la capacidad de formar un

cromógeno rosa con el ácido tiobarbitúrico (TBA) que se mide

espectrofotométricamente a 530 nm. Este es el mecanismo químico más usado

para determinar la extensión de la peroxidación (Sánchez-Moreno y Larrauri,1998 y Schinella y col., 2004).

1.6. Fitoterapia antioxidante

Los compuestos de naturaleza fenólica juegan un papel importante en los procesos

de oxidación lipídica y se les asocia con la actividad antioxidante (Sokmen et al.;2005). Específicamente; ácidos fenólicos y flavonoides son típicamente reconocidos

como poseedores de actividad antioxidante. Los compuestos fenólicos como los

tocoferoles, tocotrienoles y flavonoides presentan alta capacidad de capturar

radicales, (Dastmalchi y col., 2007)

Los flavonoides son de los compuestos fenólicos los constituyentes más comunes de

la parte no energética de la dieta humana. Estos contienen en su estructura química

un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y excelentes propiedades de

quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una gran

capacidad antioxidante. (Havsteen B, 1983 y Peres W ,1994). Por ello, desempeñan

un papel esencial en la protección frente a los fenómenos de daño oxidativo, y tienen

efectos terapéuticos en un elevado número de patologías, incluyendo la cardiopatía

isquémica, la aterosclerosis o el cáncer ( Pace-Asciak CR, 1995 y Jang M, Cai L,Udeani GO y cols.,1997).Sus propiedades antirradicales libres se dirigen

fundamentalmente hacia los radicales hidroxilo y superóxido, especies altamente

reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidación lipídica y se ha



15|

descrito su capacidad de modificar la síntesis de eicosanoides (con respuestas anti-

prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregación plaquetaria (efectos

antitrombóticos) y de proteger a las lipoproteínas de baja densidad de la oxidación

(prevención de la placa de ateroma(Yang y cols., 2000 y Geleijnse y col, 2002).

El acido ascórbico presente en muchos vegetales se considera un antioxidante muy

eficiente aunque no debe ignorarse que en algunas circunstancias, como en

presencia de metales traza y en condiciones de pH adecuadas, puede actuar como

pro-oxidante e incluso tener efectos. La acción antioxidante de este compuesto es

debido a su reacción directa con O2·, •OH, y 1O2 (Buettner y Jurkiewicz, 1996).Puede actuar reduciendo al O2.- dando lugar a H2O2 y deshidroascorbato (DHA) .El

ascorbato también es un secuestrador eficiente del oxígeno singlete y es capaz de

reaccionar con los radicales .OH y con el peroxido de hidrógeno. Regenera la

vitamina E, mediante la reducción del radical tocoferoxil en un ciclo redox en el cual

se transfiere un sólo electrón (Sharma y Buettner, 1993). Es esencial en la

protección de enzimas que poseen metales de transición como grupos prostéticos

(Padh, 1990).

Por otra parte la vitamina E es el nombre colectivo para un sistema de ocho

tocoferoles y tocotrienoles relacionados, que son vitaminas antioxidantes

liposolubles. La forma del α-tocoferol es la más importante de los antioxidantes

liposolubles y protege las membranas de la célula contra la oxidación reaccionando

con los radicales del lípido producidos en la reacción en cadena de peroxidación de

lípidos. Se sugiere también que pueden tener un rol especializado en la

neuroprotección (Yang y cols., 2000 y Geleijnse y col, 2002).

1.7. Consideraciones finales

Las hojas de la Capraria Biflora. L son utilizadas en la medicina tradicional cubana

por su acción antimflamatoria. Los estudios fitoquímicos sobre la actividad

antioxidante de la planta son escasos y tampoco hay reportes de la relación que

puede existir entre la acción que se le atribuye con la actividad antioxidante. La



16|

presencia de fenoles y flavonoides puede considerarse un elemento importante para

que muchas plantas medicinales posean acción antioxidante.

Materiales y Métodos| |


17

Capítulo II: MATERIALES Y METODOS

Reactivos, utensilios y equipos de medición

Los reactivos empleados en el trabajo experimental se relacionan a continuación:

2,2-difenil-1-picril-hidracilo

(DPPH), SIGMA- ALDRICH

Etanol absoluto, UNI-CHEM

Ferrocianuro de potasio,

UNI-CHEM.

Hidroxitolueno butilado

(BHT), SIGMA-

Hidróxido de sodio, UNI-

CHEM

Reactivo Folin–Ciocalteau,

SIGMA-ALDRICH

Tricloruro de hierro, MERCK

Acido clorhídrico, UNI-

CHEM

Ácido tricloroacético, EPB

“Carlos J. Finlay.

Agua destilada

Buffer fosfato (0,2 M, pH

6,6)

Carbonato de sodio, UNI-

CHEM

Quercetina(SIGMA- ALDRICH)

Acido Ascórbico, UNI-CHEM

Nitrito de sodio, UNI-CHEM

Tricloruro de aluminio(MERCK)

Metanol, UNI-CHEM

Acido acético, UNI-CHEM

Acido sulfúrico, ( UNI-CHEM)

Anhídrido acético ( UNI-CHEM)

Reactivo de Felhing (A y B), UNI-

CHEM

Acetato de sodio (UNI-CHEM )

Cinta de magnesio metálica

Alcohol amilico, UNI-CHEM

Reactivo de Sudan (UNI-CHEM )

Diclorometano, UNI-CHEM

Éter de petróleo, UNI-CHEM

Rutina, ACROS

Cloroformo, UNI-CHEM



18

En todos los casos se consideraron las especificaciones de calidad (puro para

análisis, calidad espectroscópica) según correspondía cada caso.

Equipos empleados:

Agitador magnético SELECTA P Agimatinc- E, España

Balanza digital, BOECO, Alemania

Baño ultrasónico, BRANSON 1510, México

Centrífuga, 5702 EPENDORF, Alemania

Espectrofotómetro UV-VIS, RAYLEIGH UV-1601, Beijing

Estufa, BINDER.

Phmeter, HANNA, Rumania

Baño de agua, Julabo, Francia

Plancha, Stuart SD 300

2.1. Recolección

La recolección del material vegetal se realizó en horas tempranas de la mañana, en

diferentes áreas pertenecientes a las provincias de Camagüey y Villa Clara, en el

mes de febrero del 2010, las partes aéreas se trasladaron en bolsas de nylon hasta

el laboratorio de Farmacognosia y Química Farmacéutica donde se lavaron con

abundante agua potable y se procedió a la selección de las hojas como material de

interés

2.2. Secado y molinado

El secado se realizó mediante calor artificial utilizando estufa, BINDER. Y

extendiendo las hojas en capas delgadas sobre bandejas metálicas a 37 0 C, según

reportó Claus, 1985, el material se removió varias veces para evitar fermentaciones

o contaminaciones microbiológicas. Después de secado, el material se trituró en un

molino de cuchillas Retsch Gmbh 5657 tipo SR-2, utilizando un tamiz de 0.75 mm.



19

2.3. Obtención de los extractos

Al material vegetal seco y molinado (hojas) se le realizó una extracción continua

(soxhlet) con éter de petróleo (Teb= 600 a 900) y etanol comercial de manera

independiente. El extracto acuoso se obtuvo por reflujo. Los extractos obtenidos se

rotoevaporaron hasta llevar a sequedad, se pesaron y se guardaron en refrigeración

hasta su uso.

Figura1: Metodología de extracción

2.4. Evaluación fitoquímica de los extractos

2.4.1. Tamizaje fitoquímico

La composición química de cada extracto se evaluó cualitativamente siguiendo la

técnica establecida para el tamizaje fitoquímico por (Miranda y Cuellar, 2000). Para

la realización de este estudio se realizaron los siguientes ensayos:

Humectar

Extracción en Soxhlet400 mL del solvente

ExtractoEtéreo

ExtractoEtanólico

40 g Droga

Extracción porReflujo 400 mL del

solvente

ExtractoAcuoso

Rotoevaporar

40 g Droga



20

Ensayo de Sudán III: Permite reconocer en un extracto la presencia de

compuestos grasos, para lo cual a la alícuota de la fracción en el solvente de

extracción se le añade 1ml de una solución diluída en agua del colorante Sudán

III o Sudán IV. Se calienta en baño de agua hasta evaporación del solvente.

Positiva: Si aparecen gotas o una película coloreda de rojo en el seno del líquido o

en las paredes del tubo de ensayo, respectivamente.

Ensayo de Liebermann- Burchard: Permite reconocer en un extracto la

presencia de triterpenos y/o esteroides. Si la alícuota del extracto no se encuentra

en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo

redisolverse en 1ml de cloroformo. Se adiciona 1ml de anhídrido acético y se

mezcla bien. Por la pared del tubo se dejan correr 2-3 gotas de ácido sulfúrico

concentrado sin agitar.

Positivo: Si se produce un cambio de coloración: Rosado- azul muy rápido; Verde

intenso visible aunque rápido; verde oscuro- negro final de la reacción.

Ensayo de Espuma: Permite reconocer la presencia de saponinas, tanto del tipo

esteroidal como triterpénicas. Si la alícuota se encuentra en etanol, se diluye en 5

veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10min.

Positivo: Si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2mm de espesor

o altura y persiste por más de 2 min.

Ensayo de Felhing: Permite reconocer en un extracto la presencia de azúcares

reductores. Si la alícuota del extracto no se encuentra en agua debe evaporarse

el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1-2ml de agua. Se

adicionan 2ml del reactivo (recién preparado) y se calienta en baño de agua de 5-

10 min.

Positivo: Si la solución se colorea de rojo o aparece un precipitado rojo.

Ensayo de Cloruro férrico: Permite reconocer la presencia de compuestos

fenólicos y/o taninos. Si el extracto de la planta es etanólico el ensayo determina



21

tanto fenoles como taninos. A una alícuota del extracto etanólico se le adicionan 3

gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. Si

el extracto es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos; a una

alícuota del mismo se le añade acetato de sodio para neutralizar y 3 gotas de la

solución reactiva.

Positivo: Cuando aparece una coloración rojo –vino (compuestos fenólicos en

general), verde intensa (taninos del tipo pirocatecólicos) y azul (taninos del tipo

pirogalotánicos).

Ensayo de Borntrager: Permite reconocer en un extracto la presencia de

quinonas. Si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe

evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1ml de

cloroformo. Se adiciona 1ml de NaOH, KOH o NH4OH al 5% en agua. Se agita

mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior separación.

Positivo: Si la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado a rojo (+),

coloración rosada (++) y coloración roja (+++).

Ensayo de Shinoda: Permite reconocer la presencia de flavonoides en un

extracto vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra en etanol, se diluye con

1ml de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio

metálica. Después de la reacción se esperan 5 min., se añade 1ml de alcohol

amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que las mismas se separen.

Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma a

partir de la adición del ácido clorhídrico concentrado.

Positivo: Cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo,

intensos en todos los casos.

2.4.2. Evaluación cromatográfica

Los extractos se evaluaron también por cromatografía en capa delgada (CCD)

empleando placas de sílica gel 60, cámara cromatográfica (CAMAG), lámpara UV



22

(CAMAG) a λ 254-366nm y vapores de amoníaco y tricloruro de aluminio (1%) (Lockde Ugaz, 1988) como reveladores.

Se utilizaron las siguientes fases móviles: cloroformo y cloroformo: metanol (9:1)

(para el extracto etéreo en particular) y n-butanol: ácido acético: agua (4:1:5) (BAW)

(para los tres extractos)

2.5. Determinación de flavonoides totales

El método para evaluar el contenido de flavonoides totales se basa en el uso de

reactivos de desplazamiento en el ultravioleta visible, generalmente se utiliza AlCl3 y

se lee la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm (Kumaran col, 2004).

Preparación de las diluciones: Se pesaron 0.06g de cada uno de los extractos

disolviéndolos en etanol absoluto: agua en una proporción de (9:1) en un matraz

aforado (10 mL).

Procedimiento: La cantidad de flavonoides se estimó mezclando una alícuota de (1

mL) de las soluciones de los extractos anteriormente preparadas con 4 mL de agua

destilada, a la solución obtenida se le agregó nitrito de sodio ( 0.3 mL, 5%), se dejó

incubar 5 minutos, se adicionó tricloruro de aluminio( 0.3 mL, 10%) y se dejó en

reposo a temperatura ambiente ( 6 min), después de lo cual se agregó hidróxido de

sodio (2 mL, 1M), se aforó con agua destilada a 10 mL, y se leyó la absorbancia a

510 nm( Kumaran col, 2007). Las lecturas de esta variable se interpolaron en la

curva de calibración preparada con rutina, caracterizada mediante la ecuación de

regresión: y= 0.19x + 0.0714, r2= 0.9976. Los resultados se expresaron como

miligramos equivalentes de rutina por gramos de material vegetal seco (mgER/gs).

2.6. Actividad antioxidante de los extractos

La actividad antioxidante de los extractos fue evaluada frente a los antioxidantes

sintéticos BHT y ácido ascórbico y los patrones de origen natural rutina y quercetina

por diferentes métodos: la actividad estabilizante del radical libre DPPH y la medida

del poder reductor.



23

2.6.1 Actividad estabilizante del radical DPPH

Se cuantificó la capacidad de los extractos para estabilizar el radical (DPPH),

siguiendo la metodología propuesta por (Ohinishi col, 2005).

Preparación de las diluciones: Se pesaron 0.01g del extracto etéreo (1 mg/mL),

0.02 g del extracto etanolico (2mg/mL) y 0.03 g del extracto acuoso (3mg/mL), se

llevó hasta 10 mL en un matraz aforado, obteniéndose las soluciones madre.

Solución de DPPH: Se pesaron 0.004g de DPPH, se disolvió con etanol absoluto,

llevándolo hasta 100 mL en un matraz aforado para obtener una solución de 0.04

mg/mL, la misma se cubrió con papel de aluminio para protegerla de la luz.

Procedimiento: Se tomaron de la disolución del extracto etereo alícuotas de ( 200,

400, 600, 800, 1000 µL) y del extracto etanólico y acuoso ( 50, 150, 250, 350 y 450

µL), completando hasta 1 mL con etanol absoluto obteniéndose las siguientes

concentraciones: extracto etéreo (0.05, 0.1,0.15,0.2,0.25 mg/mL), extracto etanólico(

0.025, 0.0625, 0.125, 0.175, 0.225 mg/mL) y el extracto acuoso( 0.037, 0.093, 0.187,

0.262, 0.377 mg/mL), luego se le adicionó 3 mL de DPPH ( 0.04 mg/mL), se incubó a

temperatura ambiente ( 30 min) y se midió la absorbancia a 517 nm. Se utilizaron

como patrones la rutina, quercetina y ácido ascórbico a las siguientes

concentraciones (0.005, 0.01, 0.015, 0.02, 0.025 mg/mL; 0.0025, 0.005, 0.0075, 0.01,

0.0125 mg/mL; 0.005, 0.01, 0.015, 0.02, 0.025 mg/mL) respectivamente.

Cálculo de la actividad antirradical: El porcentaje de la Actividad Estabilizante de

Radicales Libres (%ASRL) se obtuvo mediante la ecuación:

%ASRL = [ABSDPPH – ABS muestra / ABS DPPH ] * 100

Donde:

ABS DPPH: Absorbancia del blanco

ABS muestra: Absorbancia de la muestra



24

Los resultados obtenidos por este método se reportan como IC50, que es la

concentración inhibitoria media, es decir, la concentración de compuestos

antioxidantes que es capaz de inhibir el 50% del radical DPPH.

A partir de los valores de IC50 se calculó el índice de actividad antioxidante (IAA),

según la metodología propuesta por (Scherer y Teixeira, 2009) utilizando la

siguiente expresión:

AAI = Concentración final de DPPH (mg/mL)/ IC50 (mg/mL)

*Se consideró pobre actividad antioxidante cuando AAI <0.5, moderada actividad

antioxidante cuando 0.5<AAI<1.0, fuerte actividad antioxidante cuando 1.0<AA<2.0 y

muy fuerte cuando AAI>2.0.

2.6.2. Medida del poder reductor

El poder reductor de las muestras fue analizada por el método descrito por (Oyaizu,1986).

Preparación de las diluciones: Se pesaron 0.03g de cada uno de los extractos y de

los patrones, se colocaron en una matraz aforado de 10 ml, inicialmente se

disolvieron en 5 mL con etanol absoluto, y se llevó a ultrasonido hasta su completa

dilución, finalmente se llevó a su volumen de aforo con el mismo disolvente.

Procedimiento: Se tomaron las siguientes alícuotas( 400, 600, 800, 1000 µL) de

cada uno de los extractos por separado y de los antioxidantes sintéticos, se llevaron

con etanol absoluto hasta 1 mL(concentraciones de 1.2, 1.8, 3 mg/mL) fueron

mezclados con 2.5 mL de buffer fosfato (0,2 M, pH 6,6) y 2.5mL de ferrocianuro de

potasio(1%) y la mezcla fue incubada a temperatura ambiente durante 20 min, se

adicionó 2.5 mL de ácido tricloroacético(10 %), la mezcla resultante se centrifugó a

3000 rpm por 10 minutos. Se tomó una alícuota del sobrenadante (2.5 mL) la cual fue

disuelta en una cantidad igual de agua destilada, inmediatamente se agregó 0.5 mL

de cloruro férrico (0.1%), finalmente se midió la absorbancia a una longitud de onda

de 700 nm. Se utilizaron como controles positivos la quercetina, el BHT, y el ácido



25

ascórbico, tomando las mismas alícuotas de los extractos y a las mismas

concentraciones. Los ensayos fueron realizados por triplicado.

Resultados y discusión| 26 |


Capítulo III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Recolección

Para la recolección de material vegetal con fines farmacéuticos debe asegurarse la

identidad de la droga; que debe ser recolectada e identificada por un personal

experto y capacitado. En el presente trabajo, se realizó, la identificación taxonómica

del material vegetal por un especialista en la temática, como criterio seguro de su

identidad botánica, observándose una total correspondencia con las características

del material recogido en herbario y con la descripción botánica establecida en la

literatura (Edwin, 1971; León, 1957; Roig, 1988).

En la droga que nos ocupa, la recolección del material se realizó de forma manual,

pues es la técnica que se aconseja para plantas silvestres. Tuvo lugar en horas

tempranas de la mañana, tomando las partes aéreas y procurando dejar ramas

suficientes para garantizar el normal desarrollo de la planta y así un uso sostenible

de este recurso natural.

3.2. Secado y molinado

El material vegetal una vez secado y molinado conservó las características

organolépticas establecidas por Tejeda, 1998. Se almacenó en bolsas de polietileno

en una desecadora protegida de la luz y la humedad, hasta el momento de su

utilización.

3.3. Obtención de los extractos

Para la obtención de los extractos, el material vegetal seco y molinado se le extrajo

mediante soxhlet con éter de petróleo (Teb= 600 a 900) y etanol comercial de

manera independiente. El extracto acuoso se obtuvo por reflujo. El extracto etéreo

resultante de la extracción presentó una coloración amarilla verdosa intensa de

naturaleza oleosa, con etanol se obtuvo un extracto color verde intenso,

característico de los extractos alcohólicos obtenidos a partir de hojas con una

significativa extracción de pigmentos clorofílicos y el extracto acuoso de color



carmelita rojizo intenso, mantuvo las características propias de decocciones de hojas

de esta especie ya evaluadas en estudios anteriores (Machado y Blanco, 2000,Vicet, 2009). Después de rotoevaporado se calculó el rendimiento en base a material

vegetal seco.

Tabla 1: Rendimiento de los extractos.

Extracto Método de Obtención Rendimiento %Etéreo Soxhlet 5Etanólico Soxhlet 40Acuoso Reflujo 39

Cuando se analizaron los resultados con respecto al rendimiento de cada uno de los

extractos, se observó que los extractos polares (etanólico y acuoso) con 40 y 39%

no presentaron diferencias entre si, pero resultan significativamente superiores al

extracto etéreo con solo un 5 % de extracción.

3.4. Evaluación fitoquímica de los extractos

La naturaleza química de los componentes de los extractos es un elemento

importante en la evaluación de estos que van a ser sometidos a evaluaciones

farmacológicas, pues dicha información puede orientar hacia la posible acción

farmacológica que puedan ejercer y a los posibles metabolitos responsables de tales

efectos. En correspondencia a este criterio se realizó la evolución fitoquímica de los

tres extractos obtenidos a partir de las hojas de esta planta.

3.4.1. Tamizaje fitoquímico

Para la realización del tamizaje fitoquímico se informan en la literatura variados

esquemas de trabajo que comprenden a su vez el uso de diferentes solventes de

extracción. Tomando las referencias de estudios anteriores, se realizaron los

ensayos para ácidos grasos, quinonas, triterpenos y/o esteroides, azúcares

reductores, saponinas, fenoles y/o taninos y flavonoides según especificaciones de

Miranda y col 2001.



Los resultados obtenidos para estos ensayos aparecen resumidos en la (tabla 2).

Tabla 2: Resultados del tamizaje fitoquímico de los extractos

Ensayos MetabolitosExtractos

Etéreo Etanólico AcuosoSudán Ácidosgrasos + + +Borntrager Quinonas - - -Liebermann-Burchard

Triterpenos y/oesteroides

+ + -

Felhing Azúcares reductores - - +Espuma Saponinas - + +Cloruro férrico Fenoles y/o taninos - + ++Shinoda Flavonoides - + ++

Es importante señalar que los resultados obtenidos mediante estas técnicas ofrecen

solo una visión de la composición química de la planta a estudiar y que no puede

tomarse en ningún caso como un resultado concluyente ya que en la presencia o

ausencia de un metabolito pueden influir de forma determinante la época de

recolección y las deficiencias en la misma, además del tipo de secado y/o

conservación. También puede afectar los resultados el estado vegetativo de la planta

que puede traer como consecuencia el aumento o disminución de la concentración

de los metabolitos. La solubilidad en el solvente empleado y la interferencia de otros

metabolitos también pueden afectar de forma significativa la composición del

extracto.

Estos resultados se encontraron en correspondencia con los informes fitoquímicos de

la familia botánica, siendo similares a los obtenidos por Tejeda, 1998 y Hernández,1999, para drogas provenientes de otras localidades de la región central, lo cual

sugiere que este factor no influye notablemente en la composición del material

vegetal al menos desde el punto de vista cualitativo.

3.4.2. Evaluación cromatográfica

El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis cualitativo y

cuantitativo de materiales o extractos de origen vegetal, ya sea en materias primas,

productos terminados o compuestos presentes en fluidos biológicos. Su uso resulta



en muchas ocasiones complementario al tamizaje fitoquimico. Las técnicas

cromatrográficas han dado buenos resultados en la separación óptima, identificación

y aislamientos de componentes individuales. (Harborne, 1998)

Por tales razones, para evaluar las características cromatográficas de los extractos

obtenidos se aplicó la cromatografía de capa delgada, empleando en todos los caso

placas de sílica gel como fase estacionaria y como fases móviles las que se indican

en el epígrafe 2.4.2. Las placas se revelaron bajo luz ultravioleta (λ 254-366 nm),

empleando como reveladores vapores de amoníaco y tricloruro de aluminio para los

flavonoides (Markhan, 1988).

Al utilizar el cloroformo como fase móvil para el extracto etéreo permitió que se

observara una mejor resolución que con la fase móvil diclorometano: metanol (9:1),

pues para esta no se evidenciaron buenos resultados, ya que solamente se logró

separar las bandas correspondientes a los derivados clorofílicos.

Los resultados cromatográficos muestran 9 manchas con adecuada separación

observables tanto en el visible como al ultravioleta, al ser reveladas con vapores

amoníaco se observaron manchas rojas (1, 2, 5, 6) características de los derivados

clorofílicos, las que evidenciaron un mejor comportamiento fueron las que tomaron

coloración amarilla (3, 4, 7), que indican la presencia de compuestos (flavonoides) y

la azul (8) característica de compuestos (fenólicos o flavonoides). Frente al tricloruro

de aluminio el comportamiento fue similar, ocurriendo algunas variaciones de las

manchas de fluorescencia roja a tonalidades más claras (Mabry, 1970).

Se empleó adicionalmente como fase móvil, n-butanol: ácido acético: agua (4:1:5),

siendo mejor resueltos los extractos etanólico y acuoso. Los resultados se

compararon con los factores de retención (Rf), de los patrones rutina y quercetina

(Figura 1).

En este caso, los cromatográmas muestran 3, 8 y 7 manchas para los extractos

etéreo, etanólico y acuoso, respectivamente. Al revelar con vapores de amoníaco las

manchas de mayor interés en el extracto etéreo resultaron la mancha azul (1) y la



amarilla (2) con Rf de 0.82, 0.88 respectivamente, este comportamiento

cromatográfico evidenció que el extracto puede presentar flavonoides, en el extracto

etanólico fueron las de color amarillo (2, 4, 7) con RF 0.1, 0.52, 0.68, la rojo vino (3)

y la de coloración parda (6) con 0.48 y 0.6 de Rf y en el extracto acuoso resultó

interesante la presencia de una mancha de color verde amarillento (1), las amarillas

(3, 7) y la de coloración parda 6) con Rf de 0.02, 0.1, 0.68.

Fase móvil: n- butanol: ácido acético: agua (4:1:5, fase superior),A: UV (254), B: UV (366), C: Tricloruro de aluminio- UV (366)

Figura.1: Cromatográmas de los extractos etéreo, Etanólico y acuosoPara el revelado con tricloruro de aluminio se evidenciaron cambios de coloración

solamente en algunas manchas del extracto etanólico y acuoso y en la de los

patrones. En el caso del extracto etanólico la mancha (3) tomó una coloración

amarilla oscura y en las del extracto acuoso los cambios fueron en la (1), la cual

tomó fluorescencia y la (6) que cambió a amarillo oscuro. Las manchas de los

patrones sufrieron cambios significativos, la de la rutina evidenció una coloración

amarillo oscuro y la de la quercetina amarillo fluorescente.

Los patrones evidenciaron una sola mancha, para la rutina de coloración parda y

para la quercetina amarilla con comportamiento típico frente a los reveladores

utilizados.

Después de haber calculado los Rf para cada mancha y teniendo en cuenta las que

evidenciaron mejor comportamiento, se compararon los Rf de cada una de las

manchas de los extractos con el de los patrones, obteniéndose que el Rf de la



mancha (3) en el extracto etanólico y el de la (6) en el extracto acuoso son similares

al Rf de la rutina, evidenciando la presencia de flavonoides y en específico de rutina.

3.5. Determinación de flavonoides totales

Los flavonoides han sido reportados como poseedores de múltiples actividades

biológicas entre las que se encuentra su acción antioxidante (Gorinstein col, 2004,Dasgupta De, 2007), estos constituyen dentro de la composición de la Capraria

Biflora. L los metabolitos con mayor potencialidad de tener actividad antioxidante.

El contenido total de flavonoides para los extractos (etéreo, etanólico y acuoso) de la

Capraria Biflora.L fue calculado empleando la curva de calibración de la rutina

(Figura 2)

Curva de Ca librac ión de la Rutina

y = 7.6x + 0.0714R2 = 0.9976

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.05 0.1 0.15Conce ntr ación m g /m L

Ab

sorb

anci

a

Figura. 2: Curva de calibración de la rutina para flavonoides totales.

Los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de rutina por gramos de

extracto seco (mgER/gs) (Tabla 3).

Tabla 3: Resultados de flavonoides totales

Extractos mg/mLRutina

mgER/gs

Etéreo 0.032 53.33Etanólico 0.086 143Acuoso 0.02 33.3



Resulta importante destacar que el éter de petróleo a pesar de ser un disolvente no

polar permite extraer algunos tipos de flavonoides; estos pueden estar metoxilados o

glicosilados, lo cual modifica notablemente la solubilidad y por tanto no ser extraídos

con disolventes polares. En estudios anteriores se planteó la posibilidad de que los

flavonoides presentes en la fracción clorofórmica de las hojas de Capraria biflora.L

podrían estar metoxilados en la posición 3’ ó 4’ del anillo B, o en la posición 7del

anillo A (Vicet, 2009), lo cual puede explicar su presencia en el extracto etéreo y

también la respuesta cromatográfica observada frente al amoníaco y ALCL3 discutida

ya en el epígrafe 3.4.2.

Estos valores resultan de gran importancia al valorar la actividad antioxidante de los

extractos ya que un gran número de trabajos reportados refieren que la misma posee

una relación directa con la presencia de estos compuestos en la fuente natural

Estos valores no aparecen informados en la literatura y poseen gran importancia en

el análisis de la actividad biológica de los productos naturales, dada la gran variedad

de investigaciones que se han reportado, relacionando la presencia de estos

compuestos en alguna propiedad farmacológica.

3.6. Actividad antioxidante de los extractos

La actividad antioxidante de los extractos fue evaluada frente a los antioxidantes

sintéticos BHT y ácido ascórbico y los patrones de origen natural rutina y quercetina

por diferentes métodos: la actividad estabilizante del radical libre DPPH y la medida

del poder reductor.

3.6.1. Actividad estabilizante del radical DPPH

En este ensayo se procesaron las curvas de calibración correspondientes a cada uno

de los patrones utilizados (rutina, quercetina, y ácido ascórbico) y los tres extractos

con los que se trabajó en el estudio, de las cuales de obtuvo la ecuación de la recta y

el coeficiente de correlación correspondiente a cada uno (Figura 3).



Curva de Calibración E. Etereo

y = 186.12x + 1.868R2 = 0.9841

0

10

20

30

40

50

60

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Concentración m g/m L

%A

SRL

Curva de Calibración E. Etanólicoy = 276.55x + 6.067

R2 = 0.984

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25


% A

SRL

Curva de Calibración E. Acuoso

y = 201.93x + 6.7435R2 = 0.9742

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0.1 0.2 0.3 0.4


% A

SR

L

Curva de Calibración Rutina

y = 3113.8x + 7.299R2 = 0.9757

0

20

40

60

80

100

0 0.01 0.02 0.03Concentración m g/m L

% A

SR

L

Curva de Calibración Quercetina

y = 6623.2x - 0.676R2 = 0.9967

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0.005 0.01 0.015


% A

SRL

Curva de Calibración Ac. Ascórbico

y = 3929.2x - 10.54R2 = 0.9987

0

20

40

60

80

100

0 0.01 0.02 0.03Concentración m g/m L

% A

SRL

Figura. 3: Curvas de calibración obtenidas para los extractos y los patrones

estudiados en el ensayo de la actividad estabilizante del radical libre DPPH.



Estas curvas permitieron determinar la actividad antioxidante de cada uno de

los extractos expresada como Concentración Inhibidora Media (IC50) e Índice

de Actividad Antioxidante (AAI), los cuales se muestran en la (Tabla 4).

Tabla 4: Actividad estabilizante del radical DPPH de los extractos y los patrones

Muestras Concentración(mg/mL)

ASRL(%)

IC50mg/mL

IAA

Extracto Etéreo

0.05 11.46

0.16 0.18750.1 21.920.15 28.140.2 36.920.25 50.49

Extracto Etanólico

0.025 9.31

0.11 0.270.0625 26.590.125 42.10.175 55.690.225 66.03

Extracto Acuoso

0.037 9.58

0.18 0.160.093 28.310.187 45.350.262 65.070.377 78.45

Rutina

0.005 19.42

0.014 2.150.01 40.780.015 55.100.02 74.150.025 80.58

Quercetina

0.0025 16.34

0.007 4.290.005 31.810.0075 47.820.01 67.97

0.0125 81.05

Acido Ascórbico0.005 9.9

0.015 2.000.01 26.970.015 49.510.02 67.990.025 87.62

*Se consideró pobre actividad antioxidante cuando IAA <0.5, moderada actividad

antioxidante cuando 0.5<IAA<1.0, fuerte actividad antioxidante cuando



1.0<IAA<2.0 y muy fuerte cuando IAA>2.0, según la propuesta de (Scherer yTeixeira (2009)

Los resultados de la actividad antioxidante indican que los extractos fueron

capaces de atrapar radicales DPPH de una manera dependiente de la

concentración. Los valores obtenidos de IC50 para los extractos muestran una

gran diferencia al compararlos con los valores obtenidos de los patrones

utilizados. El extracto etanólico mostró valores superiores de actividad

antioxidante, aunque discreta, con una IC50 de 0.11 mg/mL, no existiendo una

diferencia marcada con el resto de los extractos.

Se puede referir que la actividad antioxidante de los tres extractos estudiados de

la planta, por este mecanismo de actividad estabilizante del radical DPPH, es

baja para las concentraciones estudiadas. Lo anterior fue corroborado por la

metodología propuesta por (Scherer y Teixeira (2009), quienes proponen la

evaluación de este ensayo a través de la determinación del Índice de actividad

antioxidante (IAA). Al clasificar el poder antioxidante de los extractos según la

escala propuesta por estos autores, se concluyó que los tres extractos

evaluados tienen una pobre actividad antioxidante, según este mecanismo de

oxidación, en las concentraciones estudiadas.

La actividad estabilizante de las muestras estudiadas fue Quercetina >> Rutina >

Acido Ascórbico >>> Extracto etanólico > Extracto etéreo > Extracto acuoso.

La mayor actividad observada para la quercetina se debe fundamentalmente a

que esta acción farmacológica resulta dependendiente de los aspectos

estructurales de los compuestos. En relación con la actividad antioxidante de los

flavonoides, se puede considerar que los estudios de la actividad secuestradora

de RL e inhibición de la POL, incluyen un grupo catecol como rasgo estructural

fundamental, junto con el grupo carbonilo en posición 4, en conjugación con el

doble enlace entre los carbonos 2 y 3. El grupo OH libre de la posición 3

aparentemente incrementa la capacidad antioxidante porque la forma libre es

más lipofílica que la glicosídica y un grupo OH en posición 5 puede aumentar la



actividad antioxidante por incremento de la deslocalización electrónica. La

conjugación total del anillo piránico con el resto de la molécula, lo cual es típico

de las antocianidinas, incrementa la estabilización de los radicales formados, se

produce un aumento de la actividad antioxidante, pero al mismo tiempo la

presencia de un grupo pirogalólico predispone hacia una actividad prooxidante

(Pérez, 2003)

3.6.2. Medida del poder reductor

La actividad antioxidante de la planta se complementó midiendo su capacidad

para reducir el Fe3+ a Fe2+, monitoreando la formación de un complejo coloreado

(reacción tipo Fenton).La Figura 4 (Tabla 5) ilustra el poder reductor del extracto

etéreo, etanólico y acuoso, comparados con el BHT, quercetina y ácido

ascórbico.

Poder Reductor

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

1.2 1.8 2.4 3

Concentración mg/mL

Abs

orba

ncia

Extracto Etéreo

Extracto Etanólico

Extracto Acuoso

Quercetina

BHT

Acido Ascórbico

Figura. 4: Poder reductor de los extracto evaluados.

El incremento de la absorbancia en la mezcla de reacción es indicativo del

incremento del poder reductor (Benzie y Strain, 1996). Muchos autores

sostienen que la actividad antioxidante de algunos extractos polares es debida,

al menos, a la presencia de sustancias con grupos hidroxilos, los cuales ejercen

su acción por donación de protones (capacidad secuestrante de radicales



libre), o bien por interacción, adición o combinación de radicales o por

reacciones redox (transferencia de electrones). En cualquier caso es importante

la estructura planar y espacial del compuesto antioxidante presente en el

extracto (Jung col., 2006

Tabla 5: Valores de la absorbancia de los extractos y de los antioxidantes

sintéticos y en el sistema de poder reductor.

Concentración(mg\mL)

Valores de Absorbancia para cada extracto y patrónExtractoEtéreo

ExtractoEtanólico

ExtractoAcuoso Quercetina BHT

AcidoAscórbico

1.2 0.241 0.36 0.239 3.261 2.274 3.0381.8 0.378 0.496 0.352 3.319 2.493 3.0642.4 0.509 0.64 0.469 3.312 2.488 3.083.0 0.623 0.737 0.558 3.318 2.625 3.061

Los extractos a las concentraciones probadas mostraron menor habilidad para

reducir el Fe3+, en comparación con todos los patrones empleados, a igual

concentración. Esto puede ser indicativo de que los extractos no muestran un

fuerte poder para reducir el Fe3+ a Fe2+ a concentraciones altas para las cuales

los patrones no muestran variación alguna.

En general los resultados obtenidos para la determinación de la actividad

antioxidante resultaron inferiores a la esperada dada la concentración de

flavonoides totales, pues generalmente se asocia que una planta con alto

contenido de compuestos flavonoides totales deberá presentar una mayor

actividad antioxidante, sin embargo se puede observar que en algunas plantas

se manifiesta una actividad antioxidante superior a lo esperado o por el

contrario, una baja actividad que no se relaciona con el contenido de

flavonoides. Esto es indicativo de que la capacidad antioxidante de una planta se

debe al efecto combinado de diversos factores, como puede ser la presencia de

otro tipo de metabolitos antioxidantes, o bien, una actividad pro-oxidativa que se

contrapone al potencial antioxidante.

C o n c l u s i o n e s | 38 |

Saily Quesada YeroEvaluación preliminarde la capacidad antioxidante de extractos provenientes de las hojas deCapraria Biflora.L

38

Conclusiones

1. Los principales metabolitos presentes en los extractos son: ácidos grasos,

triterpenos y esteroides, azúcares reductores, saponinas, fenoles y/o

taninos y flavonoides.

2. El extracto etanólico presentó el mayor contenido de flavonoides totales

entre los extractos evaluados.

3. Los extractos estudiados poseen pobre actividad antioxidante según los

valores obtenidos de IAA y el resultado del poder reductor.

R e c o m e n d a c i o n e s | 39 |


39

Recomendaciones1. Cuantificar el contenido de fenoles totales para tener mayor información de la

cantidad de metabolitos presentes en la planta a los que se le atribuye la

actividad antioxidante.

2. Completar el estudio con otros ensayos reportados para verificar si los

extractos ejercen la actividad antioxidante por otros mecanismos.

3. Comprobar la actividad antioxidante de los extractos mediante métodos In

vivo.

R e f e r e n c i a s B i b l i o g r á f i c a s | 40 |


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