cultivos invitro de plantas
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DEFINICIÓN
• Técnica mediante la cual un explante se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida
• El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados
• La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar
• Importante en la propagación de especies de interés agroforestal
• Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria
• Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de produccion.
APLICACIONES
• PRODUCCIÓN COMERCIAL• SANEAMIENTO DE CULTIVARES• CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA• OBTENCIÓN DE VARIACIÓN SOMACLONAL• RESCATE DE EMBRIONES• OBTENCIÓN DE HÍBRIDOS SOMÁTICOS• OBTENCIÓN DE HAPLOIDES• TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS
CLASES DE CULTIVOS
CULTIVO DE CÉLULAS CULTIVO DE TEJIDOS CULTIVOS DE
ÓRGANOS
PLASTICIDAD
TOTIPOTENCIALIDAD
• Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa
• Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado
TERMINOLOGÍA Y TÉCNICAS1. EXPLANTEPorción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo
2. ESTERILIZACIÓNprocedimiento para la eliminación de microorganismos
3.AUTOCLAVE: Aparato en el que el medio, material de vidrio, instrumental, etc., Es esterilizado por vapor bajo presión (121ºc, 15 psi, 10-20 min)
REQUERIMIENTOS DE ASEPSIA
DESINFECCIÓN DE SUPERFICIE DEL EXPLANTO:
Generalmente usando HIPOCLORITO COMERCIAL diluido para evitar el desarrollo de microorganismos
CABINA DE FLUJO LAMINAR: Área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril
CÁMARAS DE CULTIVO
• Es un receptáculo diseñado para permitir el control de algunas variables del ambiente físico
• Habitualmente se pueden controlar la temperatura, la iluminación y el fotoperíodo y en algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire y su composición
Control de la temperatura
• La Temperatura Se Afecta Por La Temperatura Ambiente De La Sala Donde Se Sitúe Y El Calor Generado Por Las Fuentes De Luz De Que Dispone
• El control de la temperatura se efectúa mediante un sistema de
refrigeración-calefacción controlado a través termostato
• Subcultivo: pasaje de células, tejidos, órganos, etc. Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco
• Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas
• Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones
• Adventicios: Desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, Flores, etc.) O embriones (embryo-like structures) Desde puntos de origen No usuales, incluyendo Callos
CULTIVOS in vitro
• CULTIVOS DIFERENCIADOS ( RAÍCES, TALLOS, EMBRIONES, RAÍCES Y TALLOS TRANSFORMADOS)
• CULTIVOS INDIFERENCIADOS ( CALLOS, SUSPENSIONES)
• Mezcla de sustancias en las que las células, tejidos y órganos pueden crecer y desarrollarse
• Sustancias inorgánicas, como: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I
• Suplementos orgánicos complejos, como: leche de coco, extracto de levadura
• Reguladores de crecimiento (hormonas)
• Fuente de carbono (sacarosa) ya que no son completamente autotróficas
• Con o sin agar (medio semi -sólido o líquido)
• Sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir in vitro e in vivo.
Mezclas de sustancias poco definidas:Extracto de levaduraLeche de cocoExtractos vegetalesHidrolizados de caseínaPeptona y triptona
FeZnB
MnCuNiCoAlMo
I
NPKCaMgS
Azúcares AminoácidosAuxinasCitoquininasGiberelinasAcido abcísico
elementos
MicroMacro Sustancias orgánicas
Agua
Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos vegetales
• El medio MS, o Murashige y Skoog (1962), es el mas usado, particularmente si el objetivo es regenerar plantas
• El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo de células y protoplastos, y también es utilizado eficazmente en regeneración de plantas
FORMACIÓN DE TALLOS, RAÍCES, FLORES, ETC.
Explanto
Organogénesis
Formación de tallos Formación de raíces
Enraizamiento Tallos
Planta completa
REGULADORES DE CRECIMIENTO
HORMONAS/ FITOHORMONAS
AUXINAS: GRUPO DE HORMONAS VEGETALES (NATURALES O SINTÉTICAS) QUE INDUCEN LA ELONGACIÓN, O EN ALGUNOS CASOS LA DIVISIÓN CELULARFRECUENTEMENTE INDUCEN RAÍCES ADVENTICIAS E INHIBEN LA FORMACIÓN DE TALLOS ADVENTICIOS
CITOKININAS: GRUPO DE HORMONAS VEGETALES (NATURALES O SINTÉTICAS) QUE INDUCEN DIVISIÓN CELULAR Y FRECUENTEMENTE TALLOS ADVENTICIOS Y EN MUCHOS CASOS INHIBEN LA FORMACIÓN DE RAÍCES ADVENTICIAS
REGLAS GENERALES PARA LA ACCIÓN HORMONAL:
• AUXINA : CYTOKININA = ~1 CALLO• AUXINA : CYTOKININA < 1 TALLO• AUXINA : CYTOKININA > 1 RAÍCES
CULTIVOS INDIFERENCIADOS
CALLOS
• En medio sólido, crecimiento lento, gran heterogeneidad celular• Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados), en división activa• Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas
CULTIVOS EN SUSPENSIÓN
• Derivan de los anteriores, en medio líquido de composición adecuada, crecimiento más rápido y homogéneo
• Composición del medio de cultivo. Fuente de carbono, minerales, vitaminas, fitohormonas (auxinas, citoquininas)
EMBRIOGENESIS
Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula o huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de células somáticas (embriogénesis somática)
PROCEDIMIENTO PARA LA REGENERACIÓN VÍA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
1. INICIACIÓN: • CALLOS EMBRIOGÉNICOS
2. PROLIFERACIÓN: • CALLOS EMBRIOGÉNICOS, MASAS PROEMBRIOGÉNICAS (PEM)
3. DESARROLLO Y MADURACIÓN DE EMBRIONES: • EMBRIONES
4. GERMINACIÓN DE EMBRIONES (REGENERACIÓN)ESTADÍOS DE DESARROLLO EN DICOTILEDÓNEAS:• MASAS PROEMBRIOGÉNICAS• ESTADÍO GLOBULAR• TORPEDO• EMBRIÓN SOMÁTICO
MICROPROPAGACIÓN
Es el proceso de multiplicar plantas in vitro, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descedencia uniforme en condiciones de asepsia.
Este proceso incluye varias fases:FASE 0 : Preparacion de la planta madre FASE I : Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia FASE II : Multiplicación de brotes FASE III : Enraizamiento FASE IV: Aclimatación
CULTIVO DE MERISTEMOS
Es un método efectivo para la eliminación de infecciones virales y es el material preferido para la conservación de germoplasma
La razón principal por la cual las células meristemáticas son indemnes a los virus es que el meristemo carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van contaminando a la planta
Existen otros factores: • El meristemo apical tiene una mayor
velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no alcanza" al meristemo
• En una célula meristemática el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas, debido a que estás células tienen un código de trabajo muy definido