1

Eritrocitni enzimi

Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-

medicinska biohemijaŠkolska 2014/2015. godina

2

Sadržaj predavanja

Deficijencije sledećih enzima:• Glikolitički enzimi• Enzimi fosfoglukonatnog šanta• Enzimi ciklusa glutationa• Methemoglobin reduktaza• Enzimi antioksidativne zaštite

3

Metabolički procesi u eritrocitima

• Struktura i funkcija eritrocita• Energija je neophodna za:

– Održavanje gradijenta elektrolita– Održavanje hemoglobina u redukovanom obliku– Održavanje SH grupa enzima i membranskih proteina

4

Metabolički procesi u eritrocitima

• Izvori energije u eritrocitima1. Anaerobna faza glikolize ili Embden Meyerhof-ov put2. Heksoza monofosfatni put ili pentozni šant• Obezbeñuju ATP i redukcione ekvivalente NADPH i

NADH

5

6

• Životni vek eritrocita• 120 dana• Retikulociti• 2 dana u cirkulaciji• Sinteza proteina i enzima u

eritroblastima i retikulocitima

Deficijencije eritrocitnih enzima

• Deficijencija enzima remeti stvaranje energije i funkciju eritrocita

• Deficijencija može biti – Nasledna (najčešće)– Stečena deficijencija

• kod maligniteta kostne srži

• Nasledni defekti enzima dovode do 1. Poremećaja integriteta eritrocita2. Kraćeg životnog veka eritrocita3. Pojave nasledne nesferocitne hemolitičke anemije

Kliničke manifestacije– Hronična hemolitička anemija– Akutne epizode teške hemolize (deficijencija G6PDH)Zašto deficijencija ovih enzima samo u eritrocitima ?– Nemogućnost ponovne sinteze enzima u eritrocitima

7

8

Uzroci različitih vrsta anemija

9

Deficijencije enzima glikolize

• Heksokinaza• Glukoza-6-fosfat izomeraza• Fosfofruktokinaza• Aldolaza• Fosfoglicerat kinaza• Piruvat kinaza• Laktat dehidrogenaza

10

11

12

Piruvat kinaza

• Piruvat kinaza (PK; EC 2.7.1.40)• Katalizuje reakciju

PK

Fosfoenolpiruvat + ADP → Piruvat + ATP

• Regulatorna reakcija glikolize• Oslobaña se drugi molekul ATP• Piruvat kinaza → alosterna regulacija

– Aktivacija sa supstratom i FBP (fruktoza-1,6-difosfonat)

• Aktivnost zavisi od starosti eritrocita• Najveća aktivnost u mladim eritrocitima

13

Piruvat kinaza

• Homotetramerni enzim• Kod sisara postoje 4 izoenzima: PK-1, PK-2, PK-L i PK-R• PK-M1 u skeletnim mišićima, srcu i mozgu• PK-M2 u tkivu fetusa i kod odraslih: leukociti i trombociti

– PK-M1 i PK-M2 produkti jednog gena PKM2

– Alternativno isecanje

• PK-L u jetri • PK-R u eritrocitima• PK-L i PK-R su produkti jednog gena PKLR na hromozomu 1q21• PKLR se sastoji iz 12 egzona veličine 9,5 kB• PK-R monomer iz 574 aminokiselina, a PK-L od 531 aminokiselina

14

Distribucija izoenzima piruvat kinaze u raznim fazama sazrevanja eritrocita

• Bazofilni eritroblasti PK-M2 i PK-R• U toku sazrevanja PK-M2 se zamenjuje sa

PK-R• Proteolitičkom degradacijom iz

63 kDa PK-R subjedinice nastajuPK-R monomeri PK-R1 i PK-R2

15

Struktura piruvat kinaze

• Kristalna struktura enzima eritrocitne PK• Svaka subjedinica PK-R se sastoji iz 4 domena• N, A, B i C• Aktivno mesto je u procepu izmeñu • domena A i fleksibilnog domena B• Domen B rotira i stvara otvorenu i • zatvorenu formu• C domen vezuje FBP• Interakcija domena u alosternoj regulaciji• T-stanje slab afinitet• R-stanje visok afinitet

16

Deficijencija piruvat kinaze

• OMIM 266200• Deficijencija PK najčešći uzrok nesferocitne hemolitičke

anemije• Defekt u glikolizi• Autozomalno-recesivno oboljenje• Alelna frekvencija 2% kod bele populacije• Veća učestalost kod crnaca

• OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man• Baza podataka www.ncbi.nlm.nih.gov/omim• Katalog humanih gena i genetskih bolesti

17

Deficijencija piruvat kinaze

2 metaboličke abnormalnosti posledica su deficijencije PK:1. Smanjenje ATP2. Povećanje nivoa 2,3-DPG• Skraćen životni vek eritrocita• Metabolički poremećaji zrelih eritrocita kao i poremećaj

samog procesa sazrevanja PK-deficijentnih eritroidnih progenitora

• Neefektivna eritropoeza

18

Klinički simptomi

• PK-deficijentni pacijenti pokazuju varijabilne oblike hronične

hemolize sa varijabilnim kliničkim simptomima

• Oblici hemolitičke anemije kod deficijencije PK:

– Teške anemije sa smrtnim ishodom pri roñenju

– Teške anemije zavisne od transfuzije

– Umerene anemije sa manifestacijama hemolize pri infekcijama

– Dobro kompenzovana hemoliza bez anemija

• Lečenje deficijencije PK:

1. Splenotektomija je poželjna

2. Tretman transplantiranim matičnim ćelijama

3. Budućnost genska terapija ?

19

Mutacije PKLR gena

• Do danas je poznato 190 mutacija

• 70 % je missense mutacije na odreñenim delovima PK koje

menjaju strukturu i funkciju važnih domena

Najčešće missense mutacije su:

• C.1456C>T (p.Arg486Trp)

• C.1529G>A (p.Arg510Gln)

• C.994 G>A (p.Gly332Ser)

Nonsense mutacija

• C.721 G>T (p.Glu241X)

20

Deficijencija PK

• Odnos fenotip-genotip i korelacija sa deficijencijom PK

• PK-deficijentne individue su često heterozigoti za dve različite

missense mutacije

• Kod jednog pacijenta postoji čak 7 različitih tetramernih formi koje

se meñusobno razlikuju po svojim strukturnim i kinetičkim

svojstvima

• Deficijencija PK ima protektivni efekat naspram replikacije parazita

malarije u humanim eritrocitima

• Protektivni efekat je posledica redukovanih nivoa ATP u eritrocitima

PK-deficijentnih osoba

21

Raprostranjenost deficijencije piruvat kiinaze

22

Heksoza-monofosfatni put

• Značaj heksozamonofosfatnog metaboličkog puta u eritrocitima

• Oslobañanje NADPH neophodnog za održavanje redukovanog glutationa

23

Metabolizam glutationa

• Značaj heksozamonofosfatnog metaboličkog puta u eritrocitima

• Oslobañanje NADPH neophodnog za održavanje redukovanog glutationa

Glutation

24

Heksoza-monofosfatni put

Poremećaji vezani za deficijenciju sledećih enzima

1. Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza2. 6-Fosfoglukonat dehidrogenaza3. Transketolaza

• Eritrociti nemaju drugi put dobijanja NADPH i zato zavisi od aktivnosti prvog enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaze

25

Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza

• Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza (G6PD; EC 1.1.1.49)

• Prisutna u svim ćelijama i katalizuje prvu reakciju u heksoza-monofosfatnom putu

– konverzija glukoza-6-fosfata u 6-fosfoglukonolakton

– konverzija u 6-fosfoglukonat

– 1 mol NADPH se oslobaña u reakciji

26

Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza

• G6PD veća aktivnost u retikulocitima nego u zrelim eritrocitima• Homodimer sa subjedinicama od 59 kDa i 515 aminokiselina• Sniženje pH pomak od dimerne u tetramernu formu• Svaka subjedinica G6PD se sastoji iz dva domena• Važna uloga meñupovršine izmeñu dva monomera

– za stabilnost– za aktivnost– mesto vezivanja NADP je udaljeno od aktivnog centra i bliže jemeñupovršini

27

Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza• Gen za G6PD je na dugom kraku X-hromozoma (Xq28)

• Sastoji se iz 18 Kb i 13 egzona

• Egzon 1 je nekodirajući

• Primena u RT-PCR kao housekeeping gene

• Deficijencija G6PD OMIM305900

Učestalost

• Najučestalija enzimopatija

• Učestalost 400 miliona ljudi u svetu

Učestalost deficijencije u pojedinim regionima:

• Povećana učestalost u Africi, Srednjem Istoku i Južnoj Aziji

• Paralela u visokoj učestalosti deficijencije G6PDH i distribucije malarije ukazuje da ova deficijencija ima selektivne prednosti

• Prisustvo G6PD kod heterozigota m i homozigota ž pruža značajnu zaštitu od teške bolesti malarije

28

Veza malarije i deficijencije G6PD

Plasmodium falciparumMalarija i HbSSelektivno preživljavanje osoba sa HbS u regionima sa malarijom

Predpostavka da je isti Mehanizam i za deficijenciju G6PDSmanjen životni vek eritrocita

29

Distribucija malarije u svetu

30

Klasifikacija prema nivou enzimske aktivnosti i kliničkim manifestacijamaKlasa I• Teška deficijencija • Hronična nesferocitna hemolitička anemijaKlasa II • Teška deficijencija • Aktivnost < 10%• Bez hemolitičke anemijeKlasa III ili G6PD A -• Umerena ili blaga deficijencija• Rezidualna aktivnost 10-60 %Klasa IV• Vrlo blaga ili nema deficijencije G6PD A-Klasa V• Povećana aktivnost G6PD• Dosada je opisana samo jedna takva varijanta G6PD Hektoen

Klasifikacija deficijencija G6PD prema WHO

31

Genetske varijante G6PD

• Postoji 400 genetskih varijanti • 140 mutacija• Većina kodira substituciju jedne aminokiselina

1. Najpoznatija deficijentna varijanta je G6PD A-• Supstitucija Asn za Asp na kodonu 126• C.376A>G• Sekundarna mutacija je na poziciji 68 mutacija Val za Met

c202G>A

2. Druga poznata varijanta je G6PD Mediteran• Supstitucija Ser za Phe na kodonu 188• C.563C>T

3. G6PD Seattle (c.844G>C; p.Asp282His)4. G6PD Union (c.1360C>T; p.Arg454Cys)

32

Kliničke manifestacije deficijencije

5 simptoma1. Lekovima indukovana hemoliza2. Infekcijom indukovana hemoliza3. Favizam4. Neonatalna žutica5. Hronična nesferocitna hemolitička anemija

(CNSHA)

33

Klinički simptomi

• Najveći broj osoba sa deficijencijom G6PD su asimptomatske kroz ceo svoj život

• Akutna hemoliza se javlja samo u periodima povećanog oksidativnog stresa izazvanog infekcijom, upotrebom lekova ili boba (faves)

• Hemolitičke epizode

– anemija

– žutica

– povišen bilirubin

– LD povećana u plazmi i retikulocitima

• Mehanizam oksidativnog oštećenja i hemoliza

• Stariji eritrociti lakše podležu destrukciji

• Slaba retikulocitoza

34

Klinički simptomi

• Manifestacije samo kod muškaraca jer je gen vezan za X-hromozom

• Žene heterozigoti nosioci gena mogu pokazavati patofiziološki fenotip poput muškaraca hemizigota

Dete staro 4 godine sa deficijencijom G6PDSimptomi žutice

35

Uticaj fava beans kod osoba sa deficijencijom G6PD

Favizam

• Stari Grci su znali za favizam

• Favizam se može definisati kao hemolitički odgovor na konzumiranje boba (Faves)

• Sve osobe sa favizmom su G6PD deficijentne

• Sve osobe koje su deficijentne na G6PD ne pokazuju favizam

Primer

• Ispitivanja u Saudijskoj Arabiji gde je učestalost G6PD velika ne pokazuju simptome favizma

• Favizam je češći kod beba i dece

• Pretpostavka mehanizma nastanka favizma Hemoliza je izazvana divicinom, glukozidom prisutnim u bobu koji oslobaña slobodne radikale i dovodi do oksidativnog stresa

Vicia faba

36

Patofiziologija deficijencije G6PD

• G6PD/NADPH/glutation sistem ima protektivni efekat u eritrocitima• Osobe sa deficijencijom G6PD su u riziku za hemolitičku anemiju

zbog oksidativnog stresa

37

Patofiziologija deficijencije G6PD

• Kada je glutation utrošen enzimi i proteini (i hemoglobin) se razgrañuju sa oksidansima i dolazi do:

• Disbalansa elektrolita

• Stvaraju se ukrštene veze i depozicija proteina u membrani eritrocita

• Oštećene ćelije se fagocitiraju i udaljavaju iz cirkulacije u slezinu

• Hemoglobin se metaboliše do bilirubina što dovodi do žutice

• Eritrociti se retko razgrañuju u cirkulaciji, tako da se hemoglobin uglavnom izlučuje direktno putem bubrega što je slučaj u teškim slučajevima i dovodi do akutnog oštećenja bubrega

• Deficijencija G6PD povećava koncentraciju glukoze što pak povećava AGE uznapredovane produkte glikacije

• Deficijencija G6PD dovodi i do sniženja NADPH koji je neophodan za za sintezu NO

• Kod Afro-Karibljana visoka prevalence DM tip II i hipertenzija se vezuje i sa povećanom učestalošću deficijencije G6PD u ovim populacijama

38

Uticaj lekova kod osoba sa deficijencijom G6PD

• Antimalarici– Primakin, pamakin,hlorokin

• Sulfonamidi– Sulfametoksal, tiazolesulfon

• Metilen plavo, naftalen• Antibiotici bez S

– Izoniazid, nitrofuratoin

• Analgetici– Aspirin, fenazopiridin, acetaniilid

39

Dijagnoza deficijencije G6PD

• Na osnovu simptoma anemije, žutice i simptoma hemolize posle uzimanja lekova, favizma i pozitivne familijarne istorije

• Hematološke• Ukupan broj eritrocita• Retikulociti• Heinzova telašca se mogu videti

na razmazu krvi

• Biohemijske analize• Enzimi jetre koji ukazuju na žuticu• Bilirubin (nekojugovani-indirektni)• LD povećana u hemolizi i marker

težine hemolize• Haptoglobin snižen u hemolizi• Pregled urina (krv, urobilinogen)

40

Tretman pacijenata sa deficijencijom G6PD

• Prevencija uzimanja hrane i lekova• Vakcinacija na teške infektivne bolesti hepatitis A i B• U akutnoj fazi hemolize davanje transfuzija krvi i

dijaliza kod akutnog oštećenja bubrega• Eritrociti dobijeni transfuzijom imaju duži život• Kod nekih pacijenata uklanjanje slezine povoljno

deluje jer je to mesto destrukcije eritrocita

41

Sinteza i regeneracija glutationa kao dela γ -glutamilskog ciklusa

5-oksiprolinaze

γ -Glutamilciklotransferaze

γ -Glutamiltranspeptidaze

γ -Glutamilsintetaze

GSH-sintetazaProteaza

42

Metabolizam glutationa

• GSH je prisutan u visokoj

koncentraciji u eritrocitima

• GSH štiti hemoglobin i

druge proteine eritrocita

od oštećenja peroksidima

• Redukcija peroksida ili

oksidacija SH grupa

proteina stvara se GSSG

oksidovani glutation

43

Glutationski put

44

Enzimske deficijencije u metabolizmu glutationa

• γ-Glutamilcistein sintetaza

• Glutation sintaza

• Glutation reduktaza

• Glutation peroksidaza

• Deficijencije sem glutation peroksidaze dovode do blage nesferocitne hemolitičke anemije

• Slična deficijenciji G6PD

• Indukcija hemolitičkih kriza sa lekovima i infekcijama

45

Metabolizam purina i pirimidina

• 5’-nukleotidaza• Adenozin deaminaza• Adenilat kinaza

Redukcija methemoglobina• Citohrom b5 reduktaza

46

Detekcija naslednih enzimskih deficijencija eritrocita

Metode:• Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza• Metoda za piruvat kinazu• Metoda za glukoza-fosfat izomerazu• Metoda za glutation• Metoda za 5’nukleotidazu• Metoda za 2,3-difosfoglicerat u eritrocitima

47

Priprema eritrocita

• Uzimanje biološkog materijala sa antikoagulansom EDTA, ACD, heparin, CDP

• Izolacija eritrocita• Ispiranje eritrocita fiziološkim rastvorom 3x u odnosu

1:9• Centrifugiranje 3000 obrt/min• Pakovani eritrociti• Čuvanje pakovanih eritrocita u ACD rastvoru• Hemoliza eritrocita

– Hipotoničnim rastvorom– Zamrzavanjem i odmrzavanjem– Digitoninom za fragmentaciju eritrocitne membrane

48

Izražavanje aktivnosti eritrocitnih enzima

1. Preko sadržaja hemoglobina

U/gHb

Hemoglobin se odreñuje sa cijanmethemoglobinskim reagensom

2. Na broj eritrocita

U/1011 eritrocita

3. Na hematokrit

U/mL eritrocita

49

Dijagnoza deficijencije G6PD

1. Direktan antiglobinski test Coombsov test – mora biti negativan jer hemoliza u slučaju G6PD nije imunog porekla.

2. Direktan test dokaz deficijencije je Beutlerov test fluorescentnih mrlja

3. Odreñivanje aktivnosti G6PD4. DNK analiza

50

Detekcija deficijencije glukoza-6-fosfat dehidrogenaze

Beutlerov test fluorescentnih mrlja • Screening test• Jeftin i jednostavan test koji se zasniva na produkciji NADPH od

strane G6PD i njegovoj identifikaciji pod UV lampom.• Detektuje se fluorescencija NADPH• Kada nema fluorescencije test je pozitivan• On je lažno negativan kod osoba sa aktivnom hemolizom• On se radi 2-3 nedelje posle hemolitičke epizode• Niska aktivnost G6PD

– Mala količina NADPH nastaje i on se reoksidiše u NADP pomoću glutation reduktaze iz eritrocita

– Nema fluorescencije• Visoka aktivnost G6PD

– Prevazilazi se oksidacija NADPH sa glutation reduktazom – Akumulira se veća količina NADPH i javlja se fluorescencija

51

Metoda odreñivanja aktivnosti glukoza-6-fosfat dehidrogenaze

PrincipG6PD

Glukoza-6-fosfat + NADP ──→ 6-fosfoglukonat + NADPH• Supstrat glukoza-6-fosfat i NADP• Meri se porast apsorbancije na 340 nm

Referentne vrednosti• 8-14 U/g/Hb• Vrednosti zavise od starosti eritrocita• Kod hemolitičke anemije više je mladih eritrocita i veća je aktivnost

G6PD

52

Metoda odreñivanja aktivnosti piruvat kinaze

PrincipPK

Fosfoenolpiruvat + ADP → Piruvat + ATP LD

Piruvat + NADH → Laktat + NAD

• Meri se pad apsorbancije na 340 nm• Niska konc supstrata sa ili bez fruktoza-1,6-difosfonata

– Alosterni aktivator• PK varijante imaju atipične kinetike reakcija

– Visoka konc supstrata normalna aktivnost– Niska konc supstrata niska aktivnost

Referentne vrednosti• Visok supstrat: 9-16 U/g/Hb• Nizak supstrat: 1,7-6,8 U/gHb