FACULTAD DE QUÍMICAEDUCACIÓN CONTINUA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

DIPLOMADO DEL ÁREA DE FARMACIA

“Bioquímica y Biología Molecular para la Industria

Farmacéutica y Biotecnológica” Farmacéutica y Biotecnológica”

Laura Carmona Salazar

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

MÓDULO I. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS

ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNASPlegamiento y desnaturalización de las proteínas

FUNCIONES DE LAS PROTEÍNASFunciones de las proteínasFunciones de las proteínasRelación estructura-función

NIVELES DE ESTRUCTURACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Estructuraprimaria

Estructurasecundaria

Estructuraterciaria

Estructuracuaternaria

Residuosaminoácidos

Hélice αααα Cadena polipeptídica

Subunidades unidas

LAS PROTEÍNAS ADOPTAN DURANTE Y DESPUÉSDE SU BIOSÍNTESIS EN LOS RIBOSOMAS, LAESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL QUE LESPERMITE LLEVAR A CABO SU FUNCIÓN

PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS

PERMITE LLEVAR A CABO SU FUNCIÓNBIOLÓGICA ESPECÍFICA

El plegamiento de las proteínas es un evento muy rápidoy puede implicar un proceso en varias y puede implicar un proceso en varias etapas

¿CÓMO ADQUIEREN SU CONFORMACIÓN NATIVA LAS PROTEÍNAS?

LAS PROTEÍNAS SEPLIEGANRÁPIDAMENTE

(PARADOJA DELEVINTHAL)

PROTEÍNA c/aa 10010 c/conformación = 1077 años(100 aa) 10 conformaciones 10-13 s

MODELOS DEL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS

�Modelo jerarquizado

�Modelo del colapso espontáneo

�Modelo de plegamiento asistido por proteínas (chaperonas)

EL PLEGAMIENTO DE UNA PROTEÍNA PARTICULAR ES ELRESULTADO DESU SECUENCIA ÚNICA Y ESPECÍFICA DE AMINOÁCIDOSY ES INDISPENSABLE PARA SU FUNCIONALIDAD

Ha y Loh, 2012Chemistry 18 (26):7984

¿Cómo se determinó que para una función en particular se requiere un arreglo estructural específico?

LA PÉRDIDA DE LA ESTRUCTURA LA PÉRDIDA DE LA ESTRUCTURA CONDUCE A LA PÉRDIDA DE FUNCIÓN

LAS PROTEÍNAS SON MOLÉCULAS FLEXIBLESCAPACES DE ADOPTAR DIFERENTES CONFORMACIONES

Dominio amino carboxilo

Ha y Loh, 2012Chemistry 18 (26):7984

La funcionalidad de una proteína depende de un arreglo

estructural específico en un estructural específico en un ambiente celular particular

DÍA SOLEADOEntorno:TemperaturaHumedadPresión

NIÑOS CON

UN ENTORNO CELULAR IMPLICA UNA ESTRUCTURA PROTEICAESPECÍFICA

NIÑOS CONROPA LIGERA

CAMBIOS EN EL ENTORNOPUEDEN PROVOCARCAMBIOS EN LA ESTRUCTURA

LA FUNCIÓN DE UNA PROTEÍNA DEPENDEDE UN ARREGLO ESTRUCTURAL ESPECÍFICO

CUANDO LA PÉRDIDA DE LA ESTRUCTURA ES LO SUFICIENTE PARA CONDUCIR A LA PÉRDIDA DE SU FUNCIÓN

ESTADO CONOCIDO COMOESTADO CONOCIDO COMO

DESNATURALIZACIÓN

No necesariamente implica una pérdida total de la estructura o conformación de la proteína

Pérdida de la estructura nativa de una proteína=Desnaturalización.

Actividad biológica Conformación termodinámicamentemás estable.

Proteína en estado nativo

Proteína en estado desnaturalizado Sin actividad

Pérdida de la estructuraterciaria, y en las que la tienen, de la cuaternaria

AGENTES DESNATURALIZANTES:pH extremos, temperaturas extremas, altasFuerzas iónicas, detergentes

Agentes reductores de puentes disulfuro

AGENTES DESNATURALIZANTES:

•pH (rompe puentes de H y salinos)•TEMPERATURA (perturba puentes de H y salinos)•SOLVENTES (perturba interacciones hidrofóbicas)•ALTAS FUERZAS IÓNICAS (perturba puentes salinos, y de H)•DETERGENTES (perturba interacciones hidrofóbicas)

•AGENTES REDUCTORES DE GRUPOS S-S (reducen puentes disulfuro)

Todos ellos perturban las estructura secundaria, terciaria y cuaternariade las proteínas, pero nunca alteran la estructura primaria, ya que estosagentes sólo rompen interacciones no covalentes (excepto los agentesreductores de S-S)

ββββ−−−−mercaptoetanolditiotreitol

Pérdida de la estructura terciaria de una proteína. Desnaturali_zación.El caso de la Ribonucleasa (proteína que degrada al RNA)

Actividad biológica Conformación termodinámicamentemás estable.

40

95

110

58 65

92

26

Puentes disulfuro

Urea + β-MSH

65

9240Estado Pérdida de la estructura

Agentes reductores de S S 2 SH

Estado nativo

58

92

84

95110

40

26

95

110

58 65

92

26

-Urea - βMSH

Estado desnaturalizado

Puentesdisulfuro reducidos

Estado Re-naturalizado

Sin actividad

Pérdida de la estructuraterciaria, y en ciertos

casos, de la cuaternaria

40

La funcionalidad de las proteínas además derequerir un plegamiento específico, también puede depender de su interacción con otras moléculas

EVALUACIÓN 1Fecha de entrega: Domingo 9 de septiembre hasta las 23:59 hrs

Buscar la estructura de una proteína cuya función biológica resulte ser un blanco terapéutico

1. Datos básicos de identificación del trabajo2. Estructura de la proteína3. Descripción de la estructura4. Localización de la parte estructural implicada en la función5. Breve descripción de su función biológica5. Breve descripción de su función biológica6. Bibliografía

FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNASDE LAS PROTEÍNAS

PROTEÍNAS.- PUEDEN DESEMPEÑAR DIVERSAS FUNCIONES BIOLÓGICAS

a) Enzimas.- Actividad catalítica

b) Hormonas

c) Anticuerpos

d) Receptores en membranas

Reconocimiento específicode ligandos, sin transformarlo

d) Receptores en membranas

e) Unión de alguna especiepara transporte

f) Acarreadores en membranas:- reconocimiento, transporte y a menudo, actividad catalítica

g) Estructurales.- Andamios moleculares

de ligandos, sin transformarlo

CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE ACUERDO A SUNIVEL DE ESTRUCTURACIÓN:

PROTEÍNAS FIBROSAS.- Constan mayoritariamente de un único tipo deestructura secundaria (αααα-QUERATINA, COLÁGENO)

DAN SOPORTE, FORMA Y PROTECCIÓN EXTERNA

PROTEÍNAS GLOBULARES.- Contienen varios tipos de estructurasecundaria (MIOGLOBINA)

SON ENZIMAS Y PROTEÍNAS REGULADORASQUE TIENEN PATRONES DE PLEGAMIENTO MUY COMPLEJOS

PROTEÍNAS FIBROSAS

♣ CONFIEREN FUERZA Y/O ELASTICIDAD

♣ SU UNIDAD ESTRUCTURAL FUNDAMENTAL ES LA REPETICIÓN DE UNELEMENTO SIMPLE DE ESTRUCTURA SECUNDARIA

♣ SON INSOLUBLES EN AGUA (ELEVADO CONTENIDO DE aa HIDROFÓBICOS)

ESTRUCTURA CARACTERÍSTICAS EJEMPLOS

HÉLICE α Estructuras protectoras α-QUERATINA (cabello,insolubles y resistentes, plumas y uñas)de dureza y flexibilidadvariables

TRIPLE HÉLICE Elevada resistencia a la COLÁGENO (de lostensión, sin capacidad tendones, matrizde estiramiento ósea)

LA α-QUERATINA

= ENROLLAMIENTO EN SUPERHÉLICE(LEVÓGIRO)

RESIDUOS HIDROFÓBICOS

INTERACCIONES:Puentes de hidrógeno

Estructurasecundaria

Estructuracuaternaria

Puentes de hidrógenoHidrofóbicasPuentes disulfuro

Agente

EL PAPEL DE LOS AGENTES DESNATURALIZANTESDURANTE LA ONDULACIÓN PERMANENTE

Temperatura Ruptura de puentes de Hidrógeno

Agentereductor LAVADO

Agenteoxidante

EL COLÁGENO

Hélice αLEVÓGIRA(3 residuos por vuelta)

Gly-X-ProGly-Pro-4-HyP

SUPERENROLLAMIENTODEXTRÓGIRO(3 cadenas α)

GLICINA

PROTEÍNAS GLOBULARES

♣ LOS DIFERENTES SEGMENTOS DE UNA CADENA POLIPEPTÍCA SE PLIEGANUNOS SOBRE OTROS (TIENEN UNA FORMA COMPACTA)

♣ DIVERSIDAD ESTRUCTURAL

♣ TIENEN AMPLIA VARIEDAD FUNCIONAL

LA MIOGLOBINA

CARACTERÍSTICAS:Primer proteína cristalizadaEs fijadora de O2 de células musculares16700 (153 residuos) una sola cadena polipeptídicaUn grupo hemo o ferroprotoporfirina

Estructura terciaria

HEMO

Estructura terciaria

Leu, Ile, Val, Phe

Pro

EL GRUPO HEMO, UN GRUPO MUY VERSATIL

Protoporfirina

His 93

LA MIOGLOBINA

ACCESO RESTRINGIDONecesario para proteccióndel grupo HEMO

64

98

HEMOGLOBINA

Se localiza en los eritrocitos (glóbulos rojos sanguíneos)Su función es transportar oxígenoUne oxígeno

TIENE ESTRUCTURA CUATERNARIAEs tetramérica (Mr 64 500) tiene 4 grupos

prostéticos (gpos HEMO) unidos a cada una de las cadenas polipeptídicas

TIENE DOS CADENAS α Y DOS CADENAS β

Mioglobina Subunidad βde la Hemoglobina

LA HEMOGLOBINA CAMBIA SU ESTRUCTURA CUANDO UNE EL OXÍGENO

ES UNA PROTEÍNA ALOSTÉRICA (CAMBIA DE FORMA)

UNA FUNCIÓN IMPORTANTE QUE PUEDEN DESEMPEÑARLAS PROTEÍNAS ES LA CATÁLISIS DE LAS REACCIONESEN SISTEMAS BIOLÓGICOS:

ENZIMASENZIMAS

LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DEPENDEDE LA INTEGRIDAD DE SU CONFORMACIÓNPROTEICA NATIVA

ADEMÁS PUEDEN REQUERIR DE OTROS COMPONENTESQUÍMICOS ADICIONALESQUÍMICOS ADICIONALES

LOS ENZIMAS CATALIZAN REACCIONES DE MANERA EFICAZ Y ALTAMENTEESPECÍFICA

INTERACCIÓN PRECISA DEL ENZIMA-SUSTRATO

COMPLEJA ESTRUCTURACIÓN PROTEICA

ESPECIFICIDAD

¿CÓMO SON?

QUIMOTRIPSINA LIBRE

SITIO ACTIVO

ATAQUE NUCLEOFÍLICO SOBRE ELCARBONILO DEL ENLACE PEPTÍDICO

INTERMEDIARIO TETRAHEDRICODE VIDA CORTA

SITIO ACTIVO

LAS PROTEASAS O PROTEINASAS O PEPTIDASAS

ENZIMAS QUE ROMPEN ENLACES PEPTÍDICOS DE OTRAS PROTEÍNAS

SERIN-PROTEASAS ZINC-PROTEASAS ASPARTIL-PROTEASAS CISTEIN-PROTEASAS

ROMPEN EN SITIOS ESPECÍFICOS

PROTEASAS DE SERINA Tienen prácticamente el mismo mecanismo catalítico

Contienen la tríada catalítica: Ser, Asp, His

TRIPSINA rompe después de una Arginina o LisinaQUIMOTRIPSINA rompe después de un aminoácido con R hidrofóbico

SUBTILISINA rompe después de un aminoácido con un R pequeño no polar

MECANISMOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA

1.- CATÁLISIS ÁCIDO – BASE

2.- CATÁLISIS COVALENTE

3.- CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS

AMINOÁCIDOS IMPLICADOS EN CÁTALISIS ÁCIDO-BASE GENERAL

RESIDUO ÁCIDO GENERAL BASE GENERALDE AMINOÁCIDO (DADOR DE H+) (ACEPTOR DE H+)

CÁTALISIS COVALENTEAMINOÁCIDOS Y COFACTORES SIRVEN COMO NUCLEÓFILOS PARA FORMARENLACES COVALENTES TRANSITORIOS ENTRE EL ENZIMA Y EL SUSTRATO

ESTABILIZACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN EN LAS PROTEASAS DE SERINA

CARBOXIPEPTIDASA A

CATÁLISISEL MECANISMO ES CONCERTADO (VARIOS FENÓMENOS SIMULTÁNEOS)

Sitio activoo

Sitio catalítico

�Región tridimensional de la proteína

�Une al sustrato específicamente, mediante un reconocimiento estructural complementario

�Es una región pequeña comparada con la magnitudtotal de la proteína

�Es una hendidura en la estructura de la enzima, localizada más o menos superficialmente en el cuerpo de la enzima

CARACTERÍSTICAS DEL SITIO CATALÍTICO O SITIO ACTIVO

Sitio catalítico reconocimiento estructural complementario

�Contiene a los grupos catalíticos y a los cofactores, si los hay

�La interacción de éste, con el sustrato es no – covalente, por tanto, es reversible

�Es hidrofóbico, aunque puede tener a.a. polares y aún cargados

�Tiene capacidad de “orientar” al sustrato

LAS ENZIMAS PUEDEN REQUERIR DE COFACTORES PARA SU ACTIVIDAD

COFACTOR

Uno o varios ionesInorgánicos

Una molécula orgánicaPEQUEÑA SE LLAMA COENZIMA

UNIÓN FUERTE SE LLAMAGRUPO PROSTÉTICO

VITAMINA COENZIMA REACCIÓN EN LA QUE ESTÁ INVOLUCRADA

Tiamina (vitamina B1) Tiamina pirofosfato Activación y transferencia de aldehídos

Riboflavina (vitamina B2) Flavin mononucleótido o FMN; flavin adenin dinucleótido o FAD+,

Oxidación-reducción

Niacina Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD+; Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP+

Oxidación-reducción

LAS COENZIMAS SE DERIVAN DE LAS VITAMINAS

fosfato o NADP+

Ácido pantoténico Coenzima A Activación y transferencia de grupos acilo

Piridoxina Fosfato de piridoxal Reacciones que involucran la activación de aminoácidos

Biotina Biotina Activación y transferencia de CO2

Ácido lipoico Lipoamida Activación del grupo acilo:oxidación-reducción

Ácido fólico Tetrahidrofolato Activación y transferencia de grupos funcionales de un sólo carbono

Vitamina B12 Adenosil cobalamina; metil cobalamina

Isomerizaciones y transferencia de grupos metilo

ESTRUCTURA DE LAS COENZIMAS

ESTRUCTURA DE LAS COENZIMAS

Pirofosfato de tiamina

Biotina

Ácido ascórbico

Nomenclatura de las enzimas

b) Nombre sistemáticoa) Reacción que catalizab) Clase c) Subclase d) Número

Tipos de enzimas según la reacción que catalizan:

a) Nombre común: sustrato o producto + terminación asa

1) Oxidoreductasas.- Reacciones redox que involucran transferenciade electrones

2) Transferasas.- Reacciones de transferencia de grupos funcionales

3) Hidrolasas.- Reacciones de hidrólisis

4) Liasas.- Crean dobles enlaces

5) Isomerasas.- Reacciones de isomerización

6) Ligasas.- Formación de puentes con rompimiento de ATP

¿QUÉ HACEN?

LAS ENZIMAS MODIFICAN LAS VELOCIDADES DE REACCIÓN PERO NO LOSEQUILIBRIOS

LA ENERGÍA LIBRE (G) ES UNA FUNCIÓN TERMODINÁMICA QUE PERMITECOMPRENDER A LOS ENZIMAS

DOS CONSIDERACIONES DE UNA REACCIÓN:

1) La diferencia de energía libre (∆G) entre los productos y reactantes

2) La energía requerida para iniciar la conversión de los reactantes a productos2) La energía requerida para iniciar la conversión de los reactantes a productos

S PE

nerg

ía li

bre

Estado de transición

Coordenada de reacción(cambios químicos)

Energ

ía li

bre

Estadobasal

Estadobasal

DETERMINALAESPONTANEIDADDE LA REACCIÓN

EL ∆G ENTRE REACTANTES Y PRODUCTOS INDICA EL EQUILIBRIODE LA REACCIÓN

LOS ENZIMAS ACELERAN ESTE PASO¿CÓMO LO HACEN?

S PE

nerg

ía li

bre

Estado de transición S

Energía librede activación

MÁSLENTA

BARRERAENERGÉTICA

Coordenada de reacción(cambios químicos)

Energ

ía li

bre

Estadobasal

Estadobasal

Energíalibre

Energ

ía li

bre

Estado de transición S

LOS ENZIMAS FACILITAN LA FORMACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN

(Proporcionando una superficie complementaria a su estereoquímica, polaridado carga)

Coordenada de reacción(cambios químicos)

Energ

ía li

bre

Estadobasal

Estadobasal

Energíalibre

• Las enzimas disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, pero no modifican la constante de equilibrio

• Por tanto aceleran en igual proporción la velocidad de la reacción en las dos direcciones

AUMENTOS EN LA VELOCIDAD DE ENTRE5 A 17 ÓRDENES DE MAGNITUD

¿CÓMO FACILITAN LOS ENZIMAS LA DISMINUCIÓN DE LAENERGÍA LIBRE DE ACTIVACIÓN?

FAVORECER LA FORMACIÓN DE ESTADOS DE TRANSICIÓN:

1) A TRAVÉS DE LA FORMACIÓN DE ENLACES COVALENTESDURANTE LA CATÁLISIS(ENTRE SUSTRATOS Y LAS CADENAS LATERALES DE CIERTOSRESIDUOS DE AMINOÁCIDOS, IONES METÁLICOS Y COENZIMAS)

2) POR MEDIO DE INTERACCIONES NO COVALENTES ENTRE EL ENZIMAY EL SUSTRATO

ENERGÍA DE FIJACIÓNEs aquella energía proveniente de la interacción enzima-sustrato

ENERGÍA DE FIJACIÓN PERMITE:

LA ESPECIFICIDAD Y LA CATÁLISIS

LAS INTERACCIONES DÉBILES ESTÁN OPTIMIZADAS EN EL ESTADODE TRANSICIÓN

EL SITIO CATALÍTICO DE LOS ENZIMAS SON COMPLEMENTARIOS NOA LOS SUSTRATOS per se SINO A LOS ESTADOS DE TRANSICIÓN

MODELO DE LA LLAVE-CERRADURA

MODELO DEL AJUSTE INDUCIDOPostulado por Daniel Koshland en 1958

Disminución de los movimientos de los sustratos que reaccionanREDUCCCIÓN DE LA ENTROPÍA

La formación de enlaces débiles enzima-sustrato da lugar a la DESOLVATACIÓNDEL SUSTRATO (las interacciones reemplazan los puentes de hidrógenoque existan entre el sustrato y el agua en disolución)

CAMBIO CONFORMACIONAL del enzima cuando se fija el sustrato

FACTORES FÍSICOS O FISICOQUÍMICOS QUE PUEDEN AFECTAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

1. pH2. TEMPERATURA3. FUERZA IÓNICA4. CONSTANTE DIELÉCTRICA DEL MEDIO

Efecto de la temperatura en la actividad enzimática

Actividadde laenzima

Temperatura óptima

20º C 30º C 60ºC

Efecto del pH en la actividad enzimáticapH óptimo

ACTIVI

Tripsina Colinesterasa Pepsina Papaína

IDAD

8

pH8

pH2 4

pH5 8

pH

E + S ES E + P

Sitio activo

Sustrato

[Enzima-sustrato]

+

Producto

Sitio activo

Enzima

Sitio activo+Sitio activo

CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga deestudiar el mecanismo de una reacción catalizadaenzimáticamente.

OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción yevaluar como se ve modificada ésta enrespuesta a cambios en los parámetrosexperimentales

VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido oproducto formado por la enzima por unidad de tiempo

Por tanto sus unidades soncantidad de compuesto sobre unidad de tiempo:

moles µmoles

nmolesgramos

miligramosµgramos

hora

minuto

segundo

MOTIVOS, ESTRUCTURAS SUPERSECUNDARIAS YDOMINIOS.

UN MOTIVO SERÁ UNA ESTRUCTURA SECUNDARIA α héliceβ plegadagiro

UNA ESTRUCTURA SUPERSECUNDARIASerá un agregado de por lo menos dos motivos y puede tener combinaciones de α-hélices, β-plegadas y giros.de α-hélices, β-plegadas y giros.

Por ejemploαααα-hélice, giro, α-hélice

ββββ- plegada, giro, α- hélice, etc.

(intermediarios entre las estructura secundaria y terciaria)

UN DOMINIO SERÁ UN AGREGADO COMPACTO DE VARIAS SUPERESTRUCTURAS UNIDAS A OTRO POR UN SEGMENTO FLEXIBLE.

DOMINIO

ESTRUCTURA SUPERSECUNDARIA

GIRO

MOTIVO

IDENTIFICACIÓN DE MOTIVOS, ESTRUCTURA SECUNDARIA Y DOMINIOS EN UNAESTRUCTURA TERCIARIA